PLoS ONE: HPV16 oncoproteiner Fremme livmoderhalskræft invasiv ved opregulering Specifik Matrix Metalloproteinases

Abstrakt

Produktion af matrixmetalloproteinaser (MMP’er) for nedbrydning af ekstracellulær matrix er et afgørende skridt i kræft metastaser. Vi undersøgte effekten af ​​HPV 16 oncoproteiner (16E6, 16E6 * I og 16E7), enten individuelt eller kombineret, på transskription af 7

MMP

s impliceret i livmoderhalskræft invasiv. Niveauerne af 7

MMP’er

indberettet øges i livmoderhalskræft blev bestemt i C33A stabilt udtrykker forskellige HPV16 oncoproteiner hjælp kvantitativ RT-PCR og sammenlignet med invasion evne cellelinjer med

in vitro

invasion og sårheling assays. Overekspression af

MMP-2

og

MT1-MMP

blev påvist i HPV16E6E7 udtrykker celler, som korrelerede med øget celle invasion. Kombination af HPV oncoproteiner altid viste større virkninger end sin individuel form. Inhibering af celleinvasion ved anvendelse af en specifik MMP-2-inhibitor, OA-Hy, og anti-MT1-MMP-antistof bekræftede, at invasion i disse celler var afhængig af både MMP-2 og MT1-MMP-ekspression. Udtømning af HPV16E6E7 af shRNA-medieret knock-down eksperimenter resulterede i nedsat MMP-2 og MT1-MMP udtryk niveauer samt reduceret invasion evne, som stærkt antyder specifikke effekter af HPV oncoproteiner på begge MMP og på celle invasion. Immunhistokemi studie i invasive livmoderhalskræft bekræftede den forbedrede

in vivo

udtryk for disse to MMP’er i HPV16-inficerede celler. Desuden brancher kræves af HPV16E6E7 på

MMP-2

og

MT1-MMP

initiativtagere blev undersøgt og PEA3 (ved -552 /-540 til

MMP-2

, -303 til

MT1-MMP

) og Sp1 (ved -91 til

MMP-2,

-102 til

MT1-MMP

) bindingssteder blev vist til være afgørende for mediering af deres transaktiveringsaktivitet. Afslutningsvis vores undersøgelse viste, at HPV16E6 og E7 oncoproteiner samarbejde om at fremme livmoderhalskræft invasionsevne ved specifikt opregulering

MMP-2

og

MT1-MMP

transkription på en lignende måde.

Henvisning: Kaewprag J, Umnajvijit W, Ngamkham J, Ponglikitmongkol M (2013) HPV16 oncoproteiner Fremme livmoderhalskræft invasiv ved opregulering Specifikke matrixmetalloproteinaser. PLoS ONE 8 (8): e71611. doi: 10,1371 /journal.pone.0071611

Redaktør: Nikos K. KARAMANOS, University of Patras, Grækenland

Modtaget: Februar 28, 2013; Accepteret: 1 juli, 2013; Udgivet: 13 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Kaewprag et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning arbejde blev støttet af det Naturvidenskabelige Fakultet og Medicinsk Scholars Program, Mahidol University, Thailand og National Research Council of Thailand. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Vedvarende infektion med human papillomavirus højrisikogruppen (HPV) er den vigtigste årsag til livmoderhalskræft, som er den anden mest almindelige kræftform i thailandske [1] kvinder. HPV16 opdages oftest og tegner sig for mere end 50% af tilfældene af livmoderhalskræft på verdensplan [2]. Carcinogenese grund HPV16 tilskrives de virale oncoproteiner, E6 og E7, via deres samarbejde med værten cellulære proteiner involveret i cellecyklusregulering resulterer i celletransformation og immortalisering [3]. HPV16E7 (16E7) binder til cellecyklus-protein pRb, som efterfølgende udsættes for nedbrydning via en proteasom-medieret proces [4], mens HPV16E6 (16E6) interagerer med og inducerer proteasom-medieret nedbrydning af p53 [5]. Både E6 og E7 oncoproteiner er også i stand til at modulere transkriptionen af ​​flere værtsgener. Eksempler indbefatter 16E6-afhængige opregulering af den katalytiske underenhed af human telomerase revers transkriptase (

hTERT

) og transformerende vækstfaktor β (

TGFp

gener gennem specifikke Sp1 bindingssteder [6], [7 ] og forøget ekspression af DEK proto-onkogen, der koder for et senescens inhibitor, ved E7 gennem en pRb familie protein afhængige vej [8]. Ud over at producere fuld-længde E6 (16E6F), HPV16 genererer også en trunkeret form af E6 (16E6 * i), som fremmer Dlg proteinnedbrydning [9] og transaktivering af aldo-keto reductase-genet [10].

