PLoS ONE: nedregulering af Ja Associated Protein 1 Expression Reducerer Cell Proliferation og Clonogenicity af kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

Hippo vej regulerer orgel størrelse ved at hæmme celledeling og fremme celleapoptose af dets aktivering. The Yes Associated Protein 1 (YAP1) er en nuklear effektor af Hippo sti, der fremmer cellevækst som en transskription co-aktivator. I human cancer blev YAP1 genet rapporteret som forstærkes og over-udtrykt i flere tumortyper.

Metoder

immunhistokemisk farvning af YAP1 protein blev anvendt til at vurdere ekspressionen af ​​YAP1 i pancreas tumorvæv . siRNA oligonukleotider blev anvendt til at knockdown ekspression af YAP1 og deres virkninger på bugspytkirtelkræftceller blev undersøgt ved hjælp af celleproliferation, apoptose, og forankringsuafhængige vækst assays. The Wilcoxon signed-rank, Pearson korrelationskoefficienten, Kendall s Tau, Spearman Rho, og en uafhængig to stikprøver

t

(to-halet) testen blev anvendt til bestemmelse af den statistiske signifikans af dataene.

Resultater

Immunhistokemi studier i pancreas tumorvæv afsløret YAP1 farvningsintensiteter var moderat til stærk i kernen og cytoplasmaet af tumorcellerne, mens den tilstødende normale epitel sig negativt til svag farvning. I dyrkede celler, blev YAP1 ekspression og lokalisering moduleret af celledensitet. YAP1 samlede proteinekspression steget i de nukleare fraktioner i BxPC-3 og PANC-1, mens det faldt i HPDE6 som celletæthed forøges. Derudover behandling af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer, BxPC-3 og PANC-1, med YAP1-målretning siRNA oligonukleotider betydeligt reduceret deres proliferation

in vitro

. Desuden behandling med YAP1 siRNA oligonukleotider formindsket forankringsuafhængig vækst på blød agar af bugspytkirtelkræftceller, hvilket tyder på en rolle YAP1 i bugspytkirtelkræft tumorigenese.

Konklusioner

YAP1 er overudtrykt i bugspytkirtelkræft væv og potentielt spiller en vigtig rolle i clonogenicity og vækst af bugspytkirtelkræftceller

Henvisning:. Diep CH, Zucker KM, Hostetter G, Watanabe A, Hu C, Munoz RM, et al. (2012) nedregulering af Ja Associated Protein 1 Expression Reducerer Cell Proliferation og Clonogenicity af kræft i bugspytkirtlen celler. PLoS ONE 7 (3): e32783. doi: 10,1371 /journal.pone.0032783

Redaktør: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, USA

Modtaget: Juni 1, 2011; Accepteret: 2 februar, 2012; Udgivet: 1. marts 2012 |

Copyright: © 2012 Diep et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af National Foundation for Cancer Research, Katz familien, og Helios Scholars Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Som en af ​​de mest dødelige former for human sygdom, kræft i bugspytkirtlen har en etårig og fem-års overlevelse på 26% og 6%, henholdsvis [1]. Der eksisterer et kritisk behov for hidtil ukendte behandlingsstrategier at give en målrettet virkning på overlevelsen af ​​patienter med kræft i bugspytkirtlen.

Hippo pathway regulerer organstørrelse ved at inhibere celleproliferation og fremmer celle apoptose [2], [3] . Komponenter i Hippo pathway blev identificeret i genetiske mosaik skærme i

Drosophila

, der består af Hippo (HPO) kinase, Salvador (Sav) adapter protein, WTS protein kinase, den Mats adapter protein, og Yorkie (Yki) nuklear transcriptional co-aktivator. Ved baneaktivering, HPO og Sav phosphorylerer og aktiverer WTS sammen med Mats. WTS phosphorylerer Yki at inaktivere og fastholde det i cytoplasmaet. I pattedyr er komponenterne i Hippo reaktionsvejen stærkt konserverede homologer, som omfatter MST1 /2 (HPO), WW45 (Sav), LATS1 /2 (WTS), MOB1 (Mats), og YAP1 (Yki) [4] – [ ,,,0],8].

