PLoS ONE: En undersøgelse af foreningen mellem FOXA1 Farvning Level og Biokemisk Gentagelse efter Salvage strålebehandling for Tilbagevendende Prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

standardmæssigt indsamlet klinisk og patologisk patientinformation er kun påvist moderat evne til at forudsige risikoen for biokemisk tilbagefald (BCR) af prostatacancer hos mænd undergår salvage strålebehandling (SRT) for en stigende PSA efter radikal prostatektomi (RP). Selvom forhøjet FOXA1 farvning er blevet forbundet med dårlig patient resultater efter RP, er det ikke blevet undersøgt i den specifikke indstilling for SRT efter RP. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere sammenhængen mellem FOXA1 farvning niveau og BCR efter SRT for tilbagevendende prostatacancer.

Metoder

I alt 141 mænd, der gennemgik SRT på vores institution blev inkluderet. FOXA1 farvning niveauer i primær tumor prøver blev påvist ved hjælp af immunhistokemi. FOXA1 farvning procent og intensitet blev målt og ganget sammen for at opnå en FOXA1 H-score (interval 0-12), som var vores primære farvning foranstaltning. P-værdier ≤ 0,0056 blev betragtet som statistisk signifikant efter anvendelse af et Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger.

Resultater

Der var ikke en signifikant sammenhæng mellem FOXA1 H-score og risiko for BCR, når man overvejer H -Score som et ordenstal variabel eller som en kategorisk variabel (alle P≥0.090). Ligeledes blev ingen signifikante associationer med BCR observeret for FOXA1 farvning procentdel eller farvning intensitet (alle P≥0.14).

Konklusioner

FOXA1 farvning niveau synes ikke at have en stor indflydelse på risikoen for BCR efter SRT

Henvisning:. Heckman MG, Robinson JL, Tzou KS, Parker AS, Wu KJ, Hilton TW, et al. (2016) En undersøgelse af foreningen mellem FOXA1 Farvning Level og Biokemisk Gentagelse efter Salvage strålebehandling for tilbagevendende prostatakræft. PLoS ONE 11 (3): e0151785. doi: 10,1371 /journal.pone.0151785

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Januar 4, 2016 Accepteret: 3 Mar 2016; Udgivet: Marts 17, 2016

Copyright: © 2016 Heckman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er tilgængelige i avisen og dens støtte Information filer

finansiering:. JSC har finansiering fra Cancer Research UK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hvert år i USA cirka 75.000 mænd vil undergå en radikal prostatektomi (RP) for lokaliseret prostatacancer [1]. Heraf mellem 15% og 25% vil opleve en betydelig stigning i deres serum prostataspecifikt antigen niveau efter kirurgi, hvilket indikerer en biokemisk tilbagefald (BCR) af deres sygdom [1]. Den eneste potentielt helbredende behandling mulighed til rådighed for mænd, der har oplevet BCR af prostatakræft efter RP er salvage strålebehandling (SRT); dog har den rapporterede succes SRT varierede fra 10% til 65% [2-10]. Som sådan evnen til præcist at identificere hvilke mænd har den højeste sandsynlighed for at reagere på SRT er et vigtigt klinisk problem for feltet. Faktisk, evnen nøjagtigt forudsige, hvilke mænd er tilbøjelige til at reagere på SRT er vigtigt for at optimere udvælgelsen af ​​patienter til denne behandling, og at designe bedre kliniske undersøgelser for at evaluere hidtil ukendte midler til forbedring SRT effektivitet. Relateret til dette, har en række undersøgelser blevet udført, at forsøg på at identificere specifikke karakteristika, der er forbundet med risiko for BCR efter SRT. Adskillige godt replikerede risikofaktorer er blevet etableret, såsom forhøjet pre-SRT PSA-niveau, mere avanceret patologisk tumor stadie, højere score Gleason, negativ kirurgisk margen, og kortere pre-SRT PSA fordoblingstid [2-10].

