PLoS ONE: Allelic Ubalance i miR-31 Host Gene Locus i Lung Cancer – dens mulige rolle i Carcinogenese

Abstrakte

Små ikke-protein-kodende RNA, microRNA (MIR), der regulerer messenger RNA-niveauer, er for nylig blevet identificeret, og kan spille en vigtig rolle i patogenesen af ​​forskellige sygdomme. Den foreliggende undersøgelse fokuserede på miR-31 og undersøgt dens potentielle engagement i lunge carcinogenese. Ekspressionen af ​​MIR-31 blev ændret i lunge- cancerceller gennem enten amplifikation eller tab af værtens gen locus. Den stærke ekspression af MIR-31 i storcellede carcinomer blev tilskrevet den genamplifikation. I mellemtiden, tabet af miR-31-ekspression observeret hyppigere i aggressive adenokarcinomer. Således kan MIR-31 spiller en pleiotropisk rolle i udviklingen af ​​lungecancer blandt forskellige histologiske typer. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at vise den potentielle sygdomsfremkaldende mekanisme af det ændrede udtryk for miR-31 og foreslå sin potentielt forskelligartede betydning i de forskellige histologiske typer af lungekræft

Henvisning:. Okudela K, Tateishi Y, Umeda S, Mitsui H, Suzuki T, Saito Y et al. (2014) Allelic Ubalance i miR-31 Host Gene Locus i Lung Cancer – dens mulige rolle i Carcinogenese. PLoS ONE 9 (6): e100581. doi: 10,1371 /journal.pone.0100581

Redaktør: Salvatore Papa, Institut for Hepatology – Birkbeck, University of London, England

Modtaget: Januar 23, 2014 Accepteret: 26 maj 2014; Udgivet: 30 juni 2014

Copyright: © 2014 Okudela et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det japanske ministerium for uddannelse, kultur, sport, og videnskab (Tokyo Japan), og ved en bevilling fra Yokohama Medical Facility (Yokohama, Japan). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige årsager til kræft-relaterede dødsfald i den udviklede verden [1], [2]. Selv om den primære tumor held afskæres, er en gentagelse observeret i en stor procentdel af patienter [1], [2]. Selv om nogle lungetumorer er følsomme over for konventionelle kemoterapeutiske midler eller visse molekylære målrettende midler, er mange ikke [3], [4]. Således yderligere forståelse af den molekylære mekanisme bag lunge carcinogenese er vigtig for udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier.

Små ikke-proteinkodende RNA, microRNA, som regulerer messenger-RNA-niveauer, er for nylig blevet identificeret, og har vist sig at spille en vigtig rolle i patogenesen af ​​forskellige sygdomme. Various microRNA (MIR), herunder Lad-7, MIR-21, miR-30d, miR-31, MIR-155, og MIR-205, er blevet foreslået at være involveret i carcinogenese af forskellige typer af maligniteter [5]. Blandt disse blev MIR-31 angives at være mere kraftigt udtrykt i tumorvæv end i ikke-tumorvævet, og blev foreslået at have et onkogent rolle i lunge carcinogenese [6] – [12]. Desuden er en nylig undersøgelse demonstrerede den prognostiske værdi af MIR-31, fordi den højere ekspression af MIR-31 var forbundet med en dårligere prognose hos patienter med lungecancer [13]. I mellemtiden har en forskel i MIR-31-ekspression blandt histologiske typer lungekræft og potentiel mekanisme af et ændret ekspression af MIR-31, er ikke blevet belyst.

