PLoS ONE: Genomisk Karakterisering af småcellet kræftpatient-afledte Xenografter Genereret fra endobronchial Ultralyd-Guided transbronkial nål aspiration Prøver

Abstrakt

Patient-afledte xenograft (PDX) modeller genereret fra kirurgiske prøver er stigende popularitet som prækliniske modeller for kræft. Imidlertid etablering af PDX linier fra småcellet lungecancer (SCLC) patienter er vanskelig på grund af meget begrænset mængde af tilgængelige biopsi materiale. Vi spurgte, om SCLC celler opnået fra endobronchial ultralyd-vejledt transbronkial nål aspiration (eBUS-TBNA) kunne skabe PDX linjer, der vedligeholdes fænotypiske og genetiske karakteristika den primære tumor. Efter en vellykket eBUS-TBNA prøvetagning til diagnostiske formål, opnåede vi en ekstra prøve for cytologisk analyse og implantation i flankerne af immunsvækkede mus. Dyr blev overvåget for indpodning i op til 6 måneder. Histopatologiske og immunhistokemisk analyse, og målrettede næste generation re-sekventering, blev derefter udført i både den primære prøve og den afledte PDX linje. I alt 12 patienter blev inkluderet i undersøgelsen. EBUS-TBNA aspirater gav store antal levedygtige tumorceller er tilstrækkelige til at injicere mellem 18,750 og 1,487,000 celler pr flanke, og til opnåelse mikrogram mængder af høj kvalitet DNA. Af disse prøver fra 10 patienter genererede xenografter (transplantation sats 83%) med en gennemsnitlig ventetid på 104 dage (spændvidde 63-188). Alle undtagen én opretholdt en typisk SCLC fænotype, der nøje matchede den oprindelige prøve. Identiske mutationer som er karakteristiske for SCLC blev identificeret i både den primære prøve og xenograft linje. EBUS-TBNA har potentialet til at være et effektivt redskab i udviklingen af ​​nye strategier målretning for SCLC patienter ved at give et stort antal levedygtige tumorceller er egnede til både xenografting og kompleks genomisk analyse

Henvisning:. Leong TL, Marini KD, Rossello FJ, Jayasekara SN, Russell PA, Prodanovic Z, et al. (2014) Genomisk Karakterisering af småcellet kræftpatient-afledte Xenografter Genereret fra endobronchial Ultralyd-Guided transbronkial nål aspiration Prøver. PLoS ONE 9 (9): e106862. doi: 10,1371 /journal.pone.0106862

Redaktør: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA

Modtaget: 10 juni, 2014, Accepteret: August 2, 2014; Udgivet: September 5, 2014

Copyright: © 2014 Leong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data og metadata er tilgængelige på NIH Short Reads Arkiv, (www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), tiltrædelse nummer SRP044662

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den victorianske Cancer Agency (www .victoriancanceragency.org.au), National Health og Medical Research Council of Australia (www.nhmrc.gov.au), og den victorianske regering operative Infrastruktur Support Program (www.business.vic.gov.au/grants-and-assistance/programs/medical-research-operational-infrastructure-program). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) tegner sig for omkring 15% af alle thorax maligniteter [1]. Patienter med sygdom begrænset til brystet behandles med kemo-strålebehandling, mens patienter med fremskreden sygdom behandles med kemoterapi alene [2]. Ved fremskreden sygdom, platinbaseret dublet kemoterapi inducerer komplette responser i op til 20%, hvorimod kombinerede kemo-strålebehandling i sygdom begrænset til brystet producerer komplette responser i op til 50% af patienterne [3]. Men dødelige gentagelser inden for 12 måneder forekommer i næsten alle tilfælde. Desuden har forsøg med flere cytotoksiske midler, dosis intensivering, eller nye målrettede behandlinger undladt at forbedre resultatet i de sidste tre årtier [3].

