PLoS ONE: osteoklaster Aktiv i Bone Danner metastaser af prostatakræft Patients

Abstrakt

Baggrund

Bone danner metastaser er en fælles og invaliderende konsekvens af prostatakræft (CaP). Den potentielle rolle osteoklastaktivitet i Cap knoglemetastaser er ikke helt forklaret. I denne undersøgelse undersøgte vi

ex vivo

om osteolytisk aktivitet er til stede, og hvordan det er styret i Cap patienter med knogle danner metastaser.

Metode

Fyrre-seks patienter påvirket af nydiagnosticerede CaP og raske kontroller blev inkluderet. Ved diagnose, 37 patienter havde kun en primær tumor, mens 9 primær tumor og samtidige knogledannende metastaser. Hos alle patienter var der ingen tegn på metastaser til andre ikke-bone sites. For alle patienter og kontroller indsamlede vi blod og urin prøver. Vi vurderede patienternes knoglehomøostase; vi gjort perifert mononukleære blodlegemer (PBMC) kulturer til at detektere

in vitro

osteoklastogenese; vi doseret serum ekspression af molekyler, der er involveret i cancer induceret osteoclatogenesis, såsom RANKL, OPG, TNF-alfa, DKK-1 og IL-7. Ved Real-Time PCR, kvantificeret vi DKK-1 og IL-7 genekspression på mikro-dissekeret tumor og sunde vævssnit.

vigtigste resultater

CaP knogle metastatiske patienter viste knoglemetabolisme forstyrrelser med forøget knogleresorption og dannelse sammenlignet med ikke-bone metastatiske patienter og raske kontroller. Hætten PBMC kulturer viste en forbedret osteoklastogenese i knogle metastatiske patienter, på grund af en stigning på RANKL /OPG-forholdet. Vi har detekteret steg med DKK-1 serumniveauer og væv genekspression i patienter sammenlignet med kontroller. IL-7 resulterede højt i patienternes sera, men dens væv genekspression var sammenlignelig hos patienter og kontroller.

Konklusioner

Vi demonstrerede

ex vivo Hoteller, som osteoklastogenese er en aktiv mekanisme i tumor nesting af knogle danner metastatisk kræft og at serum DKK-1-niveauer øges i Cap patienter, hvilket tyder på at dybt undersøge sin rolle som tumormarkør

Henvisning:. Roato i, D’Amelio P, Gorassini E , Grimaldi A, Bonello L, Fiori C, et al. (2008) osteoklaster Aktiv i Bone Danner metastaser af prostatacancer. PLoS ONE 3 (11): e3627. doi: 10,1371 /journal.pone.0003627

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: September 30, 2008; Accepteret: 15 oktober 2008; Udgivet: November 3, 2008

Copyright: © 2008 Roato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Compagnia di San Paolo og Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2008)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostata cancer (CaP) er den næststørste årsag til kræft dødsfald hos mænd [1]. Et typisk træk ved CaP er evnen til at metastatize til benet, da mere end 80% af mænd, der døde for CaP udviklede knoglemetastaser [2]. Vækst af CaP inden knogle fremmer primært osteoblastiske læsioner med underliggende osteolytiske områder [1]. I fysiologiske betingelser osteoklast (OC) og osteoblastaktiviteten er velafbalanceret, men i patologisk tilstand denne ligevægt (knogler homeostase) er afbrudt. Rolle anvendelsesforhold i osteolytiske metastaser er blevet klart påvist, og det er blevet foreslået, at p-piller kan spille en vigtig rolle i de osteoblastiske metastaser samt. Samspil mellem CaP-celler, osteoblaster og anvendelsesforhold antyder, at knogle tropisme kan være forårsaget af tumor afhængighed af en eller flere osteoblast /OC-afledte faktorer for cancercellevækst og vedligeholdelse [3].

Vi har tidligere vist, at patienter med osteolytiske knoglemetastaser fra forskellige faste tumorer udviste forstærket spontan osteoclastogenese, som følge af forøget T-celle frigivelse af pro-osteoclastogenic faktorer, såsom TNF-alfa, IL-7 og RANKL [4]. Rolle OPG /RANKL akse i osteolytisk komponent i CaP-medierede knoglemetastaser er blevet klarlagt [5], mens TNF-alfa og IL-7 mulige funktioner i Cap knoglelæsioner fortsat uklare.