rolle virusproteiner på tumorindtrængen blev først bemærket i en undersøgelse, som viser i hepatom cellelinie den evne af hepatitis B virus (HBV) X-protein til at inducere ekspression af matrixmetalloproteinaser MMP-2 og MT1-MMP (MMP-14), via en Cox 2-afhængig mekanisme [11]. MMP’er tilhører en familie af zink-proteaser, der er ansvarlige for nedbrydning af ekstracellulær matrix, som er påkrævet for migration og metastase af cancerceller [12]. Nylige undersøgelser har indikeret en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​MMP og HPV i livmoderhalskræft [13], [14]. Forhøjede ekspressionsniveauer af en række MMP’er (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MT1-MMP og MMP -15) er blevet rapporteret i invasive cervikale carcinomer i forhold til normale væv [15] – [17]. Men en sammenhæng mellem HPV oncoproteiner og MMP typer forbliver kontroversiel. Smola-Hess

et al

. viste, at keratinocytter, der blev transformeret af HPV16 og HPV8 induceret ekspression af MT1-MMP [14]. I en nyere undersøgelse, blev den forhøjede HPV16E7 udtryk vist at associere med en stigning i pro-MMP-9-aktivitet i organotypisk kultur af keratinocytter dog, HPV16E6 /E7 havde ingen effekt på MMP-2, -9 og MT1-MMP niveauer i humane forhud keratinocytter [18]. Selv om der er observeret overekspression af flere typer af MMP i livmoderhalskræft væv, steg kun niveauer af MMP-2 og MMP-9 viste sig at korrelere med dårlig prognose hos patienter [16]. Desuden har et forhold mellem

MMP-2

mRNA-niveauer og livmoderhalskræft invasionsevne blevet påvist [19]. Aktivering af både MMP-2 og MT1-MMP blev fundet i squamous cervikale carcinomer [16] og dannelsen af ​​den aktive form af MMP-2 viste sig at kræve aktivering ved MT1-MMP [20]. Dette krav støttes af påvisningen af, at MT1-MMP er i stand til at spalte MMP-2 til dannelse af en pro-MMP-2 /MT1-MMP /TIMP-2-komplekset, hvilket forbedrer koncentrationen af ​​aktiv MMP-2 ved den forreste kant af invaderende cancerceller [21]. Selv om en række MMP har overlappende aktiviteter på en tilsvarende gruppe af substrater, vises regulering af deres udtryk niveauer, der skal uafhængigt reguleret.

MMP-2

er konstitutivt udtrykkes i mange celletyper, mens cytokiner regulere

MMP-9

transskription [22] og regulering af

MT1-MMP Hotel (konstitutiv eller induceret ) er fortsat uklar [14].

i denne undersøgelse analyserede vi evne oncoproteiner fra højrisiko-HPV 16 og HPV18 til transkriptionelt regulere 7 typer af

MMP

s

(MMP- 1, -2, -7, -9, -10, -11

MT1-MMP)

at korrelere MMP udtryk med celle invasion i livmoderhalskræft cellelinjer. Derudover blev disse resultater sammenlignet med dem opnået fra biopsier af invasiv stadium livmoderhalskræft. Vi spekulerede at HPV oncoproteiner højrisiko opreguleret bestemte typer MMP’er i livmoderhalskræft celler på det transkriptionelle niveau.

Materialer og metoder

Etik Statement

Humane vævsprøver anvendes i denne undersøgelse blev opnået med skriftligt informeret samtykke fra patienterne eller deres pårørende. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité af National Cancer Institute, Thailand (EF 236/2011).

plasmidkonstrukter og stabilt transficerede cellelinjer

HeLa, SiHa, Caski (venligst stillet til rådighed af P . Chambon, IGBMC, Frankrig) og C33A (ATCC: HTB-31) cervikale cancercellelinier og en human embryonal nyre 293T cellelinie (venligt tilvejebragt af P. Angeletti, University of Nebraska Lincoln, USA) blev holdt ved 37 ° C under en atmosfære af 5% CO