I et forsøg på at give patienter med individualiserede estimater af BCR risiko, der er skræddersyet til deres kliniske og patologiske egenskaber, flere store undersøgelser har foreslået scoring algoritmer, der kombinerer oplysninger fra flere prognostiske faktorer [4-5, 10]. Men evnen af ​​disse algoritmer til at stratificere risiko for BCR har betydelige muligheder for forbedringer; for eksempel en bemærkelsesværdig andel af patienterne i den lave BCR risici grupper stadig opleve BCR [4-5, 8-10]. Der er derfor et behov for at identificere andre faktorer, der er prædiktive for BCR efter SRT for at muliggøre bedre patient selektion for SRT. I betragtning af, at de førnævnte scoring algoritmer har indarbejdet kun standard kliniske og patologiske oplysninger, der er til rådighed for læger på det tidspunkt, SRT, kan studiet af tumor-baserede biomarkører være nyttige i denne henseende.

forkhead transskription faktor FOXA1 fremstår som en kritisk aktør i prostatakræft biologi. Beskrives ofte som en pioneer faktor, FOXA1 har evnen til at binde til stærkt komprimeret kromatin og gøre disse regioner mere tilgængelige for andre transkriptionsfaktorer såsom androgen receptor (AR) [11]. I den menneskelige voksen prostata, er FOXA1 udtrykt i epitelcellerne af den perifere zone [12], det sted, hvor størstedelen af ​​prostatakræft stammer [13]. I prostata cancercellelinier, er FOXA1 kræves til androgen receptor-aktivering [14-16], og overekspression af FOXA1 stigninger AR bindende i hele genomet [17]. Resultater fra kliniske studier har indikeret, at høje niveauer af FOXA1 har været forbundet med en øget risiko for BCR [12, 17-18] og prostatakræft-specifik død [15] efter RP. I forbindelse med tilbagevendende sygdom, har FOXA1 blevet vist at blive udtrykt i 90% af prostatacancer metastaser [19], og en række undersøgelser konstateret, at generne placeret støder op til FOXA1 bindingssteder i cellelinje modeller af kastrationsniveau resistens prostatacancer er stærkt forbundet med gen-underskrifter af prostatakræft tilbagefald [17, 20]. Imidlertid har evne FOXA1 udtryk til at forudsige risikoen for BCR i den specifikke patientgruppe af mænd, der gennemgår SRT for tilbagevendende prostatacancer efter RP ikke vurderet til dato. Ovennævnte rapporter om sammenhængen mellem høj FOXA1 farvning niveauer og fattige patientresultater, kombineret med det faktum, at FOXA1 udtryk synes at fortsætte i metastaser, tyder på, at FOXA1 er en markør for sygdom aggressivitet og er en rimelig kandidat til undersøgelse i relation til BCR i SRT patienter. Derfor i denne undersøgelse vurderet, sammenslutningen af ​​immunhistokemiske farvning niveauer af FOXA1 i primær prostata cancer tumor prøver med risiko for BCR efter SRT.

Materialer og metoder

Patient Valg og Outcome Definition

Alle 141 patienter, som gennemgik SRT at behandle en stigende PSA efter RP for prostatakræft på Mayo Clinic i perioden juli 1987 og februar 2003 og som havde arkiveret tumorvæv rådighed blev inkluderet i denne undersøgelse. Information blev retrospektivt indsamlet fra patienternes diagrammer vedrørende baseline kliniske oplysninger (pre-RP PSA, præ-SRT PSA, alder, præ-SRT hormonbehandling), patologiske oplysninger (patologisk tumor stadie, kirurgisk margen, Gleason score), SRT oplysninger (SRT dosis, længde af tid mellem RP til SRT initiering), og post-SRT PSA målinger. BCR var det primære endpoint i dette studie og blev defineret som forekomsten af ​​en PSA-værdi på 0,2 ng /ml eller højere og stigende efter den post-SRT nadir. Datoen for BCR blev anset for at være datoen for den definerende PSA værdi uden tilbagevirkende kraft. Mayo Clinic Board Institutional Review godkendt undersøgelsen og alle fag forudsat skriftligt informeret samtykke.