Den foreliggende undersøgelse analyserede ekspressionen af ​​MIR-31 og status for sin vært genlocus i de forskellige histologiske typer af lungekræft.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

En udødeliggjort menneskelige luftvejs epitelial cellelinje (16HBE14o , Simian virus 40 (SV40) transformerede humane bronkiale epitelceller) beskrevet af Cozens aL et al. (1994) [14] blev venligt tilvejebragt af Grunert DC (California Pacific Medical Center Research Institute). En sub-klon af 16HBE14o celler, beskrevet som NHBE-T i denne undersøgelse, blev anvendt. Immortaliserede luftvejsepitelceller cellelinier (HPL1D og HPL1A, SV40-transformerede humane lille luftvejsepitelceller) blev oprettet ved Masuda A et al. (1997) [15]. Menneskelig lunge cancer cellelinjer (A549, H322M, H358, H522, H820, H2087, H23, EKVX, H226, H827, H1819, H441, H4006, HOP62, H1299 og H460) og en human embryonal nyre cellelinje (HEK293T) var indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den menneskelige lungecancer cellelinje LC2AD, Lu130, Lu135, Lu139, og Lu140, blev købt fra Riken Cell Bank (Tsukuba, Japan). De humane lungekræft-cellelinjer, PC9 og HARA, var fra Immuno-Biological Laboratories Co. (Gunma, Japan). Den menneskelige lunge cancer cellelinjer, TKB1, TKB2, TKB4, TKB5, TKB6, TKB7, TKB8, TKB9, TKB12, TKB14, TKB15, TBK17, og TKB20, blev opnået fra Dr. Hiroshi Kamma via Dr. Takuya Yazawa (Kyorin University School of Medicine) [16]. Primær lille luftvejs epitelceller (SAEC) og normale humane bronchieepithelceller (NHBE) blev købt fra SANKO Kagaku (Tokyo, Japan).

Primær Lungekræft

I alt 129 primære lungetumorer (71 adenocarcinomer, 38 planocellulært karcinom, 18 store celle carcinomer, 2 små celle carcinomer) blev fjernet ved radikal kirurgisk resektion ved Kanagawa kardiovaskulære og respiratoriske center Hospital (Yokohama, Japan). Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen [17], og blev godkendt af de etiske komitéer i Yokohama City University og Kanagawa Prefectural kardiovaskulære og respiratoriske Center Hospital [18]. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag giver materialer.

RNA-ekstraktion

Cellelinjer blev vasket med kold fosfatbuffer saltvand og derefter hurtigt nedfrosset. Formalin-fikserede og paraffin-indlejrede vævssnit blev undersøgt mikroskopisk. Tumorform og ikke-tumor-dele blev dissekeret med et barberblad. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af miRNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA).

Kvantitativ RT-PCR

For at detektere miRNA, første streng cDNA blev syntetiseret fra totalt RNA under anvendelse af Mir- X miRNA First-Strand Synthesis Kit ifølge protokollerne fra fabrikanten (Takara, Kyoto, Japan). CDNA’et genererede blev anvendt som en skabelon i realtids-PCR med SYBR Premix ExTaq (Takara) og kørt på en termisk cykliseringsapparat DICE real-time PCR-system (Takara). Den fremadrettede primer anvendes til påvisning for miR-31 var 5’AGGCAAGATGCTGGCATAGCT (modne miR-31, MIMAT0000089). Den reverse primer var den universelle MRQ 3′-primer (Takara). Primersættet anvendes til at detektere U6 snRNA blev indkøbt fra Takara Bio Inc. MIR-31-niveau blev normaliseret til U6 snRNA niveauer. For at detektere mRNA, blev første streng cDNA syntetiseret fra totalt RNA under anvendelse af SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). CDNA’et genererede blev anvendt som en skabelon i realtids-PCR med TaqMan Gene Expression Assay-system (Applied Biosystems, Foster City, CA) og kørt på en termisk cykliseringsapparat DICE real-time PCR-system (Takara). TaqMan sonder og primer sæt anvendes til at detektere GAPDH [NM_002046.5], ITGA5 [NM_002205.2], MMP16 [NM_005941.4], og RhoA [NM_001664.2] blev tilpasset og købes Applied Biosystems. ITGA5, MMP16, og RhoA niveauer blev normaliseret til GAPDH niveauer.