2 i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin cocktail (GIBCO, Invitrogen). HPV 16 onkogen cDNA, nemlig 16E6 (indeholdende både 16E6 * I og 16E6F), 16E6 * I, 16E7, 16E6E7 (både 16E6 og 16E7) og 16E6 * IE7 (både 16E6 * I og 16E7) fremstillet fra SiHa celler og cDNA af HPV18E6E7 (både 18E6 og 18E7) ​​blev fremstillet fra HeLa-celler. Alle cDNA’er blev indsat i pcDNA3-vektoren, og C33A celler, der stabilt udtrykker HPV-proteiner blev dannet og opretholdt som tidligere [10] beskrevne. To korte hårnål (sh) RNA-konstruktioner (shE6A og shE6B) indeholdende komplementære oligonukleotider udformet til silencing HPV16E6 mRNA [23] og ikke-målrettet negativ kontrol shRNA (shCtrl) blev klonet ind pSUPER.retro.puro (OligoEngine). Promoter konstruktioner blev genereret ved at forstærke DNA sekvenser -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 og -211 /+ 40 i

MMP-2

promotor og -1277 /+ 187, -425 /+ 187 og -151 /+ 187

MT1-MMP

promotor fra C33A celler og indsat i plasmid pGL3-Basic (Promega). Følgende primere; -1721 /+ 40

MMP-2

fremad primer 5’GAGTGCTCGAGGATCAGGCTGAAGGGCCTGG 3 ‘, -1001 /+ 40

MMP-2

fremad primer 5’GAGTGCTCGAGGAATTCGTGGAACTGAGGG 3′, -211 /+ 40 MMP -2 forward primer 5’GAGTGCTCGAGCGAGAGAGGCAAGTGGGG 3 ‘,

MMP-2

reverse primer 5’CCTGAAAGCTTCTGGATGCAGCGGAAACAA 3′, -1277 /+ 187

MT1-MMP

fremad primer 5’CACCTCGAGGGAGGCTCCACAGGACCTGAAA 3 ‘, – 425 /+ 187

MT1-MMP

fremad primer 5’CCACTCGAGTCCCACACTCTGAGCTCCTCGTT 3 ‘, -151 /+ 187

MT1-MMP

fremad primer 5’TTGCTCGAGGGCTAAAACAACCACGTCCCCA 3′ og

MT1-MMP

reverse primer 5 ‘CCGGGAAGCTTGGGCACTGTGGGCTCCGC 3’ blev anvendt.

revers transkription (RT) -PCR og kvantitativ PCR (qPCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler med ILLUSTRA ™ RNAspin Mini kit (GE Healthcare) og anvendt som template til cDNA-syntese under anvendelse SuperScript®III RNaseH

-Rt Kit (Invitrogen). qPCR blev udført ved hjælp af Stratagene Mx3000P qPCR-system (Agilent Technologies) sammen med RBC ThermOne® Real-Time Premix (SYBR Green). Termocykliseringsbetingelser for både qPCR og RT-PCR var som følger: 10 minutter ved 95 ° C; (40 cykler for RT-PCR), 30 sek ved 95 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C og 30 sek ved 72 ° C. Bestemmelse af hypoxanthin-guanin phosphoribosyltransferase (

HPRT

) housekeeping genekspression blev inkluderet i hvert forsøg for at korrigere for variationer i skabelon-koncentrationer. Mængderne af PCR amplikoner blev analyseret under anvendelse Gel Doc 2000 og Mængde One softwarepakke (Bio-Rad). De anvendte primersæt til forstærkning af HPV16E6 /E7,

MMP

,

TIMP-2

og intern kontrol

HPRT

cDNA er blevet beskrevet tidligere [10], [24] , [25]. Relative ekspression præsenteres som middelværdi ± S.E.M af tre uafhængige forsøg udført in duplo.

gelatinezymografi

Gelatinaseaktivitet af MMP-2 blev vurderet ved anvendelse gelatinezymografi som tidligere beskrevet [26]. C33A stabilt udtrykker forskellige oncoproteiner blev inkuberet i serumfrit medium i 48 timer inden analyse. Efter at være blevet koncentreret ved anvendelse af en Amicon® Ultra-0,5 centrifugal filterindretning (Millipore), ens mængder af totalt protein i det brugte medium fra hver cellelinje blev blandet med ikke-reducerende prøvebuffer (2% SDS, 10% glycerol, 62,5 mM Tris HCI pH 6,8 og 0,01% bromophenolblue) og kørt på en 7,5% polyacrylamidgel indeholdende 1 mg /ml gelatine (Sigma). Efter elektroforese blev gelerne renatureret ved vask med 2,5% Triton X-100 to gange i 30 min. De klare bånd af hydrolyseret substrat blev udviklet ved inkubering i udviklingen puffer (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 10 mM CaCI

2, 1 pM ZnCl

2, 0,02% NaN

3 og 1% Triton X -100) ved 37 ° C i 18 timer og farvet med 0,025% (vægt /volumen) Coomassie blue R250 i 1 time. Den gelatinolytiske aktivitet af MMP bånd blev kvantificeret ved densitometrisk analyse (Mængde One program, Gel Doc 2000-systemet, Bio-Rad, USA) og præsenteret som fold forøgelse af den samlede MMP-2 (pro-MMP-2 (72 kD) og aktiv MMP-2 (68 kD)) sammenlignet med kontrol pcDNA3 cellerne ved 48 h.