i lighed med

Drosophila

model, pattedyr Hippo kernekomponenter danner protein kinase komplekser, der handler i en kaskade til phosphorylering YAP1 (også kendt som YAP eller YAP65), og flytter den til den cytoplasma [6], [7], [9], [10]. Da størstedelen nedstrøms mål af Hippo vej, YAP1 er et paradoks. Som et onkogen, er forstærkningen af ​​YAP1 gen locus ved 11q22 findes i flere kræfttyper, herunder hepatocellulær carcinom, brystcancer, orale pladecellecarcinomer, medulloblastomer, og esophageale pladecellecarcinomer [11] – [15]. Desuden har overekspression af YAP1 protein og dets kernelokalisering blevet bemærket i colon, lever, lunge, ovarie, og prostatacancer [6], [12], [16]. Overholtzer og kolleger rapporterede, at overekspression af YAP1 i en immortaliseret epitelcellelinie MCF10A resulterede i oncogen transformation [11]. I modsætning hertil blev YAP1 sig også at stabilisere og forbedre p73-afhængig apoptotisk celledød under cisplatin-induceret DNA-beskadigelse [17]. AKT, spiller en nøglerolle i flere cellulære overlevelse veje, har vist sig at phosphorylere YAP1 for at undertrykke pro-apoptotisk genekspression [18]. I en undergruppe af brystcancer blev YAP1 proteinekspression faldt betydeligt på grund af tab af heterozygositet og shRNA knockdown af YAP1 øget migration, invasiv og øget tumorvækst [19]. Samlet set disse resultater tyder på, at YAP1 udtryk og rolle i kræft kan være celletype og /eller cellulær kontekst afhængige.

I denne undersøgelse, vi søgte at belyse den rolle, YAP1 i bugspytkirtelkræft. Vi undersøgte YAP1 proteinekspression og lokalisering i pancreas tumorvæv taget fra patienter med kræft i bugspytkirtlen og undersøgt de fænotypiske effekter af YAP1 nedregulering i dyrkede pancreatiske cellelinjer. Vi har bestemt, at YAP1 er overudtrykt i pancreas tumorvæv, og nedregulering af YAP1 aftaget spredning og clonogenicity af dyrkede bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og metoder

Cell Culture

pancreas cancercellelinier aspC-1, BxPC-3, Capan-1, CFPAC-1, HPAF-II, Hs 766T, MIA Paca-2, og Panc-1 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Cellelinjerne blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gemini Bio-Products, Woodland, CA), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mg /ml) (Invitrogen). Den immortaliserede humane pancreas ductal epithelial cellelinie, HPDE6, blev tilvejebragt af Dr. MS Tsao (University of Toronto, Canada) og dyrket i keratinocyt-serumfrit medium suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse (30 pg /ml) og epidermal vækstfaktor (0,2 ng /ml) (Invitrogen) [20], [21]. Den immortaliserede humane pancreas ductal epithelial cellelinie, hTERT-HPNE, blev opnået fra ATCC og dyrket i DMEM-medium suppleret med 20% FBS [22]. Alle celler blev rutinemæssigt dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2. Cellelinie identiteter blev verificeret som tidligere beskrevet [23].

Tissue Microarray og Immunhistokemi (IHC)

Et væv microarray (TMA) blev konstrueret fra paraffinindlejrede blokke af 66 unikke tilfælde af pancreas duktale adenokarcinomer, 5 tilfælde af kronisk betændelse i bugspytkirtlen, og 6 normale bugspytkirtel prøver som tidligere beskrevet [24]. For hver kræft tilfælde blev to tumor kerner og en tilstødende normal kerne huller til TMA. TMA blokke blev snittet på 5 um tykkelse, overføres af vand flotation og tørret natten over ved stuetemperatur. Glassene blev afvokset, rehydreret og antigen hentes online på BondMax ™ autostaineren (Leica Microsystems, Inc Bannockburn, IL). Alle objektglas blev udsat for varme epitopgenfinding anvendelse af en EDTA baseret Retrieval Solution (Leica Microsystems) i 20 minutter. Endogen peroxidase og biotin blev blokeret. TMA snit blev inkuberet i 30 minutter ved 1:125 med YAP1 (H-125) antistof fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Snittene blev visualiseret ved anvendelse af Bond ™ Polymer Tilpas Detection kit (Leica Microsystems) ved anvendelse diaminobenzidin kromogen som substrat og bedømt som tidligere beskrevet [24]. The Wilcoxon-test blev anvendt til sammenligning af niveauet af YAP1 ekspression mellem tumoren og tilstødende normale prøver. Wilcoxon rank-sum test blev anvendt til sammenligning af YAP1 ekspression mellem tumor og pancreatitis samt normale bugspytkirtel prøver fra en separat gruppe af forsøgspersoner. Den Pearsons korrelationskoefficient blev anvendt til at estimere og teste associationen mellem nukleare YAP1 ekspression og histopatologiske parametre (tumorklassificering, stadium, og sygdom i regionale lymfeknuder), og følsomhed analyse blev udført under anvendelse af Kendall tau og Spearmans rho.