PCR-analyse af MIR-31 locus

Genomisk DNA blev ekstraheret fra cancercellelinier vha DNeasy (Qiagen). Status (tekst udgår eller tilbageholdelse) af miR-31 hot genlocus blev analyseret ved genomisk DNA PCR ved anvendelse af primer sæt F 5’TAACTACATCTTCAAAAGCGGAC og R 5’TACATAGCAGGACAGGAAGTAA. Status for CDKN2A gen locus (D9S974) og en anden fjern locus af den korte arm af kromosom 9 (D9S304) blev også analyseret under anvendelse af primer sæt F 5’GAGCCTGGTCTGGATCATAA og R 5′- AAGCTTACAGAACCAGACAG, og F 5’GTGCACCTCTACACCCAGAC og R 5’TGTGCCCACACACATCTATC henholdsvis.

In situ

hybridisering for miRNA

In situ

hybridisering blev udført i overensstemmelse med en metode beskrevet tidligere [ ,,,0],19]. Kort fortalt låst nukleinsyre (LNA) -modificeret detektionsprober for MIR-31 og U6 snRNA, og krypterede negativ kontrol probe (Exiqon, Vedbæk, Danmark) blev mærket med digoxigenin (DIG) under anvendelse af DIG Oligonucleotide Tailing kit (Roche, Basel , Schweiz) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Formalin-fikserede og paraffin-indlejrede vævssnit blev acetyleret og hybridiseret med DIG-mærkede detektionsprober, og blev derefter probet med alkalisk phosphatase-konjugeret anti-DIG Fab-fragmenter (Roche). Hybridiseringen signal blev visualiseret ved hjælp af en farve udvikler løsning (Roche).

Lysstofrør

in situ

hybridisering (FISH) for genet locus

Formaldehyd-fikseret og paraffin-embedded vævssnit blev anvendt til analysen. Snit blev kogt i citreret puffer (0,01 M, pH 6,0) for at frigive lukkede kromosomale strukturer [20]. Disse snit blev hybridiseret med en Cy3-mærket probe dækker MIR-31 locus (BAC klon: RP11-354P17) og et FITC-mærket probe til centromeren locus på kromosom 9 (Vysis INC, Downer Groves, IL.). Signalet fra MIR-31 locus og centromer 9 blev talt i mere end 50 celler i hver tumor, og kopiantallet af MIR-31 locus forhold til den for centromer 9 blev beregnet.

Behandling med 5 -azacytidine og trichostatin A

Celler blev behandlet enten med 10 uM 5-azacytidin (Sigma, St. Louis, MO) i 72 timer ved at udskifte mediet hver dag eller med 300 ng /ml trichostatin A ( Wako, Osaka, Japan) i 24 timer. Celler blev også behandlet med 5-azacytidin i 48 timer og derefter med en kombination af 5-azacytidin og Trichostatin A i yderligere 24 timer.

Methylering-specifik PCR

Genomisk DNA blev underkastet en bisulfate konvertering behandling ved hjælp af MethylEasy DNA bisulfate modifikation kit (human Genetic signaturer, Macquarie Park, Australien). Methyleringsspecifik PCR rettet mod de to bindingssteder for CpG i promotoren locus på MIR-31 host genet (LOC554202), som tidligere blev påvist [21], blev udført ifølge fremgangsmåden beskrevet andetsteds metoden [21].

bisulfat DNA Sequencing

GPC stedet i promotoren locus af miR31 værtsgenet (LOC554202), som tidligere blev påvist [21], blev PCR-amplificeret under anvendelse bisulfat-behandlede genomisk DNA som en template, ifølge metode beskrevet andetsteds [21]. PCR-produktet blev sub-klonet ind i pT7 blue plasmidvektor (Novagen, Darmstadt, Tyskland), og blev derefter udsat for en cyklus farvestof-terminator-reaktion med den universelle T7-promotor-primer ved hjælp af store Dye Terminator Version 3.1 kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Statistical Analysis

Forskelle i det anvendte relative kopiantal af mIR-31 locus blandt inddelt efter forskellige patologiske parametre blev analyseret med ensrettet ANOVA’erne . Forskelle i midlerne til MIR-31 niveauer i den inhibitoriske eksperiment blev analyseret med en uparret Students t-test. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (SPSS til Windows Version 10.0, SPSS, Chicago, IL, USA).