In vitro

invasion Assay

In vitro

invasion assays blev udført i et Transwell kammer overtrukket på det øvre kammer med 30 ug Matrigel® (BD Bioscience). Celler (2 x 10

5) i serum-frit medium podedes på det øvre kammer og DMEM indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer. For inhiberingsassays blev cellerne (10

4 for SiHa og 5 × 10

4 for 16E6E7) behandlet med forskellige koncentrationer (0, 2, 5, 10 eller 20 uM) af MMP-2-inhibitor,

cis

-9-Octadecenoyl-N-hydroxylamide; OA-Hy (Calbiochem), eller med 20 ug /ml anti-MT1-MMP-antistof (ab78738, Abcam) i det øvre kammer med 1% FBS i SiHa og 2% FBS til 16E6E7 i det nedre kammer. Efter inkubation i 24 timer (eller 12 timer i inhiberingsassays) for 16E6E7 og 12 timer (eller 7 timer i inhiberingsassays) for SiHa blev celler i det nedre kammer fikseret med 4% paraformaldehyd og farvet med 0,5% krystalviolet. Invasion aktivitet blev bestemt ved at tælle antallet af invaderede celler i fem tilfældige felter og resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM af farvede celler i forhold til kontrollerne, køretøjet eller den ikke-targeting shRNA plasmid eller ubehandlede celler.

Sår Healing Assay

Celler blev dyrket indtil sammenløb og en kunstig sår blev genereret ved hjælp af P-200 pipettespids. DMEM indeholdende 100 ug Matrigel® (BD Bioscience) blev tilsat til cellerne og får lov at polymerisere i 15 minutter. Antallet af celler, der migrerer ind i den ridset region blev talt ved 0 og 48 timer efter inkubation og rapporteres som procent celler i ridset region i forhold til at styre celler.

luciferaseaktiviteten Assay

C33A celler, der udtrykker HPV16E6E7 blev transient transficeret med pGL3-Basic luciferase vektorkonstruktioner indeholdende

MMP-2

og

MT1-MMP

promotorer som beskrevet ovenfor. Transficerede celler blev lyseret og analyseret for luciferaseaktivitet som rapporteret tidligere [10].

Western blot-analyse

C33A celler, der udtrykker HPV16 oncoproteiner blev lyseret i Lysis-M-reagens, EDTA-fri, med komplet Protease Inhibitor Cocktail (Roche). Proteinerne blev separeret på 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Efter blokering med 10% fedtfri tørmælk i PBST, blev membranerne inkuberet med muse-anti-p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology ved 1:5,000), muse-anti-MT1-MMP (ab78738, Abcam på 1:1,500 ), muse-anti-TIMP-2 (ab1828, Abcam på 1:1,000) eller muse-anti-GAPDH (sc-166.574, Santa Cruz Biotechnology ved 1:2,000) antistoffer ved 4 ° C natten over efterfulgt af inkubation med et sekundært HRP konjugeret fåre anti-mus IgG (GE healthcare) (1:3,000) i 2 timer ved stuetemperatur. Resultaterne blev visualiseret ved anvendelse af Pierce ECL-systemet (Thermo Scientific), med GAPDH som en loading kontrol. Proteinniveauer blev kvantificeret under anvendelse af densitometri (Mængde One program, Gel Doc 2000-systemet, Bio-Rad), og resultaterne er præsenteret som fold forøgelse af protein (både pro- og modne former) sammenlignet med vehikel kontrollen efter normalisering mod GAPDH.

Fluorescent Immunhistokemi

Alle kliniske undersøgelse er blevet udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og god klinisk praksis. Paraffin vævssnit fra 26 invasive cervikale carcinomer, tre cervikal intraepithelial neoplasi (en hver af CIN 1, CIN 2 og CIN 3) og en adenomyose blev opnået fra National Cancer Institute (NCI), Thailand. Alle væv blev analyseret ved NIC patologer og anonymiseret inden de forelægges for undersøgelsen. Antigener blev hentet ved mikrobølgeopvarmning prøverne i Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-base pH 9,0, 1 mM EDTA, 0,05% Triton X-100) i 5 minutter og endogen peroxidaseaktivitet blev inhiberet ved behandling med 3% H