YAP1 Immunoblotting Analyse

for at opnå den nødvendige celletæthed efter 48 timers vækst, BxPC-3, PANC-1, og HPDE6 celler blev podet på følgende måde i T175 cm

2 kolber i fuldstændig vækstmedier: to millioner celler i 20-30%, fire millioner celler til 50-70%, og syv millioner celler til 100%. Cellerne blev vasket med DPBS, trypsinbehandlet, og derefter talt på Cellometer Auto T4 (Nexcelcom Biosciences, Lawrence, MA). Fire millioner celler blev anvendt til sub-cellulær fraktionering under anvendelse af BioVision Nuclear /Cytosoliske Fraktionering Kit (Mountain View, CA) ved at følge fabrikantens protokol. For at generere helcellelysater en million celler blev lyseret i RIPA-puffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) med 1X protease og phosphatase inhibitor cocktail (Roche) og inkuberet i is i 30 minutter. Ekstrakterne blev centrifugeret ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) protein-assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). I alt 20 ug protein per bane blev adskilt ved 4-12% NuPAGE Bis-Tris-gelelektroforese (Invitrogen). Blottene blev inkuberet med enten et Phospho-YAP1 (Ser127) antistof (Cell Signaling) ved 1:2000 fortynding eller i alt YAP1 (H-125) antistof (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) ved 1:2000 fortynding natten over ved 4 ° C og derefter udsat for anti-kanin IgG HRP-bundet antistof (Cell Signaling) ved 1:3000 fortynding ved stuetemperatur i 1 time. PARP (Cell Signaling) ved 1:2000 fortynding tjente som ladningskontrol for den nukleare fraktion, mens α-tubulin (Cell Signaling) ved 1:2000 fortynding tjente som kontrol for hele cellelysater og cytosolisk fraktion.

siRNA behandling og celleproliferationsassays Salg

YAP1 ekspression silencing blev opnået med to YAP1 siRNA duplex oligonukleotider målrettet mod to forskellige regioner i YAP1 transkript (Qiagen, Valencia, CA) ved en slutkoncentration på 20 nm ved siLentfect transfektion reagens (Bio-Rad) ifølge fabrikantens protokol. De siRNA’er blev revers-transficeret ved inkubering af siRNA’er i 10 pi serumfrit RPMI 1640 celledyrkningsmedier (Invitrogen) indeholdende 50 pi af blandingen siLentfect lipid reagens (Bio-Rad) per brønd og klædt i plader med 96 brønde. Den siRNAs og transfektionsreagens fik lov til at inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter. Bagefter blev cellerne udpladet til siRNA-transfektionsreagens mix på 4800 celler /brønd og serum-suppleret ved en slutkoncentration på 5% for BxPC-3 og 2% for PANC-1. På HPDE6 cellelinie, 6000 celler /brønd blev udpladet til siRNA-transfektionsreagens mix i keratinocyt medium. Pladerne blev opbevaret i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2. Efter 24 timer blev transfektion mediet fjernet fra hver brønd og erstattet med frisk serum-suppleret vækstmedie. Cellelevedygtighed blev bestemt ved tilsætning af 100 pi af CellTiter-Glo Luminescent Assay (Promega, Madison, WI) til hver brønd. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i en time, og luminescens blev optaget med Synergy HT mikropladelæser (BioTek, Winooski, VT).