Andre

De eksperimentelle procedurer, der anvendes til at udføre immunhistokemi for Ki-67 og analysere onkogene mutationer i KRAS og EGFR-gener blev beskrevet andetsteds [22].

Resultater

MIR-31 og udtryk for sine kendte mål i lungekræft-cellelinjer

MiR- 31 udtryk syntes at være stærk i nogle cancer cellelinjer, men var helt fraværende i andre nogle cellelinjer (fig. 1). Ekspressionen af ​​lad-7i blev også undersøgt. Lad-7i blev udtrykt i alle cellelinjer og dens niveauer afveg fra miR-31 (figur S1). Det tjente som en kontrol for at vurdere kvaliteten af ​​de materialer og sikret, at markante ændringer skete i ekspressionen af ​​miR-31. Endvidere er en indledende forsøg viste, at genoprettelsen af ​​MIR-31 markant undertrykt vækst af en cancer cellelinje (LC2AD), som næsten mistet sin evne til at udtrykke MIR-31 (figur S2). Disse resultater fik os til at yderligere at undersøge potentielle betydning af det ændrede udtryk for miR-31 i lunge carcinogenese.

MIR-31 niveauer blev normaliseret til U6 snRNA niveauer. Tekniske replikater blev udført tre gange. Midler og standardafvigelser (fejl barer) er vist. AEC, luftvejs-epitelceller (ikke-kræft celler); ADC, adenocarcinom; SQC, planocellulært karcinom; LCC, storcellet carcinom celle; SCC, småcellet carcinom.

Status for miR-31 gen locus i lungekræft-cellelinjer

tilstandene for miR-31 gen locus, CDKN2A locus, og den tilstødende locus (D9S304), blev undersøgt under anvendelse af PCR-analyse. Blandt de fyrre-én celle undersøgte linjer, seks cellelinier (14,6%, 6/41 cellelinjer, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, og TKB9) mistede miR-31 host gen locus (figur 2, tabel 1. ), mens tolv linjer (29,3%, 12/41 cellelinjer,. TKB14, H4006, A549, LC2AD, TKB4, H460, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, TKB9) mistede CDKN2A locus (figur 2, tabel 1 ). Alle seks linjer, mistet MIR-31 locus også mistet CDKN2A locus (fig. 2, tabel 1). Den tilstødende locus (D9S304) fungerede som en positiv kontrol for PCR-analyse (fig. 2).

Resultaterne fra PCR-analyse er vist. AEC, luftvejs-epitelceller (ikke-kræft celler); ADC, adenocarcinom; SQC, planocellulært karcinom; LCC, storcellet carcinom celle; SCC, småcellet carcinom.

Epigenetisk modifikation af miR-31 promotor og dens udtryk

MIR-31-ekspression var fraværende i alle de seks cellelinjer miste miR -31 vært gen locus (fig. 2, tabel 1). Imens de fem cellelinier (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, og TKB17), der bevarede MIR-31 gen locus (fig. 2, tabel 1) også mistet MIR-31 ekspression eller markant reduceret sit niveau (fig. 2, tabel 1), hvilket indikerede potentielle inddragelse af epigenetisk modifikation i sin nedregulering. Således blev cellelinjer, der mistede MIR-31-ekspression, men bevaret sin gen locus undersøgt for at undersøge virkningerne af inhibitorer til DNA methyltransferase og histon deacetylase på ekspressionen af ​​MIR-31. Enten og /eller kombinationen af ​​begge inhibitorer ikke reproducerbart gendanne MIR-31-ekspression i disse celler (fig. 3A). Methyleringsspecifik PCR-analyse på to steder i promotorregionen på MIR-31 værtsgen afslørede, at de to steder blev methyleret i alle undersøgte (fig. 3B) cellelinier. Bisulfat DNA-sekventering analyse på CpG-stedet i promotorregionen viste også, at det til tider blev methyleret i alle undersøgte cellelinjer (SAEC, NHBE-T, H820, H441, LC2AD, Lu140, TKB15, og TKB17) (fig. 3C). Niveauerne af methylering syntes at være ikke signifikant forskellig mellem celler bevarer ekspression af miR-31 (SAEC, NHBE-T, og H820), og dem miste det (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, og TKB17) (fig. 3C) . status methylering af de formodede promotorområder på MIR-31 host genet var ikke forbundet med genopretning status MIR-31-niveauer efter behandlingerne med inhibitorer (fig. 3A og 3C). Således kunne DNA-methylering i den formodede region undersøgt her ikke tilskrives nedregulering af MIR-31.