Andre vigtige faktorer i knogler biologi er WNTs, en familie af små secernerede glycoproteiner, som inhiberer OC differentiering [6], stimulerer osteoblastogenesis og mineraliseringsmiddel aktivitet af osteoblaster [7]. Aktiviteten af ​​WNT familie antagoniseres af adskillige secernerede faktorer såsom dickkopf (kr) proteiner. De seneste data rapporterede DKK-1-ekspression i nogle humant prøvemateriale af tumorer, hvilket tyder på, at en kræft-medieret modulering af WNT aktivitet påvirker den metastatiske fænotype [8], [9].

Dette tværsnit undersøgelse blev designet til at undersøge, hvordan knogledannende metastaser ved CaP påvirker knogleomsætningen, OC dannelse ved perifere mononukleære blodceller (PBMC), og produktionen af ​​osteoclastogenic og anti-osteoclastogenic faktorer hos patienter ramt af knogle metastatisk CaP.

Vi rapporterer en øget osteoklastogenese i CaP bone metastatiske patienter, skyldes en stigning i serum RANKL /OPG-forhold, hvilket tyder på, at øget OC dannelse spiller en aktiv rolle i knogledannende metastaser. Vi har detekteret høj DKK-1 serum niveauer og genekspression i Cap patienter sammenlignet med raske kontrolpersoner.

Resultater

Bone omsætningen øges i knogle metastatiske patienter

De markører for knogle omsætningen var højere hos patienter med knoglemetastaser sammenlignet med ikke-bone metastatiske patienter og raske kontroller (tabel 1). I detaljer, har CaP patienterne ikke signifikante forskelle i knogletæthed, men havde højere PTH, BAP, BGP, TRAPC5b og tværbundet niveauer end raske kontrolpersoner. Disse resultater bekræfter forstyrrelser i knogle homeostase med øget knogleresorption og dannelse i metastatiske patienter.

osteoklastogenese øges i Cap knoglemetastaser

For at vurdere, om forbedring af knogleresorption i metastatisk patienter skyldes en stigning i OC dannelse, vi undersøgte muligheden for

in vitro

PBMC’er til spontant at differentiere i p-piller i patienter med eller uden knoglemetastaser og hos raske kontroller.

The OC differentiering blev påvist ved tilstedeværelsen af ​​flerkernede /TRAP-positive celler fra cancerpatient og raske kontrolpersoner PBMC’er (fig. 1A-C). Som vist i fig. 1D antallet af p-piller var signifikant højere i knogle metastatiske patienter (gennemsnit ± SE, 216,22 ± 39,55) end hos patienter uden knoglemetastaser (112,71 ± 14,76) og hos raske kontroller (73,55 ± 11,69),

s

. 0.001

TRAP-positive flerkernede celler blev identificeret som anvendelsesforhold og talt, i både patienter og raske kontroller kulturer, (A). The OC nummer i knogle metastatiske patienter var signifikant højere end i ikke-bone metastatiske patienter,

s

0,004 og hos raske kontroller,

s

. 0,001 (B)

RANKL /OPG-forholdet øges i metastatisk patienter

for at undersøge de faktorer, der er ansvarlige for den øgede osteoklastogenese i patienter, vi doseret de serumniveauer af TNF-alfa, RANKL og OPG. De TNF-alfa serumniveauer var ikke signifikant forskellig mellem de tre grupper (data ikke vist), mens vi observeret en signifikant forøget forhold RANKL /OPG i knogle metastatisk sera (19.62 ± 6.52) sammenlignet med ikke-metastatiske patienter (5,48 ± 2,48) og raske kontroller (6,89 ± 2,6),

s

. 0,03

IL-7 serum niveauet sættes op i kræftpatienters

Vi målte IL-7 serumniveauer i patienter og kontroller. Serum IL-7 niveauer var signifikant højere i knogle metastatiske patienter (middelværdi ± SE, 19,86 ± 2,01 pg /ml) end hos raske kontroller (7,07 ± 1,27 pg /ml), s 0,001. Vi doseret sammenlignelige IL-7 niveauer i ikke-knogle metastatisk (19,75 ± 3,55 pg /ml) og knogle metastatiske patienter (19,86 ± 2,01 pg /ml), (fig. 2A). Dette resultat førte os til at undersøge, om tumorceller var ansvarlige for stigningen af ​​IL-7 produktion; derfor undersøgte vi kvantitative IL-7-ekspression i CaP og raske prostata væv. Tumor celler udtrykte lave og sammenlignelige niveauer af IL-7 i patienter og raske kontroller (fig. 2B). Dette antyder, at den forøgede cirkulerende IL-7 kan afhænge af produktionen af ​​immunsystemet celle, såsom T- og B-lymfocytter [4].