Præcise prækliniske modeller og vævsprøver af høj kvalitet er afgørende for udviklingen af nye behandlinger mod kræft. Da kirurgisk resektion af SCLC er ualmindeligt, diagnose og biomarkør undersøgelser er stærkt afhængige af prøver fremstillet ved perkutan fin nål aspiration eller bronkoskopiske pincet biopsi [1]. Begge teknikker giver meget lidt materiale for forskere, der fører til en stor afhængighed af konventionelle cellelinjer, som måske ikke præcist afspejler den komplekse biologiske og genomisk heterogenitet af sygdom hos mennesker [4]. På det seneste har PDX-modeller vundet popularitet blandt kræftforskere. Her kan væv opnået fra friske kirurgiske prøver implanteres i immundefekte mus og opretholdt som en ubegrænset kilde til tumor materiale, der ligner den primære tumor [4] – [7]. Hertil kommer, “co-klinisk” forsøg er nu muligt, hvor patient og mus får den samme behandling [8]. Men den begrænsede tilgængelighed af høj kvalitet SCLC væv gør en sådan tilgang ekstremt udfordrende [4].

eBUS-TBNA er en ny udvikling i diagnostisk bronkoskopi, der tillader meget nøjagtig aspiration prøvetagning af tumorer og lymfeknuder der støder op til luftvejene, som ikke er synlige ved konventionel bronkoskopi [9]. Da SCLC almindeligvis er forbundet med mediastinal lymfadenopati [1], eBUS-TBNA er en ideel måde at opnå materiale til diagnose og iscenesættelse. Derfor testede vi muligheden for at bruge levende celler opnået fra eBUS-TBNA sampling til at generere PDX linjer fra SCLC patienter.

Materialer og metoder

Etik

Menneskelig eksperimenter blev foretaget med informeret, skriftligt samtykke i overensstemmelse med den politik, National Health og Sundhedsvidenskabelige Forskningsråd i Australien, Monash Health, Melbourne Sundhed og Helsinki-erklæringen. De kliniske og forskningsmæssige protokoller blev godkendt af en australsk Multisite menneskelige Research Ethics Committee (Protokol # HREC /12 /SHA /8). Dyreforsøg blev godkendt af Monash University Animal Ethics Committee (Protokol # 09072A), og blev udført i overensstemmelse med den nationale sundhed og Medical Research Council of Australia og National Research Council. Human aflivning af mus blev udført ved hjælp af inhaleret kuldioxid anæstesi i overensstemmelse med de institutionelle og nationale retningslinjer.

Patienter og studiedesign

Patienter med mistanke om lungekræft undergår eBUS-TBNA som en del af rutinemæssig klinisk pleje gav informeret samtykke til en ekstra biopsi, der skal tages til forskningsformål. De, der viste sig at have SCLC blev derefter medtaget for analysen nedenfor.

eBUS-TBNA

Alle procedurer blev udført som ambulante procedurer som beskrevet tidligere [10], i overensstemmelse med britisk thoracic Society retningslinjer [11], under bevidst sedation sammen med aktuel luftvejene bedøvelse ved hjælp lidocain 2%. Alle procedurer blev udført ved anvendelse af en dedikeret lineært array bronchoskop (BF-UC180F-OL8, Olympus, Tokyo, Japan). Ultralydsbilleder blev behandlet af et dedikeret Doppler-mode ultralydsscanner (EU-ME1, Olympus, Tokyo, Japan).

Den første prøve blev opnået ifølge standard kliniske protokoller. De første 3 dråber af aspirat blev genfundet på en positivt ladet dias, lufttørret og derefter samtidigt fikseret og farvet ved hjælp af Diff-Quik-protokol og vurderes på stedet af en cytopathologist. Resten af ​​prøven blev derefter anbragt i en steril opløsning og transporteres til den diagnostiske patologi laboratorium, hvor det centrifugeres, fikseret i formalin, indlejret i paraffin og snittet til rutinemæssig histopatologi og immunhistokemisk analyse. Når diagnosen på stedet blev bekræftet, blev en anden prøve derefter taget til forskningsformål.

Behandling af forskning eBUS-TBNA prøven

Hele forskning eksemplar blev genfundet i en steril 1,5 ml Eppendorf rør, anbragt på våd is, og derefter straks transporteres til laboratoriet. Iskold, blev steril phosphatbufret saltvand (PBS) tilsat til modellen for at gøre et samlet volumen på 500 pi, og derefter centrifugeret ved 1000 g i 5 sekunder. Prøven blev derefter forsigtigt blandet med en 1 ml pipette og anbringes på is. Prøven bliver derefter fordelt således: (i) 200 pi blev overført til en Nunc Cryotube og opbevaret ved -80 ° C til efterfølgende DNA rensning; (Ii) 50 pi blev smurt på en positivt ladet objektglas, lufttørret og derefter farvet under anvendelse af Diff Quik-protokollen til at bestemme tumorcelle renhed; (Iii) 50 pi blev overført til et rent eppendorfrør, og kraftigt tritureret med en 200 pi pipette for mekanisk at opsplitte de celler efterfulgt af tælling under anvendelse af et hæmocytometer at bestemme totale celleantal; (Iv) De resterende 200 pi blev anvendt til at generere PDX. Det samlede antal af tumorceller injiceret blev estimeret ved at bestemme antallet tumorceller ses i Diff-Quick farvede objektglas som procentdel af alle celler med kerne ved at tage gennemsnittet af de tællinger af 10 tilfældige felter på 40X.