Celler behandlet med vehikelkontrol (CTL), 5-azacytidin (AZA), Trichostatin A (TRC), eller en kombination af AZA og TSA (AZ /TR) blev undersøgt for genoprettelse af mIR-31-ekspression under anvendelse af kvantitativ RT-PCR. Det relative niveau af MIR-31 normaliseret til dem af U6 snRNA blev beregnet. blev udført to uafhængige forsøg. Tekniske replikater af PCR-analyse blev udført tre gange. Midler og standardafvigelser (fejl barer) er vist (A). De to steder (S1 og S2) fra den formodede promotor af MIR-31 blev PCR-amplificeret med primere specifikke for enten methyleret (M) eller umethyleret (UM) DNA ved anvendelse af natriumbisulfat-modificeret genomisk DNA som en template, ifølge fremgangsmåden beskrevet i en tidligere undersøgelse [21]. Repræsentative resultater er vist (B). Området af MIR-31-promotoren indeholdende CpG sites blev PCR-amplificeret under anvendelse af natriumbisulfat-modificeret genomisk DNA som en template, ifølge fremgangsmåden beskrevet i en tidligere undersøgelse [21] metode. Otte subkloner af PCR-produkter blev analyseret for deres status for methylering under anvendelse af DNA-sekventering. Åbne (○) og fyldt (•) cirkler angivet methyleret og methyleret cytosin ved de angivne CpG sites henholdsvis (C). AEC, luftvejs-epitelceller (ikke-kræft celler); ADC, adenocarcinom; SQC, planocellulært karcinom; LCC, storcellet carcinom; SCC, småcellet carcinom.

Angivelse af miR-31 i primære lungekræft

Kvantitativ RT-PCR-analyse viste, at nogle tumorform og ikke-tumorform væv udtrykte miR-31 ved påviselig niveauer (fig. 4A). Disse niveauer varierede, men var markant høj i nogle af de undersøgte tumorer (fig. 4A). Disse viste sig at være lidt højere i store celle carcinomer og lidt lavere i adenokarcinomer (fig. 4A). Blandt de undersøgte adenocarcinomer, ekspressionen af ​​MIR-31 var lavere i dårligt differentieret carcinom (fig. 4B og 4C) samt i den faste subtype (Fig. 4D). Alvorlig vævsskade ledsaget af regenerative reaktioner blev observeret i ikke-tumor-væv udtrykker MIR-31 (ikke vist).

MIR-31 niveauer blev evalueret i primære lungetumorer og den tilsvarende lunge ikke-tumorvævet. De kopiantal af MIR-31 og U6 snRNA blev målt ved brug af kvantitativ RT-PCR. Tekniske replikater blev udført tre gange. Midlerne og standardafvigelser (fejl søjler) af miR-31 niveauer normaliseret til de af U6 snRNA er vist som de opnåede resultater fra alle tumorer (A) og de af ADC (B). Betydelige forskelle i den gennemsnitlige MIR-31 niveauer i adenokarcinomer mellem de forskellige histologiske kvaliteter (9 godt differentierede karcinomer (TWA), 3 moderat differentierede karcinomer (MOD), 8 dårligt differentierede karcinomer (POR)) og undertyper (8 bronchioloalveolar carcinom (BAC) ; 3 acinar karcinom (ACN), 8 fast carcinom (SOL) (en papillær carcinom (= godt skelne carcinom) blev udelukket fra en statistisk analyse) blev analyseret med en en-vejs ANOVA midlerne og standardafvigelser (fejl barer) af. de histologiske kvaliteter (C) og undertyper (D) præsenteres.