information Salvage strålebehandling

Patienter blev immobiliseret i liggende stilling med kontrast i blæren og endetarmen, og størstedelen havde også et tilbageskridt urethrography udført. Den prostata fossa blev behandlet med 6-20 MV fotoner til en median dosis på 64,8 Gy (Range: 58,4 til 72,4 Gy) i daglige 1,8-2,0 Gy fraktioner. Computertomografi-baseret behandling planlægning blev anvendt i de fleste tilfælde. Tilpasset blokering og 4-8 stationære konforme eller roterende felter blev anvendt. Intensitet modulation, inverse planlægning, og image-vejledning teknikker var ikke tilgængelig til brug på vores institution i løbet af denne tidsramme. Efter endt behandling blev patienterne typisk vurderet hver 3-4 måned i 2 år, og hver 6-12 måneder derefter.

Immunhistokemi

En erfaren uropathologist valgt tumoren blok fra den oprindelige prostatektomi specimen med den højeste kvalitet tumor. Fem-um tykke slides blev skåret og farvet med immunhistokemisk (IHC) metoder til FOXA1. Alle IHC farvning blev udført på det fuldautomatiske Leica Bond III (Leica Microsystems, Milton Keynes, UK) ved hjælp af Polymer Afgræns kit med DAB Enhancer (Leica). Kort fortalt, efter antigen-genvinding, var primært antistof anvendt i 15 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af anti-kanin-polymer-HRP i 8 minutter, diaminobenzidin (DAB) i 10 minutter og DAB enhancer i yderligere 10 minutter. Alle trin blev gennemført ved stuetemperatur og vaske trin i Leica Bondwash blev indbefattet mellem hvert trin. Leica Hæmatoxylin blev anvendt i 5 minutter for nuklear kontrastfarvning. Kanin-anti-FOXA1 (Abcam, UK; ab23738) er tidligere blevet valideret på humant brystvæv og blev anvendt til undersøgelsen ved 1: 800 og fortyndet i antistoffortyndingsmiddel bestående af 1% Donkey Serum, 0,05% Tween 20 i 300 mM TBS at reducere baggrundsfarvning . Antigen genfinding blev udført under anvendelse Leica ER1 (natriumcitrat, pH 6) i 20 minutter ved 100 ° C. Farvningen blev gennemført i to portioner, ved anvendelse af anti-FOXA1 lotnumre GR77830-1 for det første parti (N = 73) og GR130594-1 for det andet parti (N = 68). En masse Sammenligningen blev udført før farvning, og det blev bestemt, at farvningen var ækvivalent

Efter IHC-farvning var fuldført, procentdelen af ​​celler med nuklear farvning (dvs. FOXA1 farvning procent) samt farvningsintensitet blev målt manuelt af en erfaren uropathologist der blev blindet til patient karakteristika og resultater. FOXA1 farvning procentdel blev scoret som en af ​​4 kategorier (1 = 0-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 76-100%), som var FOXA1 farvningsintensitet (0 = negativ, 1 = svag, 2 = moderat, 3 = stærk). FOXA1 H-score blev beregnet ved at multiplicere farvning procent og farvningsintensitet, hvilket resulterer i en H-score, der har mulige værdier i området fra 0 til 12. FOXA1 H-score blev betragtet som vores primære FOXA1 farvning foranstaltning, da denne semi-kvantitativt mål er mest informative ved at tage hensyn både totale protein niveauer og overordnede tumorbyrde [21]. FOXA1 farvning procent og farvning intensitet blev betragtet som sekundære foranstaltninger. Eksempler på FOXA1 immunfarvning for patienterne i vores undersøgelse er angivet i figur 1 (farvning procent) og figur 2 (farvning intensitet).