2O

2 i 10 min. Fluorescerende immunohistokemi blev udført ved inkubering 4 ° C natten over med primært muse-anti-MMP-2 og anti-MT1-MMP monoklonale antistoffer (42-5D11 og 114-6G6 henholdsvis; Chemicon) i en 1:100 fortynding efterfulgt af inkubering med sekundære Alexa Fluro 647-mærket gede-anti-muse-IgG-antistof (1:400 fortynding Invitrogen). Hoechst 33258 (1:1,000 fortynding Invitrogen) blev anvendt til nuklear farvning. Snit blev monteret med Vectashield® anti-fade medium (Vector Laboratories) og fluorescerende signaler måltes under anvendelse af et Olympus FV1000 konfokalt mikroskop udstyret med ImageJ software. MMP-2 og MT1-MMP-ekspression blev bedømt som positive eller negative efter subtraktion med baseline kontroller uden primært antistof behandling, som giver antallet af farvede celler af ≥1% eller 0% hhv.

Resultater

Virkninger af HPV og HPV oncoproteiner om

MMP

Expression og invasion evne

invasion evne for livmoderhalskræft cellelinjer huser HPV genomet (SiHa med HPV16, Caski med HPV 16 og HeLa med HPV18) blev sammenlignet med HPV-negative C33A og 293T celler. Alle HPV-positive cellelinier tydeligt viste en evne til at invadere, mens invasiv af HPV-negative cellelinjer var minimal (fig. 1A). Højere invasion evne blev observeret med SiHa (5000 celler) og HeLa (11.000 celler) sammenlignet med Caski-celler (2.500 celler) (fig. 1a). Ekspressionsniveauerne målt ved hjælp qPCR af 7

MMP

s (

MMP-1, -2, -7, -9, -10, -11

og

MT1-MMP)

i disse fem cellelinjer viste en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​HPV og en stigning i

MMP

udskrifter kun

MMP-2

,

-7

MT1-MMP

(fig. 1B). Opregulering af

MMP-2

ekspression var stærkt påvist i både HPV16- og HPV18-positive celler sammenlignet med HPV-negative celler, med den højeste aktivitet i HPV18-positive HeLa-celler.

MMP-7

og

MT1-MMP

transkriptniveauer blev forøget betydeligt i HPV16-positive SiHa og Caski celler, men kun lidt forhøjet i HeLa-celler (fig. 1B). Men der var ingen forhøjelse af

MMP-10

-11

udskrifter i enhver HPV-positive celler (fig. 1B). Disse resultater indikerer, at ekspressionen af ​​

MMP-2

,

-7

og

MT1-MMP

er mere tilbøjelige til at forekomme i celler, der indeholder HPV, især HPV16.

(A) Kvantificering af invasion under anvendelse migration gennem filtre overtrukket med Matrigel for HPV positive (SiHa, Caski og HeLa) og negative (C33A og 293T) celler fremstående som antallet af indtrængende celler. (B) Relativ udtryk for

MMP-1

,

-2

,

-7

,

-9

,

-10

,

-11

og

MT1-MMP

målt i cellelinjer hjælp qPCR. Data blev normaliseret til C33A. *:

s

-værdi 0,05 i forhold til C33A. (C) Relativ udtryk for

MMP-2, -7

MT1-MMP

i C33A celler stabilt udtrykker forskellige HPV 16 (

16E6, 16E6F, 16E6 * I, 16E7, 16E6E7

,

16E6 * IE7

), HPV 18

(18E6E7)

og lav risiko HPV6

(6E6)

oncoproteiner som målt ved qPCR og normaliseret til pcDNA3. *

s

-værdi 0,05 sammenlignet med pcDNA3 udtrykkende celler. (D) Niveauet for HPV transkripter sammenlignet med kontrollen, HPRT, i hver cellelinje som vist ved RT-PCR. (E) P53 nedbrydning aktivitet af 16E6, 16E7 og 16E6E7 blev sammenlignet ved Western blot analyse. GAPDH blev anvendt som lastning kontrol.