In situ

hybridisering analyse for miR-31 på vævssnit bekræftede, at miR-31 blev udtrykt i neoplastiske celler og også afsløret, at det endnu varierede blandt neoplastiske celler selv i den samme tumor (fig. 5). Regenerative epitelceller, interstitielle celler og inflammatoriske celler udtrykte også mIR-31 på forskellige niveauer (fig. 5).

en probe bestående af den krypterede tilfældig sekvens tjente som en negativ kontrol (nederste paneler). Repræsentative fotografier fra tumorform (venstre to paneler) og ikke-tumorvævet (højre to paneler), der udtrykte miR-31 (i midten to paneler) eller ikke (laterale to paneler), præsenteres.

status på mIR-31 host genlocus i primære lungecancere

FISH-analyse afslørede, at mIR-31 host genlocus blev tabt i de neoplastiske celler i nogle tumorer, som signalet tælle fra mIR-31 locus var lavere end fra centromeren af ​​kromosom 9 (fig. 6A). Genet Doseringen af ​​MIR-31 locus beregnes som forholdet af MIR-31 /centromerer i adenokarcinomer og pladecellecarcinomer var lidt lavere end den ikke-kræft bronkial epitel (fig. 6B). Men i nogle tumorer i stor celle carcinomer, den MIR-31 locus blev amplificeret (Fig. 6C). Genet dosering var signifikant højere i storcellede carcinomer end i ikke-kræft epiteler og andre histologiske typer (fig. 6C, tabel 2). Alle tumorer med en amplifikation af gen locus, der blev availably undersøgt, udtrykte et højt niveau af MIR-31 transcript. I modsætning hertil blandt adenocarcinomer, genet dosering yderligere tendens til at være lavere i mere aggressive tumorer (dårligt differentierede tumorer eller fast undertype tumorer) (tabel 2).

Repræsentative resultater fra tumor-og ikke-tumor-væv er præsenteret, og grønne og røde signaler angiver mIR-31 locus og centromer locus af kromosom 9, henholdsvis (A). Signalet tæller fra miR-31 locus normaliseret til, at der fra centromer locus af kromosom 9 blev bestemt som FISH score. Fisken scores målte præsenteres (B). De gennemsnitlige scorer i ikke-tumorøse bronkial epitel og i de forskellige histologiske typer lungekræft præsenteres (C). Forskelle i den gennemsnitlige score blev analyseret med en en-vejs ANOVA-test. P-værdier er vist. BEC, bronkiale epitelceller (ikke-cancerceller); ADC, adenocarcinom; SQC, planocellulært karcinom; LCC, storcellet carcinom.

Diskussion

En indledende undersøgelse om brystkræft foreslog, at miR-31 kunne være en tumor suppressor, der hæmmede den invasive og metastatiske spredning af neoplastiske celler [23]. Andre undersøgelser har støttet denne indledende fund og afslørede de potentielle molekylære mekanismer bag hvordan miR-31 undviger invasion og metastase [24]. MIR-31 blev også vist at være nedreguleret i gastriske cancere og blev foreslået at fungere som en tumorsuppressor [25]. I modsætning hertil blev MIR-31 syntes at være opreguleret i kolorektale cancere, og blev foreslået at fremme den invasive og metastatiske spredning af neoplastiske celler [26], [27]. Således kan den potentielle rolle for miR-31 i carcinogenese varierer mellem de forskellige typer af kræft. I lungekræft, har ekspression af MIR-31 generelt blevet rapporteret at være højere i tumorvæv end i tilsvarende ikke-tumorvævet [6] – [12]. Vores resultater fra kvantitativ RT-PCR-analyse, hvor flere primære lungetumorer blev vist til stærkt at udtrykke miR-31, viste sig at være i overensstemmelse med de tidligere resultater [6], [7], [9] – [12]. FISH-analyse afslørede, at amplifikation i værten gen locus kan være en af ​​de mekanismer, der er ansvarlige for den stærke ekspression af MIR-31. En nylig undersøgelse viste en prognostisk værdi af miR-31, som den højeste udtryk for miR-31 var forbundet med en dårligere resultat i lungekræft [13], og også foreslået sin onkogene rolle gennem