Statistisk analyse

Kontinuerlig variabler var samlet ved hjælp af prøven median og rækkevidde. Patient karakteristika blev sammenlignet i henhold til FOXA1 H-score, når dichotomizing med medianværdien (H-score ≤ 3 vs. H-score 3) ved hjælp af Fishers eksakte test eller en Wilcoxon rank sum test. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere den kumulative incidens af BCR efter SRT, censurerer på datoen for sidste PSA måling for patienter, der ikke oplevede BCR. Foreninger mellem patientkarakteristika og BCR efter SRT blev undersøgt ved hjælp af ujusterede Cox proportionel risiko regressions modeller. Relative risici (RRS) og 95% konfidensintervaller (CIS) blev estimeret. På grund af deres skæve fordelinger, pre-RP PSA, præ-SRT PSA, og længden af ​​tid fra RP til SRT indvielse blev anset på logaritmen score i alle Cox regressionsanalyse.

Sammenslutninger af hver af de tre forskellige FOXA1 farvning foranstaltninger (H-score [primær foranstaltning], farvning procentdel, farvning intensitet) med BCR efter SRT blev evalueret ved hjælp af enkelt variabel og multivariable Cox proportionel risiko regressions modeller. Enkelte variable modeller blev justeret for farvning parti kun for at tage højde for enhver lille batch-til-batch variation i FOXA1 farvning niveauer. For at tage højde for andre potentielle forstyrrende variabler blev multivariable modeller korrigeret for farvning parti samt eventuelle karakteristika, der enten afveg ifølge FOXA1 H-score (≤3 vs. 3) med en p-værdi ≤ 0,10, eller vises en forening med BCR med en p-værdi på ≤ 0,10. Tre forskellige beskæringspunkter blev anset for både farvning procentdel (≤25% vs. 25%, ≤50% vs. 50%, ≤75% vs. 75%) og H-score (≤2 vs. 3, ≤4 vs. 4) til brug i Cox regressionsanalyse. Beskæringspunkter til farvning procentdel blev valgt på hvert andet niveau af denne kategoriske variabel, og beskæringspunkter for H-score blev valgt på grundlag af prøven 25

th, 50

th, og 75

th percentiler. Til farvning intensitet, på grund af det lille antal patienter med negativ farvning, vi dikotomiseret denne variabel som negative /svag vs. moderat i hele foreningen analyse. FOXA1 H-score og farvning procentdel blev også undersøgt som ordinale variabler i Cox regressionsanalyse; RRs i denne ordenstal variabel analyse svarer til et 1-enhed stigning i H-score, og en score stigning på 1 til farvning procentdel (dvs. en ændring fra 0-25% til 26-50%). Vi udnyttede en Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger, hvorefter p-værdier ≤ 0,0056 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af R Statistisk Software (version 2.14.0; R Foundation for Statistisk Computing, Wien, Østrig).

Resultater

Et resumé af FOXA1 farvning niveauer for kohorte af 141 SRT patienter er tilvejebragt i tabel 1. FOXA1 farvende procenter blev observeret over hele 0% til 100% af frekvenser, medens FOXA1 farvningsintensitet var oftest enten svag (71,6%) eller moderat (24,1%) uden noget stærkt FOXA1 farvningsintensitet observeret for enhver patient. FOXA1 H-score, der som tidligere nævnt var vores primære mål, og blev beregnet ved at gange FOXA1 farvning procent og intensitet, var mellem 0 og 2 for 56 patienter (39,7%), mellem 3 og 4 for 60 patienter (42,6%), og større end 4 for 25 patienter (17,7%).

tabel 2 viser en sammenligning af egenskaber ifølge FOXA1 H-score, når dichotomizing H-score efter prøven median (dvs. ≤3 vs. 0,001), patienter med en mere avanceret patologisk tumor stadie (P = 0,003), og patienter med en højere Gleason score (P = 0,042).