Generation af PDX linjer

eBUS-TBNA prøve blev blandet med et tilsvarende volumen af ​​iskold Matrigel (BD Biosciences), anbragt i en steril 1 ml sprøjte lukket med en 26 G nål og transporteres straks til dyret facilitet. Under aseptiske betingelser blev cellesuspensionen injiceres subkutant i den højre flanke af en NSG mus (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ). Disse dybt immundefekte dyr er afledt af NOD /SCID-stammen med tilsætning af en homozygot interleukin-2 receptor gamma chain knockout, og er maksimalt effektive til oprettelse xenotransplantattumorer fra et lille antal donorceller [12]. Når primær indpodning blev opnået, blev PDX linjer derefter passeret i nøgne mus som beskrevet tidligere [4].

Immunhistokemi

Farvning blev udført på 5 um fikseret i formalin, paraffin vævssnit som beskrevet [13 ], ved hjælp af Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, PK-6101) og Mouse on Mouse Basic Kit (Vector Laboratories, BMK-2202). Antistoffer og fortyndinger var som følger: kanin polyklonalt anti-NCAM (CD56) en neural og neuroendokrine markering, (H-300) (Santa Cruz Biotechnology; sc-10735), 1:200; kanin monoklonalt anti-TTF1 (EP1584Y, Novus Biologicals, NB100-8006), 1:400; muse monoklonalt anti-synaptophysin (Ventana Klon SP11, forfortyndet).

Målrettet re-sekventering

lynfrosset eBUS og PDX prøver blev anvendt til at generere oprensede DNA ved anvendelse af Qiagen DNeasy kit (# 69.504) med Qiagen RNAse A behandlingsmulighed den (# 19101) ifølge producentens instruktioner. DNA blev analyseret og kvalitet kontrolleres ved hjælp qubit’en 2,0 fluorimeter (Invitrogen # Q32866) ifølge producentens instruktioner.

Målrettet re-sekventering blev udført under anvendelse af Ion AmpliSeq omfattende cancer panel v2 (Life Technologies # 4.477.685), som målretter exoner af 409 tumorsuppressorgener og onkogener. Bibliotekskonstruktion blev udført ved anvendelse af Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technologies, # 4.478.379) og bibliotek skabeloner blev fremstillet og Barcoded til sekventering under anvendelse af Ion OneTouch System i henhold til producentens anvisninger. Fire stregkodede prøver blev multiplex pr Ion PI Chip (Life Technologies) og sekventeret på Ion Proton Sequencer System (Life Technologies). Sekventering læser blev behandlet ved hjælp af Ion Torrent Suite v 4.0.2 (Life Technologies). De-multipleksede prøver blev vurderet til sekventering kvalitet og høj kvalitet sekventering læser blev kortlagt til den fuldstændige hg19 humane genom (UCSC udgave, February 2009). Variant opdagelse blev udført ved hjælp af Torrent Variant Caller v 4.0 (Life Technologies), en software plug in til Ion Torrent Suite-software. Prøve identificeret varianter blev samlet og sammenlignet ved anvendelse VcfTools [14] og SnpSift [15]. Variant funktionel anmærkning blev udført ved hjælp SnpEff [15], og SnpSift med dbNSFP [16], en database til funktionel annotation af ikke-synonyme varianter. Alle data og metadata er tilgængelige på NIH Short Reads Arkiv, (www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), tiltrædelse nummer SRP044662.