in vitro

eksperimenter [ ,,,0],13]. Taget sammen med disse resultater, blev miR-31 foreslået at fremme carcinogenese, især af store celle carcinomer. I modsætning hertil blev MIR-31 ekspression markant reduceret eller helt fraværende i nogle lungekræft cellelinier. Desuden dets niveau varieres i primære lungetumorer. Nogle tumorer udtrykte MIR-31 ved lavere niveauer end det tilsvarende ikke-tumorvævet, mens andre tumorer ikke udtrykte det overhovedet. Blandt de undersøgte adenocarcinomer, genet dosis var en smule lavere i mere aggressive tumorer (dårligt differentierede eller faste undertype tumorer). Disse resultater antydede, at MIR-31 kan spille en suppressiv rolle i carcinogenese af adenocarcinomer. Således kan MIR-31 spiller en pleiotropisk rolle i udviklingen af ​​lungecancer af forskellige histologiske typer. Udtrykket af nogle kendte mål for miR-31, såsom ITGA5, MMP16, og RhoA [28], blev foreløbigt undersøgt i miR-31-transfekterede celler og lungekræft celler (Figur S3). Imidlertid har tvunget ekspression af MIR-31 ikke reducere mRNA-niveauer af disse molekyler. I indfødte lungekræft-cellelinjer, blev der ikke observeret nogen korrelation mellem niveauet af disse molekyler og miR-31 niveauer mellem forskellige histologiske typer (Figur S3). Mål af miR-31 kan variere i forskellige situationer, og kompleks krydstale mellem målene kan ligge skjult i lunge kræftceller. Yderligere undersøgelser, der udførligt undersøge downstream mål berettiget for at belyse den potentielle molekylære mekanisme bag hvordan MIR-31 fremmer carcinogenese af forskellige histologiske typer af lungekræft.

Ikke-tumorform væv der udviser alvorlige skader og inflammation udtrykkes kraftigt mIR-31.

In situ

hybridisering analyse bekræftede også den stærke udtryk for miR-31 i regenerering ikke-neoplastiske epitelceller og mesenkymale celler. Således kan MIR-31 induceres af stimuli der fremmer cellevækst som respons på vævsskade og kan styre regenerative reaktioner. Den ændrede ekspression af MIR-31, om den er nedreguleret eller opregulering, kan resultere i en afbrydelse i den cellulære homeostase og kan også deltage i neoplastisk transformation.

En analyse af status for gen locus påvist, at homozygot deletion af mIR-31 genlocus var en årsag til tabet af dets ekspression i lunge cancercellelinier. Men nogle cellelinier, som beholdt MIR-31 gen locus også alvorligt svækket dets ekspression. Tidligere undersøgelser rapporteret, at hypermethyleringen af ​​DNA eller histon i promotoren locus på MIR-31 host genet var årsag til alvorlige nedregulering af MIR-31 i brystcancere [21] eller voksen T-celle leukæmi [29]. Men vores resultater fra forsøget ved hjælp inhibitorer for DNA-methyltransferase og histon deacetylase ikke støtte inddragelsen af ​​epigenetisk modifikation i dæmpningen af ​​miR-31-ekspression. Methylering-specifik PCR og bisulfate sekventering analyser heller ikke demonstrere en sygdomsfremkaldende forhold mellem DNA hypermethylering af promotoren og sådan alvorlig svækkelse. En anden end epigenetisk modifikation potentiel mekanisme vil sandsynligvis blive involveret i nedregulering af miR-31-ekspression. Den formodede promotor locus på MIR-31 host genet indeholder flere CCAAT enhancerelementer [30]. CCAAT element bindende protein (C /EBP) -β viste sig at inducere MIR-31 ekspression i luftvejsepitel som respons på visse eksterne stimuli [30]. C /EBP-α viste sig at være stærkt nedreguleret i lungecancere [31] – [34], og kan være årsagen til den forstyrrede ekspression af MIR-31. En undersøgelse om mulig inddragelse af C /EBP familie i dæmpningen af ​​miR-31-ekspression i lungekræft er berettiget. I mellemtiden, ikke-kræft immortaliserede luftvejsepitelceller cellelinjer transformeret med SV40 stort T-antigen (NHBE-T, HPL1D, og ​​HPL1A), hvori p53 og RB-medierede veje er inaktiveret, blev fundet at udtrykke MIR-31 ved markant lavere niveauer end små luftvejs-epitelceller (SAEC) og bronkiale epitelceller (NHBE). Denne virusantigen kan direkte og indirekte modulere ekspressionen af ​​MIR-31.