For at undersøge forholdet mellem høj ekspression af

MMP-2, -7

MT1-MMP

og HPV oncoproteiner, qPCR blev ansat til at overvåge

MMP

transkriptniveauer i C33A celler stabilt udtrykker 16E6, 16E6F, 16E6 * i, 16E7, 16E6E7, 16E6 * IE7, 18E6E7 og (lav risiko) HPV6E6. 16E6F, 16E6 * I og 16E7 var i stand til at fremkalde en stigning i

MMP-2

,

MT1-MMP

men ikke

MMP-7

udskrifter, i forhold til pcDNA3- transficerede kontrolceller (fig. 1C). C33A celler, der udtrykker 16E6 * jeg viste den laveste

MMP-2

og

MT1-MMP

udskrifter blandt de testede HPV16 oncoproteiner. I celler, der udtrykker 16E6F og 16E6 * I (dvs. 16E6-udtrykkende celler) eller 16E6 * I og 16E7 (dvs. 16E6 * IE7-udtrykkende celler) eller 16E6F, 16E6 * I og 16E7 (dvs. 16E6E7-udtrykkende celler) der var betydelige stigninger i

MMP

s udskrifter, især dem af

MMP-2

og

MT1-MMP

(fig. 1C). Men i C33A celler, der udtrykker 18E6E7, transkriptniveauer af

MMP-2

,

MMP-7

og

MT1-MMP

ikke var forskellige fra dem i pcDNA3 udtrykkende celler, og som forventet var der ingen ændringer i

MMP

udskrifter i lav risiko HPV6E6 udtrykkende celler i forhold til pcDNA3 udtrykkende celler. Disse resultater viser tydeligt, at HPV16 men ikke HPV18 oncoproteiner specifikt øge ekspressionen af ​​

MMP-2

og

MT1-MMP

, men ikke af

MMP-7

. Niveauerne af HPV16 onkogen transkripter i C33A celler som vist ved RT-PCR i fig. 1D viste, at

MMP

fremkalde aktivitet korreleret mere med typer, men ikke doseringen af ​​HPV oncoproteiner. De funktionelle aktiviteter af HPV oncoproteiner i nedværdigende p53 proteiner blev også demonstreret i 16E6, 16E7 og 16E6E7 udtrykkende celler (fig. 1E).

invasiv, Gelatinaseaktivitet og MMP Expression i C33A celler, der udtrykker HPV16 oncoproteiner

Vi yderligere besluttet, om stigninger i

MMP-2

og

MT1-MMP

udskrifter udslag i forbedret invasionsevne af HPV16-onkogen udtrykkende celler udnytter både

in vitro

invasion ( fig. 2A) og sårheling analyser (fig. 2B). HPV16 oncoprotein udtrykker C33A var mere invasive i begge assays end kontrol HPV6E6 udtrykke og pcDNA3-transfekterede C33A, med celler, der udtrykker en kombination af E6F, E6 * I og E7 (16E6E7) har den højeste invasion kapacitet (fig. 2A og B). Da disse celler er steget

MMP-2

og

MT1-MMP

transkripter, de blev udsat for gelatinezymografi hjælp lige så stor mængde af proteiner (30 ug) for at bestemme, om forhøjet MMP-aktivitet var til stede. Medium fra alle C33A celler viste tilstedeværelse af en gelatinase, svarende til pro-MMP-2 (~72 kD) og MMP-2 (~62 kD) [14], med mere intense MMP-2 kategorier stede i celler, der udtrykker 16E6, 16E6 * IE7 og 16E6E7 (fig. 2C). Celler, der indeholder lavrisiko-HPV6E6 viste lignende gelatinaseaktivitet til kontrollen pcDNA3 indeholdende celler (data ikke vist). Gelatinen lysis bånd i gelatine zymographies er blevet konstateret ved tilsætning af 5 mM dinatrium EDTA, en gelatinase inhibitor, i reaktionsmediet og kører på en separat gel. Forsvinden af ​​de forventede Zymografisk bands bekræftet gelatinaseaktivitet af disse lysis bånd (data ikke vist). Det er værd at bemærke, at den kombinerede forekomst af 16E6 * I og 16E6F i 16E6 forbedrer aktive MMP-2 niveauer sammenlignet med celler, der udtrykker 16E6F eller 16E6 * Jeg alene (Fig. 2A, 2B, 2C), hvilket tyder på en additiv virkning mellem de to former af E6 at stimulere

MMP-2

udtryk og dermed fremme celle invasion. Protein- niveauerne af MT1-MMP i disse celler blev også bestemt ved Western blot analyse under anvendelse af anti-humant MT1-MMP-antistof med GAPDH som en kontrol. Den gange forøgelse af MT1-MMP-ekspression blev beregnet ud fra den samlede MT1-MMP (pro-MT1-MMP og MT1-MMP) med vektoren kontrol indstillet som 1. Som vist i fig. 2D, alle celler, der indeholder HPV16 proteiner udtrykkes både pro- (~66 kD) og moden MT1-MMP (~57 kD) med den største band intensiteten af ​​pro-MT1-MMP i 16E6E7 (2,5 ×, total MT1-MMP) og af modent MT1-MMP i 16E6 (2.3 ×, total MT1-MMP), mens vektoren kontrol viste kun den pro-MT1-MMP. Disse observationer afslørede, at invasivitet af HPV16 oncoprotein udtrykkende celler korrelerede med MMP-2-aktivitet og MT1-MMP-ekspression. Salg