Apoptose og cellecyklus analyse

transfektion af YAP1 siRNAs ind i de pancreatiske cellelinjer var som beskrevet i celleproliferationen studier ovenfor. Seksoghalvfems timer efter indledende transfektion blev caspase-3 og -7 aktiviteter bestemt ved tilsætning af 100 pi af Caspase-Glo 3/7 assay (Promega) til hver brønd. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i en time, og luminescensen blev optaget med Synergy HT mikropladelæser (BioTek). Den caspase aktivitet i celler behandlet med siRNA blev normaliseret til at cellernes Kun kontrol.

Cell cyklus analyse af YAP1 siRNA behandlet pancreas cellelinjer blev som tidligere beskrevet [23].

Anchorage- uafhængige assays

i 6-brønds plader, 250.000 celler (BxPC-3 og Panc-1) blev revers transficeret med 20 nM af YAP1 siRNA’er (Qiagen) i 48 timer (og 72 timer for proteinekstraktion og immunoblot analyse). Celler blev vasket med DPBS, trypsinbehandlet og talt ved trypan blå-udelukkelse. Seks tusinde levedygtige BxPC-3-celler og 3.000 levedygtige PANC-1-celler blev blandet med 1 ml vækstmedier og 0,3% agar og derefter lagdelt på 0,5% agar senge i 35 mm grid retter. Celler lodes vokse i 21 dage og hele området af skålen blev talt. Kolonier større end 50 celler blev talt som positive for transformation. Assays blev udført tredobbelt.

Celler overs fra transfektion blev holdt for RNA og protein ekstraktion. Til RNA-ekstraktion blev RNeasy Mini Kit (Qiagen) anvendt ifølge producentens anbefalede protokol. Et mikrogram af total RNA blev anvendt i en 20 pi cDNA-syntesereaktionen (Quantas Biosciences, Gaithersburg, MD). Reaktioner blev udført i 1 pi cDNA-reaktionsblandingen, 10 pi SYBR Green /Taq Polymerase Master Mix (Roche, Indianapolis, IN), 4 pi primere (YAP1, 5′-GCCATTAAAGGCAGCTGTTC-3 ‘og 5’-AGCACTGTGCCAGGTATCAC- 3 ‘; GAPDH, 5′-ATTGCCCTCAACGACCACTT-3′ og 5’-GGTCCACCACCCTGTTGC-3 ‘, i en slutkoncentration 400 nM), og 5 pi vand til et endeligt volumen på 20 pi. Bio-Rad MyIQ enkelt farve real-time PCR detection system (Hercules, CA) blev anvendt til at udføre RT-PCR. Totrins amplifikation (95 ° C i 30 sekunder og 58 ° C i 30 sek) blev gentaget i 40 cykler. Efter PCR reaktionen blev en smeltekurveanalyse udført (60 ° C i 5 sek) i 35 cykler. Dataene blev analyseret under anvendelse af komparativ C

T-metoden [25]. Analyse af helcellelysat proteinniveau ekspression af YAP1 blev som tidligere beskrevet, med den undtagelse, at siRNA-behandling var i 72 timer.

Resultater Salg

YAP1 overudtrykkes i pancreatiske ductale adenocarcinomer (PDA )

for at evaluere udtrykket niveau YAP1 protein i PDA væv, vi udført immunfarvning ved hjælp af et væv microarray (TMA). Blandt de 66 PDA sager i TMA, 64 var evaluerbare for tumor farvning, hvoraf 33 havde matchende normale epitel. Den YAP1 antistof viste både nuklear og cytoplasmatisk farvning, hvilket er i overensstemmelse med den kendte cellulære funktion af YAP1 protein – YAP1 er lokaliseret i cytoplasmaet, når det er inaktiveret, og det translokeres i nucleus, når den aktiveres. Vi vurderede farvning intensitet for både nukleare og cytoplasmatisk YAP1 og sammenfattet de scorer i tabel 1. Ca. 77% (49/64) af PDA sager var positive (scorede 1+ eller højere) nukleare YAP1 farvning i tumorceller, 63% ( 31/49) heraf havde moderat (2+) eller stærk (3+) farvning. I modsætning hertil kun 48% (16/33) af tilfældene havde positiv farvning i det tilstødende normale epitel, med kun 18% (6/33) havde moderat eller stærk farvning. På den anden side, de farvningsintensiteter i cytoplasmaet er sammenlignelige mellem tumoren og tilstødende normale væv, hvor 56% (36/64) af tilfældene havde 2+ eller højere farvning i tumoren og 43% (14/33) havde 2+ eller højere farvning i det tilstødende normale epitel. Analyse af tumor sager med matchende tilgrænsende normale væv under anvendelse af Wilcoxon-test viste også signifikant højere ekspression i tumorcellerne sammenlignet med tilstødende normale duktale celler med en p-værdi på 0,0002. Men vigtigere, forskellen i YAP1 proteinniveauet mellem tumor og det tilstødende normale epitel er mere væsentlig i kernen (p-værdi = 0,0007) end i cytoplasmaet (p-værdi = 0,027), hvilket indikerer, at YAP1 ikke kun overudtrykt i PDA men det er også stærkt aktiveret.