IL-7 serumniveauer hos patienter med /uden knoglemetastaser og i raske kontroller blev målt ved ELISA. Bone metastatisk (

s

0,01) og ikke-bone metastatiske patienter (

s

0,03) havde signifikant højere IL-7 serumniveauer sammenlignet med raske kontroller (A). CaP og sunde væv blev analyseret af Real-Time PCR for at kvantificere IL-7 genekspression. IL-7-kvantisering blev udtrykt som IL-7 på β-Actin (kontrol genet) plasmidkopiantal. Histogrammet viste sammenlignelige IL-7-ekspressionsniveauer i CaP og sunde væv.

DKK-1-ekspression er højere i Cap patienter

Litteratur data rapporteret, at DKK-1 er involveret i knogle homøostase [8]. Vi doseret DKK-1-serum niveau i Cap-patienter og raske kontrolpersoner. CaP patienter viste højere DKK-1-niveauer end raske kontrolpersoner,

s

0,004 (. Figur 3A). For at vurdere, hvorvidt DKK-1 produceres af kræft væv, studerede vi dens udtryk på CaP og sunde væv ved RQ-PCR. Vores data viste, at CaP væv udtrykte betydeligt mere DKK-1 end sundt væv, p. 0,001 (. Figur 3B)

DKK-1-niveauer blev doseret i serum patienter med /uden knoglemetastaser og hos raske kontroller ved ELISA. Bone metastatisk (

s

0,004) og ikke-bone metastatiske patienter (

s

0,01) havde signifikant højere DKK-1 serumniveauer sammenlignet med raske kontroller (A). CaP og sunde væv blev analyseret af Real-Time PCR for at kvantificere DKK-1gene udtryk. Det kr-1 kvantisering blev udtrykt som kr-1 på β-actin (kontrol-gen) plasmidkopiantal. Histogrammet viste højere DKK-1 ekspressionsniveauer i CaP end hos raske væv,

s

. 0,001 (B)

Diskussion

Prostatakræft ofte udvikle knogledannende metastaser; ikke desto mindre en rask osteolytisk aktivitet er til stede i metastatisk sammenlignet med ikke-metastatiske patienter [10]. De mekanismer, hvorigennem CaP fremmer afvigende knogle remodellering er ikke klart defineret. Offentliggørelse af tumor indlejring i knogler kan give nye værktøjer til en tidlig diagnose af knoglemetastaser og foreslå nye terapeutiske regimer til bekæmpelse af CaP progression. Formålet med vores undersøgelse var at undersøge, hvordan osteolytisk bestanddel af knoglemetastaser påvirker knogleomsætningen, OC dannelse af PBMC, og produktionen af ​​osteoclastogenic og anti-osteoclastogenic faktorer i patienter med knogle metastatisk CaP.

I udvælgelse af Cap tilfælde, besluttede vi at undgå patienter med en avanceret metastatisk sygdom, da terapeutiske regimer kan udgøre en bias for vores analyse. I denne undersøgelse har vi en ubalance mellem knoglen og ikke-bone metastatiske patienters nummer, som afhænger af tilstedeværelsen af ​​en mindre mængde knogle metastatisk sammenlignet med ikke-bone metastatiske CaP-patienter ved diagnose [3]. I virkeligheden, i den naturlige historie af sygdommen, knoglemetastaser er en hyppig, men sent begivenhed [11].

knogleomsætningen blev forbedret i knogler metastatiske patienter, især vi observeret både en stigning i knogledannelse og resorptionsprocesser markører. PTH-niveauet blev let øget i knogle metastatiske patienter sammenlignet med raske kontroller, ifølge PTH evne til at fremme vækst og invasivitet af prostatacancerceller i knogler [12].