Ved evalueringen af ​​den primære mål med undersøgelsen, sammenhænge mellem hver af de tre FOXA1 farvning foranstaltninger (H-score [primær foranstaltning], farvning procentdel, farvning intensitet) og BCR efter SRT er vist i tabel 3. i enkelt variabel analyse kun justering for farvning parti, der ikke var en signifikant sammenhæng mellem BCR og FOXA1 H-score som enten en ordinal variabel (RR: 1,05, P = 0,33) eller som en kategorisk variabel for nogen af ​​de beskæringspunkter som blev anset (alle P≥0.090, tabel 3). Denne mangel på en signifikant sammenhæng var konsistent i multivariabel analyse desuden justering for de potentielle forstyrrende påvirkninger af længden af ​​tid mellem RP og SRT, pre-SRT PSA, patologisk tumor stadie, og Gleason score (tabel 3). Ved vurdering FOXA1 farvning procent og farvning intensitet individuelt, var der også ingen statistisk signifikante associationer med risiko for BCR i enkelt variabel analyse eller multivariable analyse (alle P≥0.14, tabel 3).

Vi udførte flere yderligere analyser relateret til farvning parti for yderligere højde for eventuelle indflydelse det kan have på vores resultater. Først undersøgte vi sammenhængen mellem de enkelte FOXA1 farvning foranstaltning og risiko for BCR separat i den første og anden farvning partier. Som vist i S2 tabel, den manglende sammenhæng mellem FOXA1 farvning niveau og BCR var konsekvent i de to separate partier. For det andet har vi fjernet alle justeringer til farvning parti fra vores Cox proportionel risiko regressions analyser involverer den samlede patientpopulation kohorte. Lignende resultater blev observeret, med ingen statistisk signifikante associationer mellem FOXA1 farvning niveau og BCR risiko (S3 tabel).

De rå data anvendes til at udføre analysen findes i S1 File.

Diskussion

Dette er den første undersøgelse til dato, der vurderer evne FOXA1 farvning niveauer i primære prostatakræft tumorer at forudsige BCR blandt mænd, der gennemgår SRT. Baseret på vores resultater, er FOXA1 farvning niveau ikke synes at have stor indflydelse på risikoen for BCR efter SRT, som det fremgår af manglen på en signifikant sammenhæng med BCR for nogen af ​​FOXA1 farvning variabler, der blev undersøgt. Denne mangel på association forblev tilsyneladende selv efter justering for vigtige kliniske og patologiske faktorer, der vides at være forbundet med risiko for BCR efter SRT og er især tydeligt, når man overvejer, at p-værdi på 0,0056 eller lavere, blev anset for statistisk signifikant for at tage højde for flere testning. synes det generelt relativt usandsynligt, at FOXA1 farvning plan alene vil være nyttige i at forbedre risikoen lagdeling af BCR efter SRT. givet sådanne behov for at identificere nye risikofaktorer for BCR for at optimere patientens selektion for SRT, fremgår det derfor, at andre end FOXA1 biomarkører bør overvejes til undersøgelse.