Figur 1 viser eksempler på forskellen YAP1 farvning i PDA, tilstødende normale væv, og normal bugspytkirtel. I nogle normale bugspytkirtel og pancreatitis væv observerede vi moderat til stærk YAP1 farvning i de acinære celler og små kanaler (figur 1C). Ikke desto mindre, den overordnede udtryk YAP1 i tumoren er betydeligt højere end i de normale bugspytkirtlen og pancreatitis tilfælde (p-værdi = 0,011).

A) Negativ til svag cytoplasmatisk farvning i normal duktalt epitel (hvide pile) . B) Moderat farvning (overvejende cytoplasmatisk) i normale kanaler støder op til tumor (hvide pile). C) Moderat til stærk farvning i en normal centroacinar og små duktale celler (hvide pile); D) svag farvning i en duktalt adenokarcinom (sorte pile); E) Stærk farvning i et godt differentieret ductal adenocarcinom (sorte pile); og F) stærk farvning (for det meste nukleare) i et dårligt differentieret duktalt adenokarcinom (sorte pile).

Næste, vi korreleret den aktiverede nukleare YAP1 udtryk niveau med histopatologiske parametre hos patienter med kræft i bugspytkirtlen. Som vist i tabel 2, er der ingen sammenhæng mellem nuklear YAP1 ekspression og tumorklassificering eller residual sygdom i regionale lymfeknuder, men der eksisterer en marginalt signifikant korrelation (r = 0,33 og p-værdi = 0,068 i Pearson korrelationskoefficienten analyse) mellem nuklear YAP1 niveau og tumor fase.

Vi undersøger også ekspressionsniveauet for YAP1 i et panel af otte human pancreascancer og to immortaliserede normale humane pancreatiske epiteliale cellelinjer under anvendelse Western blotting (figur 2A). Seks bugspytkirtelkræft cellelinier (BxPC-3, CFPAC-1, HPAF-II, Hs 766T, MIA Paca-2, og Panc-1) udviste høj til moderat protein niveauer af YAP1. To bugspytkirtelkræft cellelinier (ASPC-1 og Capan-1) havde målbart lave YAP1 protein niveauer, hhv. De to udødeliggjort pancreas cellelinier (HPDE6 og hTERT-HPNE) havde lav til moderat YAP1 proteinekspression. Denne ekspressionsprofil af YAP1 i pancreas cellelinier er i overensstemmelse med, hvad vi har observeret i de Langerhanske tumor vævsprøver (tabel 1).

A) Western blotting-analyse af YAP1 proteinekspression i et panel af otte bugspytkirtelkræft og to immortaliserede (ikke-transformerede) pancreatiske cellelinjer. B-E) immunhistokemisk farvning for YAP1 i bugspytkirtelkræft xenotransplantater: B) AsPC-1; C) BxPC-3; D) MIA PaCa-2; og E) PANC-1.

Yderligere undersøgelse af YAP1 udtryk i xenotransplantattumorer dannet af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer viste også lignende resultater. Figur 2 viser forskellen farvning og lokalisering af YAP1 i xenotransplantattumorer af fire bugspytkirtelkræft cellelinjer hjælp immunhistokemi. AspC-1 tumor havde meget lav farvning af YAP1 og var begrænset til cytoplasmaet (figur 2B), hvilket er i overensstemmelse med de Western blotting-resultater (figur 2A). BxPC-3 og MIA PaCa-2, som havde moderat til høj proteinekspression af YAP1 ved Western blotting (figur 2A), viste moderat til stærk immunofarvning i cytoplasmaet og moderat (undertiden stærk) farvning i kerner (2C og 2D, henholdsvis ). PANC-1 havde lignende YAP1 proteinekspression med intens farvning af cytoplasmaet med lav til moderat farvning af cellekerner (Figur 2E).