Den observerede stigning i knogleresorption og den tidligere demonstreret spontan osteoklastogenese hos kræftpatienter med osteolytiske metastaser [13] fik os til at undersøge osteoklastogenese fra Cap patienters PBMC

in vitro

. OC formation var højere i knogle metastatiske patienter sammenlignet med både ikke-bone metastatiske patienter og raske kontrolpersoner. For at identificere de faktorer, der er ansvarlige for stigningen i OC dannelse, vi målte molekyler meste involveret i osteoklastogenese, såsom TNF-alfa, RANKL, OPG, IL-7 og DKK-1. De TNF-alfa i serum blev ikke signifikant forøget i Cap patienter, forskelligt fra andre knogle metastatiske tumorer, hvor TNF-alfa spiller en vigtig rolle i osteoklastogenese [14]. Ellers RANKL /OPG-forholdet var højere i knogle metastatiske patienter, forklarer den øgede osteoclastogenese og i henhold til tidligere litteratur data [15].

Samspillet mellem tumorcellerne, immunsystemet og knoglevævet er blevet en relevante formål med intensiv undersøgelse. Da IL-7 involvering i knoglemetastaser tidligere var påvist i andre tumorer [4], [16], vi undersøgte dette spørgsmål viser en stigning i serum IL-7 niveauer i Cap patienter med og uden knoglelæsioner. Stigningen i IL-7 kunne forklare RANKL /OPG augment, eftersom IL-7 stimulerer RANKL produktion fra T-celler [17]. Vi evaluerede IL-7 genekspression i CaP og normale prostata væv, viser sammenlignelige IL-7-ekspression i prostatakræft og normale væv. Dette resultat adskiller sig fra vores offentliggjorte data om lungekræft, hvor tumorvævet udtrykt højere IL-7 niveauer sammenlignet med den normale modpart [18]. Vi foreslår, at denne uoverensstemmelse kan skyldes de forskellige tumortype og knogle metastatisk adfærd, som forårsager lungekræft osteolytiske metastaser, mens CaP producerer hovedsageligt knogledannende læsioner. Den øgede IL-7 serumniveau kan afhænge af immunsystemaktivering mod tumoren. Faktisk er det blevet tidligere vist, at T- og B-celler producerer IL-7, i begge tumorer og andre patologier associeret til knogleresorption [4], [19], [20]. WNT signalering spiller en vigtig rolle i knogleudvikling, da det inhiberer OC differentiering [6], stimulerer osteoblastogenesis og mineraliseringsmiddel aktivitet af osteoblaster [7]. Wnt proteiner er også udtrykt af CaP og kan fremme tumor knogle invasion [21]. Kr er en opløselig inhibitor af kanonisk WNT signalering [22]. En nylig undersøgelse associerer DKK-1-ekspression i brystcancer med tilstedeværelsen af ​​knoglemetastaser [23]. Data om DKK-1-ekspression i CaP er sparsomme: nogle forfattere rapporterer en stigning DKK-1-ekspression i osteolytiske læsioner, men ikke i de primære tumorer [8]. Hall

et al

rapporterede, at CaP-afledt DKK-1 er involveret i osteoblastaktivitet i knoglemetastaser, da DKK-1 signalering kunne tegne sig for at skifte knoglen respons til Cap celler fra osteolytiske til osteoblast og omvendt [24 ]. I dette arbejde, vi studerede kun patienter med knogle danner metastaser, derfor er vi i stand til at korrelere osteolytisk aktivitet induceret af CaP celler og DKK-1-ekspression, som beskrevet tidligere [8]. Ikke desto mindre fandt vi en stor mængde DKK-1 i serologiske prøver fra kræftpatienter og en forbedret DKK-1 genekspression i Cap væv, hvilket tyder på, at de øgede serum DKK-1-niveauer i Cap patienter kan afhænge af CaP celle sekretion. Dette resultat vil være dybt studere for at evaluere den potentielle rolle af DKK-1 som tumormarkør i CaP. Desuden kunne vi spekulere, at CaP celler stimulerer knoglemarven miljø at øge DKK-1 frigivelse gennem ukendte mekanismer. I vores knogler metastatiske patienter, er serum DKK-1-niveauer lidt steget i forhold til ikke-metastatiske patienter uden en statistisk signifikant forskel. Dette kunne afhænge af vores lave antal patienter, men undersøger et stort antal patienter, forventer vi at vise en forskel mellem de to grupper, bekræfter litteraturdata [23].