Resultater

Patient og prøve egenskaber

i alt 12 patienter med en bekræftet diagnose af SCLC blev indgået i undersøgelsen, og er opsummeret i tabel 1. eBUS prøver blev taget fra definerede nodal stationer, eller fra store masser i paratracheal, hilar eller mediastinale regioner. Alle prøver blev vurderet ved anvendelse af rutinemæssige cytopatologi kriterier som værende i overensstemmelse med en diagnose af SCLC. Hvor det er muligt, blev celleblokke sektioneret og H eller (ii) missense varianter forudsiges at forringe proteinfunktion med en SIFT [17] score ≤0.05. Delte kodende region varianter blev derefter filtreret under anvendelse af følgende udelukkelseskriterier: (i) kendte germline SNP’er (ii) sandsynligvis utilsigtede mutationer (https://mutagenetix.utsouthwestern.edu); og (iii) varianter i gener, der almindeligvis muteret i cancer, der sandsynligvis vil være uden funktionelle betydning [18]. Disse varianter er anført i tabel S2. Vi næste rangeret de berørte gener efter deres mutation frekvens i COSMIC database (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) med en rapporteret incidens ≥5%. Som vist i figur 4, når fælles driver mutationer var til stede i delprøven blev de bevaret i den tilsvarende xenotransplantat. Mutationer der kun findes i delprøven (

IGFR1

,

TET1

,

mTOR

), og kun i xenograft (

RB1 ​​

,

NTRK1

) blev observeret i syv delprøve-xenograft par (Figur 4). Mutationer i

KRAS

, mere typisk for lunge adenocarcinom, ikke er påvist.

Gener er sorteret efter% ifølge deres forekomst i COSMIC database. Mutationer fundet i både den primære prøve og xenograft vises

Diskussion

PDX-modeller har for nylig dukket op som en måde mere præcist modellering terapeutiske respons [5] -. [7] resultat [12], [19] og som kilde til høj kvalitet materiale til næste generation sekventering [20]. Typisk har frembringelsen af ​​lungekræft PDX linjer blevet begrænset til anvendelsen af ​​kirurgisk resektion materiale som kilde af levedygtige tumorceller [19], [21], [22]. Da mindre end 20% af lungekræftpatienter opereres, denne tilgang begrænser etableringen af ​​PDX linjer til tidlig fase lungekræft. Desuden er SCLC næsten aldrig kirurgisk resektion, som understreges af de seneste hele genomet undersøgelser [23], [24]. I vores indledende beskrivelse af tre SCLC PDX linjer, vi indkøbt materiale fra bronkoskopiske biopsier i sjældne tilfælde, hvor endobronchiale læsioner kunne let identificeres [4], [20]. For nylig Hodgkinson

et al

[25] beskrev den vellykkede generation af 4 SCLC PDX linjer fra cirkulerende tumorceller fra 6 patienter, understreger den aggressive karakter af disse tumorer, samt potentialet for at generere medgørlige modeller fra minimalt invasiv teknikker.

så vidt vi ved, er dette den første beskrivelse af eBUS-TBNA prøver som platform for generering af PDX linjer. Da SCLC langt mere almindeligt præsenterer som intra-thorax lymfadenopati eller mediastinal masse, kan eBUS-TBNA potentielt give engraftable prøver fra næsten alle patienter, og dermed dramatisk udvide potentialet for præklinisk modellering i denne sygdom. Manglerne ved PDX modeller, især manglen på et værtens immunsystem, er godt beskrevet [5] – [7]. Ikke desto mindre er stigende brug af disse modeller drevet af beviser for, at PDX linjer bevarer centrale elementer i den primære tumor, der er uigenkaldeligt tabt i konventionelle vævskultur [4] – [7]. For eksempel, SCLC PDX linjer ikke reagerer på enkeltstofbehandling terapi med BCL2 antagonisten ABT737 i modsætning til xenograftmodeller fremstillet af konventionelle SCLC cellelinjer [26]. Vore data viser nu, at SCLC PDX linjer stammer fra eBUS-TBNA fastholde de karakteristiske træk ved den primære tumor.