Udtrykket og lokalisering af YAP1 reguleres af celledensitet

det er blevet rapporteret, at øget celledensitet kan resultere i aktiveringen af ​​Hippo pathway og efterfølgende sekvestrering af YAP1 i cytoplasmaet [6]. Vi antager, at en sådan regulering af YAP1 lokalisering af celledensitet i bugspytkirtelkræftceller mindskes. For at udforske denne hypotese, vurderede vi ekspressionsniveauet og lokalisering af YAP1 ved varierende celledensiteter ved subcellulær protein fraktionering og immunblotting.

Som vist i figur 3, ved lavere celletætheder (20-70%), den YAP1 protein var til stede i både cytoplasmaet og kernen i de to pancreatiske cancercellelinjer, BxPC-3, og PANC-1, hvorimod i den immortaliserede normal pancreas ductal epitelcellelinje, HPDE6, YAP1 ikke var påviselig i den cytosoliske fraktion. Når celler blev 100% konfluente, den relative nuklear YAP1 proteinniveau (med nukleare YAP1 mod totalt YAP1) steg i BxPC-3 og PANC-1, men ikke i HPDE6 (fig S1). Skønt de cytosoliske YAP1 protein stiger som cellerne bliver konfluente i alle tre cellelinier, stigningen i HPDE6 er den mest betydningsfulde. Dette indikerer, at relativt flere YAP1 forblive aktiveret (phosphoryleret) i kræftceller end i udødeliggjort normal HPDE6 cellelinie, når celler bliver sammenflydende. Niveauet af phospho-YAP1 (p-YAP1) protein, der kun påvises i helcellelysat og den cytosoliske fraktion i cellelinierne, bekræfter også forskellene i YAP1 cellulære lokalisering mellem cancercellelinier og HPDE6. p-YAP1 blev ikke påvist i den cytosoliske fraktion af lav sammenflydende HPDE6 celler, og der var en dramatisk stigning, når cellerne blev 100% sammenflydende. I cancercellerne, på den anden side, p-YAP1 er til stede i lave celletætheder og stigninger som cellerne bliver mere sammenflydende. Disse resultater indikerer, at YAP1 ekspression og lokalisering ikke er så stramt reguleret af celledensitet i cancerceller som i de normale celler, hvilket antyder, at YAP1 funktion kan dysreguleret i bugspytkirtelkræftceller.

Som stigninger celledensitet pancreas cancer cellelinjer, BxPC-3 og PANC-1, reaktion på deaktivering af YAP1 som transskription cofaktor ved cytosolisk binding er mindre omfattende end HPDE6. Celler blev ekstraheret på at øge celledensiteter efter 48 timers indledende podning. PARP tjener som ladningskontrol for den nukleare fraktion. α-tubulin tjener som lastning kontrol for hele cellelysater og cytosol fraktion.

siRNA knockdown af YAP1 reducerer celleproliferation, inducerer apoptose, og aftager forankringsuafhængig vækst i bugspytkirtelkræft cellelinjer

for yderligere at analysere den rolle, YAP1 i tumorigenese undersøgte vi effekten af ​​YAP1 lyddæmpning af siRNA oligonukleotider på bugspytkirtlen celleproliferation, apoptose, og forankringsuafhængig vækst. BxPC-3 og PANC-1-celler blev revers-transficeret med to siRNA oligonukleotider rettet mod forskellige regioner af YAP1 mRNA-sekvens. De AllStars Negativ kontrol siRNA (Neg siRNA) og AllStars Død kontrol siRNA (Qiagen) blev anvendt som kontroller til sammenligning siRNA transfektions virkninger på celleproliferation og transfektionseffektivitet.