Selvom en større sammenhæng mellem FOXA1 farvning niveau og risiko for BCR efter SRT ikke blev observeret i vores undersøgelse, har relativt stærke associationer blevet bemærket af flere grupper i forbindelse med BCR efter RP. I en undersøgelse af 102 RP patienter fra Det Forenede Kongerige, Robinson et al. observeret en 5 gange øget risiko for BCR i individer med højere FOXA1 farvning (P = 0,028) [17]. I en mindre undersøgelse af 52 japanske RP patienter ved Imamura et al, frihed fra BCR var 88% hos patienter med lavt FOXA1 farvning sammenlignet med 50% hos patienter med høj farvning (P = 0,011) [18]. Gerhardt et al. evaluerede 207 patienter fra, som havde gennemgået RP i Schweiz og observerede en gennemsnitlig tid til BCR af 70 måneder hos patienter med forhøjet FOXA1 farvning niveau sammenlignet med et gennemsnit på 87 måneder hos patienter med lavt farvning (P = 0,018) [12]. Den omstændighed, at graden af ​​associering mellem FOXA1 farvning og BCR ikke var så stærk i vores undersøgelse kan skyldes den lavere grad af variabilitet i sygdommen aggressivitet i vores patient undergruppe, at alle har tilbagevendende og derfor mere aggressiv cancer. Der synes også at være modstridende beviser vedrørende den særlige rolle at FOXA1 spiller i forbindelse med tilbagevendende sygdom. Mens talrige undersøgelser har understreget betydningen af ​​FOXA1 i primær prostatakræft vækst [22], er endnu ikke fuldt ud defineret sin rolle i metastatisk sygdom. FOXA1 bindingssteder er placeret nær centrale gener involveret i kastrationsniveau resistent prostatacancer [18, 20]. Der er imidlertid modstridende beviser vedrørende dets rolle i cellemotilitet og epithelial-til-mesenchymal overgang, og FOXA1 kan endog hæmme metastase-dannelse i musemodeller [12, 23]. Samlet set beviser til dato tyder på, at FOXA1 kan være en nyttig biomarkør til at forudsige indledende sygdomsprogression, men ikke nødvendigvis for progression efter behandlingen af ​​recidiverende sygdom ved SRT.

Flere begrænsninger af vores undersøgelse er vigtigt at holde sig sind. Den retrospektive design potentielt introducerer skævhed i dataindsamlingen. Derudover stikprøvestørrelse på 141 patienter er relativt lille, og dette resulterer i en mangel på magt til at opdage sammenhænge mellem FOXA1 farvning niveau og BCR. Derfor er muligheden for type II fejl (dvs. en falsk-negative fund) er også vigtigt at overveje, og 95% konfidensgrænser bør understreges ved fortolkningen vores resultater, da disse kan indeholde klinisk relevant virkning størrelser. Observerede vi også, at patienter med en højere FOXA1 H-score tendens til at være mere ofte i første farvning parti. Alle mulige strategier for at minimere batchdivergens var ansat, og det er derfor meget sandsynligt, at denne forskel skyldes en ægte forskel i FOXA1 farvning niveauer mellem de to partier. Faktisk når man analyserer hvert parti for sig, blev der observeret en lignende mangel på sammenhæng mellem FOXA1 farvning niveau og BCR. Endelig patientpopulationen vores tertiære henvisning center består hovedsageligt af kaukasiere ( 98%)., Og derfor kan vi ikke udvide vores resultater til individer af andre racer

Konklusioner

Resultaterne af vores undersøgelse dokumenterer, at FOXA1 farvning plan alene ikke er dramatisk forbundet med risiko for BCR efter SRT og er derfor relativt usandsynligt, at være til nytte i at forbedre patient selektion for SRT efter tilbagevendende prostatacancer efter RP. Det fremgår, at det kan være mere frugtbart at overveje andre biomarkører for undersøgelse for at yderligere at optimere risikoen lagdeling for SRT kandidater.

Støtte Information

S1 fil. Rådata

doi:. 10,1371 /journal.pone.0151785.s001

(XLSX)

S1 Table. Foreninger mellem patientens karakteristika og biokemisk recidiv efter salvage strålebehandling

doi:. 10,1371 /journal.pone.0151785.s002

(DOC)

S2 Table. Foreninger mellem FOXA1 farvning niveau og biokemisk recidiv efter salvage strålebehandling separat for patienter i den første og anden farvning partier

doi:. 10,1371 /journal.pone.0151785.s003

(DOC)

S3 Table. Foreninger mellem FOXA1 farvning niveau og biokemisk recidiv efter salvage strålebehandling uden justering for farvning parti

doi:. 10,1371 /journal.pone.0151785.s004

(DOC)