Materialer og Metoder

patienter og markører for knogleomsætning

den eksperimentelle projekt, og alle undersøgelser på patienter blev godkendt af Etisk Komité vores institution (Azienda Ospedaliera-Universitaria San Giovanni Battista i Torino) og skriftligt informeret samtykke fra patienter og raske kontroller blev opnået. Den undersøgte population omfattede 46 patienter med nydiagnosticeret CaP (37 havde kun en primær tumor, mens ni havde primær tumor og samtidige knogle danner metastaser) og 20 raske mænd. Hos alle patienter var der ingen tegn på metastaser til andre ikke-bone sites. Det er blevet påvist, at østrogen tab væsentlig indvirkning osteoklastdannelse [25]. studerede vi således CaP, at være en eneste mandlige tumor, undgår som standard alle de mulige bias på grund af de cykliske østrogen variationer og postmenopausale fald i østrogen niveauer hos kvinder. Patienter og kontroller blev matchet for alder og BMI. Knoglemineraltæthed (BMD) blev målt ved at dobbeltklikke emission røntgen absorptiometri med en Hologic QDR 4500 ved columna lumbalis og lårbenshalsen både patienter og kontroller. Individer med tarm malabsorption sygdomme, andre slags mangelfuld ernæringstilstand, sekundær osteoporose eller tage stoffer er aktive på knogleomsætning eller anti kræftbehandling blev udelukket. Tilstedeværelsen af ​​knoglemetastaser blev bekræftet under anvendelse

99Tc knogle scanning og yderligere billeddannende undersøgelser ifølge standarden klinisk praksis.

For at undersøge knoglemetabolisme status, patienter og kontroller blev underkastet analyse af standard kliniske markører af knoglemetabolisme, såsom serum PTH, knogle alkalisk phosphatase (BAP), calcium, phosphat, osteocalcin (BGP) og urin deoxypyridinolin (urin tværbindinger) [26]. Især krydsbinder dosis er blevet valgt i klinisk praksis til at overvåge knogle metastatisk sygdom og respons på anti-resorberende behandlinger såsom bisfosfonater [27], [28]. Som markører for knogleresorption vi målte også tartrat Resistent syrephosphatase 5b (TRAP5b) i sera [29], som BoneTrap ELISA-kit (Suomen Bioanalytiikka Oy, Turku, Fin). Serologiske markører, såsom PSA og histologiske sortering, ifølge Gleason, blev registreret for alle de patienter, der indgår i denne undersøgelse [30], [31]. Alle biokemiske målinger blev udført på en enkelt blod eller urin prøve på et enkelt tidspunkt per emne.

Cellekulturer

Som tidligere beskrevet [13], for alle patienter og raske kontrolpersoner, PBMC’er var isoleret fra perifert blod og dyrkes i α-MEM suppleret med 10% FBS, penicillin 100 U /ml og streptomycin 100 ug /m (Cambrex, Bio Science, Walkersville, MD), uden at tilføje eksogene stimulatoriske faktorer, såsom m-CSF og RANKL. Efter 15 dage, kulturer blev stoppet, var modne p-piller identificeret som flerkernede celler, der indeholder tre eller flere kerner og positiv for TRAP udtryk (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

Cytokiner dosering

for at vurdere faktorer involveret i osteoklastogenese mængden af ​​serum total RANKL (fri og OPG-bundne), OPG, TNF-alfa, IL-7 og DKK-1 blev bestemt ved kommercielt tilgængeligt ELISA-kit ifølge producentens instruktioner. Prøver blev analyseret in duplo og data blev udtrykt som middelværdier. De følsomheder var: 1,56 til 30000 pg /ml for den samlede RANKL (Apotech Corporation, Epalinges, CH); 0 til 4000 pg /ml for OPG; 0,12 til 32 pg /ml for TNF-alfa; 0,1 til 16 pg /ml for IL-7 (R . 0,05

Tak

Vi takker Raffaele Troiano for teknisk bistand