Over et tidsforløb på 96 timer, celler behandlet med YAP1 siRNA havde betydelig reduktion i vækstrater i forhold til de celler Kun og negativ siRNA (Neg siRNA) kontrol. I figur 4 er Neg siRNA havde en minimal effekt på udbredelsen af ​​BxPC-3 og PANC-1 i forhold til den ubehandlede celler Kun kontrol. Imidlertid havde både YAP1 siRNA-sekvenser betydeligt undertrykt proliferation i både BxPC-3 og PANC-1. Seksoghalvfems timer efter siRNA behandling, siRNA sekvens YAP1_1 hæmmede væksten af ​​BxPC-3 og Panc-1-celler med 69% og 53% (p 0,01) og siRNA sekvensen YAP1_2 hæmmede væksten med 34% og 33% (p 0,05). YAP1 siRNA-sekvenser ikke reducere proliferation i HPDE6 (figur S2A).

cellevækst kurver A) BxPC-3 og B) PANC-1 transficeret med YAP1 siRNA oligonukleotider. Den uafhængige to stikprøver

t

test (to-halet) blev anvendt til at beregne den statistiske signifikans ved 96-timers tidspunktet sammenlignet med Neg siRNA. * Betegner p 0,05, og ** betegner p 0,01. C) Caspase-Glo 3/7 assay (Promega) blev anvendt til at bestemme niveauet af apoptose i bugspytkirtelkræftceller transficeret med YAP1 siRNA oligonukleotider efter 72 timer. ** Betegner en uafhængig to stikprøver

t

test (to-halet) p-værdi. 0,01 i forhold til den negative siRNA kontrol (Neg siRNA)

Til vurdere effekten af ​​YAP1 inhibering på apoptose, målte vi aktiveringen af ​​caspase-3 og caspase-7 i bugspytkirtelkræftceller behandlet med siRNA. Som vist i figur 4C, 72 timer efter transfektion begge YAP1 siRNA sekvenser induceret caspase 3/7 aktivitet med mere end 2-fold (p 0,05) sammenlignet med den negative siRNA kontrol i BxPC-3, mens én sekvens (YAP1_1) signifikant induceret caspase aktivitet (p 0,05) i PANC-1. Men hverken YAP1 siRNA sekvens betydeligt induceret caspase 3/7 aktivitet i HPDE6 celler (Figur S2B). Dette fund tyder på, at knockdown af YAP1 udtryk inducerer caspase-afhængig apoptose i bugspytkirtelkræftceller.

Dernæst virkningerne af YAP1 hæmning på cellecyklusfordeling blev undersøgt (tabel S1). Begge YAP1 siRNA-sekvenser forårsagede en betydelig stigning i G0 /G1-celle population i både BxPC-3 og PANC-1, sammenligner til den negative siRNA kontrol. I HPDE6, gjorde de to siRNA sekvenser fremprovokere konsistente effekter på cellecyklusfordeling sammenlignet med Neg siRNA-kontrol (tabel S1).

Da vi observerede en signifikant virkning på celleproliferation, ønskede vi at overveje, om YAP1 knockdown af siRNA ville afskaffe forankringsuafhængig vækst bugspytkirtelkræftceller. BxPC-3 og PANC-1-celler blev behandlet med de siRNA-sekvenserne i 48 timer og høstet ved trypsinbehandling. Lige antal levedygtige celler for hver behandlingsgruppe blev derefter podet på blød agar. Efter 21 dage blev kolonier talt fra hver gruppe og derefter normaliseret til cellerne Kun kontrol og repræsenteret som en procentdel af kolonier. Både YAP1_1 og YAP1_2 siRNAs undertrykt clonogenicity i blød agar i BxPC-3 (95%, p 0,01) og i PANC-1 (60%, p 0,05) (figur 5A). I modsætning til den tilsvarende inhiberende aktivitet i celleproliferationsassay (figur 4A og 4B), reduktionen i kolonidannelse var meget større i BxPC-3-celler (~ 95%) end den, PANC-1-celler (-60%). Denne forskel er i overensstemmelse med niveauet af YAP1 mRNA og reduktion protein ved siRNA oligonukleotider i cellelinierne (figur 5B og 5C). Som vist i figur 5C, det reducerede protein ekspression ved YAP1 siRNA’er er mere dramatisk i BxPC-3-celler end i PANC-1-celler.