(A)

In vitro

invasion og (B) sårheling assays for C33A celler, der udtrykker forskellige HPV16 oncoproteiner. (C) En repræsentant gelatine Zymografisk gel viser MMP-2-aktivitet normaliseret med lige store mængder af lastning protein (30 ug). Bånd svarende til den gelatinolytiske aktivitet af MMP-2 blev kvantificeret ved densitometrisk analyse og sammenlignes med dem, der opnås fra kontrolprøver pcDNA3 udtrykkende celler. (D) Western blot-analyse af MT1-MMP anvendelse af anti-MT1-MMP-antistof (ab78738) ved 1:1,500 fortynding med GAPDH som ladningskontrol. *

s

-værdi 0,05, **

s

-værdi. 0,01

Effekt på invasiv af HPV16E6 Knock-down Celler

for at bekræfte, at HPV16 oncoproteiner forårsage opregulering af

MMP-2

og

MT1-MMP

udtryk, E6 onkogener i HPV16-positive SiHa celler blev slået ned med to shRNAs (shE6A og shE6B) målretning forskellige steder i 16E6 mRNA [23]. Anvendelse af RT-PCR, niveauer af HPV16E6F, 16E6 * I- og 16E7 transkripter i SiHa-celler viste sig at blive reduceret med -50% efter transfektion med shE6A, hvorimod blev detekteret kun en reduktion 10-30% i celler transficeret med shE6B (fig. 3A). Kun

MMP-2

og

MT1-MMP

men ikke

MMP-7

transkripter blev reduceret i E6 knock-down SiHa celler (Fig. 3B). Når lige store mængder af protein (20 ug) fra det konditionerede medium blev analyseret ved gelatinezymografi blev det observeret, at MMP-2-aktivitet i shE6A-transficerede celler blev faldet i forhold til pSUPER og shCtrl transficerede kontrolceller (fig. 3C). Cellelysater (30 pg protein hver) analyseres ved hjælp af western blots at vurdere MT1-MMP-niveauer med GAPDH som kontrol, afslørede mindre fald (-30% og ~ 40% reduktion i shE6A og shE6B henholdsvis) i MT1-MMP-niveauer i både afsmittende ned celler sammenlignet med shCtrl kontroller (fig. 3D). Interessant MT1-MMP-proteiner detekteret i SiHa-celler var hovedsagelig det modne MT1-MMP (57 kD). I overensstemmelse med disse resultater, både shRNA-transficerede celler, især shE6A, havde signifikant reduceret invasivitet (~48%) og sårheling evne (-50%) sammenlignet med shCtrl celler (Fig. 3e). , Ablation af HPV16E6 /E7 oncoproteiner reducerer således MMP-2-aktivitet, MT1-MMP udtryk og endelig invasiv af HPV16-positive SiHa celler.

(A) RT-PCR af

16E6F, 16E6 * I

og

16E7

udskrifter normaliseret til kontrol,

HPRT

. SiHa-celler transficeret med ikke-målretning shCtrl og vehikelkontrol pSUPER blev anvendt som negative kontroller. shE6A og shE6B er to forskellige shRNAs anvendes i knock-down eksperimenter. (B) qPCR af

MMP-2

,

-7

og

MT1-MMP

udskrifter og (C) MMP-2 aktivitet som analyseret ved gelatinezymografi, med lige mængder protein (20 ug), i shRNA transficerede celler. (D) MT1-MMP-protein i sammenklappede celler som bestemme ved Western blot analyse med GAPDH som ladningskontrol. (E) Invasion evne SiHa celler transficeret med forskellige shRNAs som fastsat af

in vitro

invasion og sårheling analyser. Relativ fold af celleinvasion med ubehandlede celler blev sat som 1 er rapporteret. *