Sammenfattende resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at en ændret ekspression af MIR-31 som følge af enten amplifikation eller tab af sin vært gen locus kan deltage i lunge carcinogenese. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at beskrive den potentielle sygdomsfremkaldende mekanisme ligger til grund for ændret ekspression af miR-31 i lungekræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

Den kopi antal Lad-7i og U6 snRNA blev målt ved hjælp af kvantitativ RT-PCR. Lad-7i niveauer blev normaliseret til U6 snRNA niveauer. AEC, luftvejs-epitelceller (ikke-kræft celler); ADC, adenocarcinom; SQC, planocellulært karcinom; LCC, storcellet carcinom celle; . SCC, småcellet karcinom

doi: 10,1371 /journal.pone.0100581.s001

(TIF)

Figur S2.

Biologisk effekt af restaureringen af ​​miR-31 på en lungekræft cellelinje (LC2AD) præsenteres. Den pro-retrovirusvektor pLHCX (BD Clontech), der bærer DNA-fragmenter, herunder MIR-31-kodende region (MIMAT0000089) flankerende om en 100 basepar margin i begge retninger, blev opnået. De retrovirusvektorer (tom vektor (mock), sense-strengen af ​​MIR-31 (SS), og antisense-strengen af ​​MIR-31 (AS)) blev inficeret som den samme metode som tidligere beskrevet [17]. Efter en kort markering med Hygromycin B (BD Clontech) blev de overlevende celler høstet og talt, og 2,0 × 10

4 blev igen udsået på en 10 cm skål. Efter 15 dage blev cellerne methanol-fikserede og Giemsa-farvede (A). Midlerne og standardafvigelser (fejl barer) af kimtal fra tredobbeltforsøg præsenteres (B). Celler valgt blev dyrket og passeret flere gange. Kumulerede populationsfordoblinger præsenteres (C). Celler høstet umiddelbart efter udvælgelsesprocessen blev undersøgt for ekspression af MIR-31 og U6 snRNA ved kvantitativ RT-PCR. Niveauet af miR-31 normaliseret med den for U6 snRNA præsenteres (D)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0100581.s002

(TIF)

Figur S3.

Den kopiantal af ITGA5, RhoA, MMP-16, og GAPDH mRNA blev målt ved brug af kvantitativ RT-PCR. ITGA5 (A), er RhoA (B) og MMP-16 (C) niveauer normaliseres til GAPDH niveauer vist. AEC, luftvejs-epitelceller (ikke-kræft celler); TRAS, LC2AD lungecancer-cellelinje – baserede transfektanter (tom vektor (MOCK), sense-strengen af ​​MIR-31 (SS), og antisense-strengen af ​​MIR-31 (AS)); ADC, adenocarcinom; SQC, planocellulært karcinom; LCC, storcellet carcinom celle; SCC, småcellet karcinom

doi:. 10,1371 /journal.pone.0100581.s003

(TIF)

Tak

Vi har især takke Emi HONDA og Misa Otara (Kanagawa Prefectural kardiovaskulære og respiratoriske center Hospital, Yokohama, Japan) for deres hjælp.