A) Procentdel af kolonier i forhold til cellerne Kun kontrol på blød agar efter 21 dages vækst fra første såning. p-værdier blev beregnet ved at sammenligne YAP1 siRNA (YAP1_1 og YAP1_2) til Neg siRNA (uafhængig to sidede

t

test, to-halet). B) qPCR analyse af YAP1 mRNA-ekspression efter 48 timers siRNA transfektion. C) Western blotting-analyse af YAP1 ekspression efter siRNA-behandling i 72 timer. Prøverne til hver cellelinje blev adskilt og analyseret på den samme blot * betegner p. 0,05, og ** betegner p. 0,01

Diskussion

Oprindeligt opdaget i Drosophila som en potent vej for tumor undertrykkelse, Hippo-vejen regulerer negativt cellevækst gennem en kinase kaskade og resulterer i inaktivering af Yki (YAP1 hos pattedyr) [6], [7], [9], [10]. Den vej og dens komponenter er meget bevares i pattedyr, og flere undersøgelser har vist vejen er overbevisende roller regulering af cellevækst, proliferation, overlevelse og forening i maligniteter [26] – [33]. Som det nukleare effektor af transskription, er YAP1 blevet et attraktivt mål for efterforskning i mammale maligniteter. I vores undersøgelse har vi observeret, at YAP1 overudtrykkes i pancreas tumorer og i cancercellelinier. Nedreguleringen af ​​YAP1 formindsket cellelevedygtighed, proliferation og forankringsuafhængig vækst i dyrkede celler.

subcellulære lokalisering af YAP1 i pancreas tumorer og i de dyrkede cellelinier fremhævede dysregulering af Hippo-vejen. Ved pathway aktivering, YAP1 inaktiveres via phosphorylering af LATS1 /2 og tilbageholdes følgelig i cytoplasmaet [6], [7]. I vores Immunofarvning undersøgelser, YAP1 farvningen er generelt mere intens i cytoplasmaet end i kernen, og tumoren har en væsentlig større andel af celler med positiv YAP1 farvning i kernen end den tilstødende normale (77% vs. 48%). Selv om en betydelig procentdel af hosliggende normale tilfælde farvedes positive for YAP1, det samlede ekspressionsniveau er betydeligt højere i tumoren (tabel 1). Farvningen af ​​YAP1 i normale pancreas væv er begrænset til acinære celler og små kanaler, som er konsistent med en tidligere undersøgelse [34] og sandsynligvis repræsenterer den normale funktion af YAP1 i opretholdelsen vævshomeostase.

Som en tidligere undersøgelse [6] og vores har observeret, er YAP1 proteinekspression moduleres ved at øge tætheden. Ved lav densitet, YAP1 proteinekspression er minimal, men som celledensitet øger YAP1 ekspression stige tilsvarende. I figur 3 blev et langsommere vandrende bånd observeret i de Langerhanske cancercellelinjer immunoblottedes for total YAP1 når celledensiteten nåede 100% i helcellelysat og nukleare fraktioner. Vi postulerer, at den langsommere vandrende bånd observeret i kernefraktionen ikke skyldes phosphoryleringen vides at regulere YAP1 lokalisering, men snarere en post-translationel modifikation ukendt på nuværende tidspunkt [35] – [38]. For fremtidige undersøgelser bør celletætheden bemærkes i relation til YAP1 proteinekspression. I pancreas cellelinjer, er YAP1 proteinekspression og lokalisering reguleret af celledensitet, men sådan regulering syntes at være betydeligt mindre i de cancerceller sammenlignet med den i normale duktale epitelceller (figur 3). Interessant, selvom vi se høje niveauer af YAP1 farvning i både kerne og cytoplasma i PDA væv, det nukleare YAP1 proteinniveauet havde mere signifikant stigning end den cytoplasmatiske YAP1 sammenlignet med hosliggende normalt væv (tabel 1). Dette indikerer måske, at der ud over opregulering af YAP1 proteinekspression komponenter af Hippo pathway, der regulerer YAP1 lokalisering (phosphorylering) kan også dysreguleret i bugspytkirtelkræft. Faktisk har de LATS1 /2 kinaser opstrøms for YAP1 vist sig at blive nedreguleret i flere cancertyper, herunder bløddelssarkom [39], astrocytoma [40], og brystkræft [41], [42]. Senest har Zhou et al. rapporterede tabet af aktiv MST1, anden kinase opstrøms for YAP1, i humane hepatocellulære karcinomer (HCC) og er tumor suppressive i transgene musemodeller [43] – [45].