En løbende bekymring med hensyn til PDX-modeller er deres evne til at opretholde genotypen af ​​den primære tumor. I betragtning af de relativt små antal celler opnået fra eBUS-TBNA prøver, vi er i stand til at afgøre, om PDX genotypen repræsenterer en udvidelse af en mere aggressiv subklon baseret på den genomiske heterogenitet model [27], [28]. Selvom vores data viser klart, at velbeskrevet driver mutationer er bevaret i vores eBUS-TBNA PDX linjer i mindst 2 passager, uoverensstemmelse i afsløring af flere mutationer antyder, at processen med xenografting kan selektere for genetisk forskellige subkloner afledt fra højt heterogene delprøver . I gang sag (LX105), en mutation i

RB1 ​​

blev set kun i PDX linje, hvilket indikerer, at nogle xenograft linjer kan være mere nyttigt som stand alone modeller, snarere end som identiske kopier af patientens oprindelige tumor.

mængden og kvaliteten af ​​DNA tilgængelig fra eBUS prøven giver mulighed for detaljeret, høj dybde sekventering analyse i modsætning de mere begrænsede sammenligninger, der kan gøres mellem cirkulerende tumorceller og afledte PDX linjer [25]. Interessant prøven, der genererede PDX linje LX109, der voksede op som en LCNEC tumor, manglede mutationer almindeligvis ses i SCLC, tyder på, at molekylær analyse af eBUS-TBNA prøver kan føje til præcisionen af ​​konventionelle patologiske og cytologiske kriterier. Da strukturelle varianter i gener såsom

MYC

,

MitCN

SOX2

er godt beskrevet i SCLC [23], [24], vores tilgang til generering PDX linjer fra eBUS-TBNA prøver kunne også fungere som en platform for mere intensiv forhør ved hjælp WGS analyse for at bestemme virkningerne af xenografting på kromosomal ustabilitet i SCLC.

Vores resultater også fremhæve potentialet for eBUS-TBNA prøver som en kilde til høj kvalitet DNA for molekylær patologi analyse. Flere grupper har vist retrospektiv analyse af faste eBUS-TBNA prøver kan anvendes til at identificere klinisk handlingsrettede mutationer i lungecancer [29] – [33], og at høj kvalitet DNA, kan opnås RNA og protein fra disse prøver [34] , [35]. Vores data udvide disse undersøgelser ved at demonstrere, at frisk isolerede eBUS-TBNA prøver kan generere høj kvalitet DNA egnet til massivt parallelle målrettet re-sekventering, som undgår formalin artefakt, og som kan kontrolleres omhyggeligt for stromale artefakt.

Vi har vist, at i SCLC, eBUS-TBNA er en praktisk og minimalt invasiv teknik, der kan generere høj kvalitet DNA for næste generation sekventering, og kan anvendes som en kilde til levedygtige tumorceller, indpodes i immundefekte mus med ekstremt høj effektivitet. Desuden er disse transplantater bibeholder vigtige elementer i den primære tumor, herunder mutationer der er karakteristiske for SCLC. Disse data tyder på, at eBUS-TBNA er en teknik, hvorigennem respiratoriske læger og thorax kirurger kan generere prøver, der kan danne grundlag for ny præklinisk forskning, og i sidste ende, handlingsrettede molekylær diagnostik i SCLC og andre intra-thorax maligniteter.

Støtte oplysninger

figur S1.

Funktioner af prøven LX109 og dens afledte xenograft. A. Diff-Quick farvede cytologi udstrygning af diagnostisk eBUS-TBNA prøve. Scale bar = 15 um. B. Diff-Quick farvede cytologi udstrygning af eksperimentel eBUS-TBNA prøve. Scale bar = 15 um. C. Hematoxylin og eosin farvede afsnit af den diagnostiske celleblok. Scale bar = 30 um. D. Diagnostic celleblok farvet for CD56. Scale bar = 30 um. E. Hematoxylin og eosin farvede sektion af derivatet xenotransplantat. Scale bar = 300 um. F. Hematoxylin og eosin farvede sektion af derivatet xenotransplantat. Scale bar = 30 um. G. sektion af det afledte xenograft farvet for CD56. Scale bar = 30 um. H. sektion af det afledte xenograft farvet for TTF1. Scale bar = 30 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0106862.s001

(TIF)

tabel S1.

Oversigt over kortlægning statistik over NGS eksperimenter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0106862.s002

(DOC)

tabel S2.

Funktionelt signifikante varianter deles mellem delprøve og xenograft

doi:. 10,1371 /journal.pone.0106862.s003

(DOC)

File S1.

Ufiltreret variant opkald på tværs af alle prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0106862.s004

(XLS)

anerkendelser

Forfatterne takker australske Cancer Research Foundation Center for Cancer Genomisk Medicin for dets støtte og teknisk bistand.