s

-værdi. 0,05 sammenlignet med shCtrl celler

Reduceret invasionsevne af specifikke inhibitorer til MMP-2 og MT1-MMP

For at bestemme om selektiv hæmning af endogen MMP-2 eller MT1-MMP forringe invasion evne, blev både SiHa og 16E6E7 udtrykkende C33A cellelinier behandlet med OA-Hy, en specifik inhibitor for MMP-2, (fig. 4A, 4B) og anti-MT1-MMP, et specifikt antistof for det katalytiske domæne af MT1-MMP (fig. 4C). Vores resultater viste tydeligt, at behandling af OA-Hy resulterede i en signifikant reduktion i celleinvasion for både 16E6E7 (-70% ved 10 uM) (fig. 4A) og SiHa-celler (-65% ved 20 uM) (fig. 4B) på en dosis-afhængig måde. Tilsvarende MT1-MMP-inhibering under anvendelse af specifikke antistof reducerede tydeligt invasivitet (-50%) af begge cellelinier sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 4C). Vores eksperimenter bekræftede, at invasion af HPV16-inficerede celler var afhængig af MMP-2 og MT1-MMP-ekspression. Da det er kendt, at dannelsen af ​​en MT1-MMP /TIMP-2 /pro-MMP-2-komplekset er nødvendig for aktiveringen af ​​pro-MMP-2 ved MT1-MMP på celleoverfladen, niveauerne af TIMP-2 ekspression i alle HPV16 onkoprotein udtrykkende celler blev også undersøgt. Interessant nok blev TIMP-2-ekspression sig at være let forøget både mRNA (-3 ×) og protein (ca. 2 ×) niveauer i alle celler i sammenligning med kontrolgruppen pcDNA3 med undtagelse af lav risiko HPV6E6 som udviste TIMP -2 ekspression sammenlignes med den tomme vektor (fig. 4D). Uanset om HPV oncoproteiner direkte forbedret ekspression af TIMP-2 er endnu ikke fastslået.

(A) Cell invasion som bestemt ved hjælp af

in vitro

invasion og sårheling af HPV16E6E7 udtrykkende celler og (B) SiHa-celler behandlet med forskellige koncentrationer af MMP-2-inhibitor, OA-Hy. (C) Det samme cellelinier blev også behandlet med anti-MT1-MMP-antistof (20 ug /ml). Relativ fold af celle invasion med pcDNA3 køretøj kontrol eller ubehandlede celler sat som en på φ

s

0,05 sammenligne med pcDNA3 og *

s

-værdi 0,05 sammenligne med ubehandlede celler vises. (D) TIMP-2 protein (normaliseret med lige loading protein på 5 ug) blev påvist under anvendelse western blot-analyse med et anti-TIMP-2-antistof (Abcam, 1:1,000 fortynding) og TIMP-2-transkripter blev målt ved qPCR (normaliseret til HPRT) for HPV16 oncoprotein udtrykke celler.

Transcriptional opregulere aktivitet af HPV16 Onkogener på

MMP-2

og

MT1-MMP

Promotor

promoter konstruktioner indeholdende 5′-opstrøms sekvenser, nemlig -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 og -211 /+ 40 fra

MMP-2

promotor og -1277 /+ 187, -425 /187 og -151 /+ 187 fra

MT1-MMP

promotoren fusioneret med luciferasereportergen i plasmid pGL3-Basic blev dannet. Hver konstruktion blev efterfølgende transficeret ind C33A stabilt udtrykker HPV16E6E7. I nærværelse af HPV16E6E7, luciferaseaktiviteten af ​​-1721 /+ 40

MMP-2

konstruktionen blev vist at være sammenlignelig med -1.001 /+ 40 viser 4,6 og 3,9 gange større ekspression end den kontrolceller transficeret med tomme pGL3-Basic vektor eller ca. 2 gange forøgelse af begge promotoraktiviteter sammenlignet med det basale niveau i pcDNA3 udtrykkende celler (fig. 5A). Lignende resultater blev opnået fra

MT1-MMP

promotorkonstruktioner (fig. 5B). Disse resultater tyder på, at sekvenser, der er ansvarlige for at mediere HPV16 oncoproteinaktivitet bør opholde sig -1001 /+ 40 og -425 /+ 187 regioner i

MMP-2

og

MT1-MMP

initiativtagere, hhv. Begge indeholdt PEA-3 (ved -552 og -540 til

MMP-2

og -303 til

MT1-MMP

) og Sp1 (ved -91 til MMP-2 og -102 til

MT1-MMP

) bindingssteder tyder på, at HPV16 oncoproteiner udøver deres transaktiveringsaktivitet gennem disse websteder i en lignende måde. Manglen på p53 og fjernbetjeningen PEA-3 bindingssteder i

MMP-2

promotor og TIE-lignende sekvenser i

MT1-MMP

promotorkonstruktioner indikerede, at disse steder ikke var ansvarlige for at mediere virkning af HPV oncoproteiner. Men de mindste konstruktioner af

MMP-2

promotor (-211 /+ 40), der indeholder en af ​​hver af de Sp1, AP2 og PEA-3 bindingssteder og af

MT1-MMP

promotor (