PLoS ONE: Differential Kontrol af Notch1 Gene Transskription af Klf4 og Sp3 transkriptionsfaktorer i Normal versus Cancer-Afledt Keratinocytter

Abstrakt

I specifikke celletyper som keratinocytter, Notch signalering spiller en vigtig pro-differentiering og tumor undertrykke funktion, med down-modulation af Notch1 genet der er forbundet med udvikling af kræft. Udover at blive styret af p53, lidt andet er kendt om regulering af Notch1 genekspression i denne sammenhæng. Vi rapporterer her, at transkription af dette gen er drevet af en TATA-mindre “skarp top” promotor og at den minimale funktionelle region i denne promotor, der strækker sig fra -342 bp position til initieringskodonet, er differentielt aktiv i normalt versus cancer celler. Denne GC rige region mangler p53 bindingssteder, men binder Klf4 og SP3. Dette fund er sandsynligvis af biologisk betydning, som Klf4 og, i mindre omfang, Sp3 er opreguleret i en række cancerceller, hvor Notch1 ekspression er nede-moduleret, og Klf4 over-ekspression i normale celler er tilstrækkeligt til ned -modulate Notch1 gentransskription. Den kombinerede knock-down af Klf4 og Sp3 var nødvendig for den omvendte virkning at øge Notch1 transskription, i overensstemmelse med de to faktorer udøver en overlappende repressor funktion gennem deres binding til Notch1 promotor

Henvisning:. Lambertini C, Pantano S, Dotto GP (2010) Differential Kontrol af Notch1 Gene Transskription af Klf4 og Sp3 transkriptionsfaktorer i Normal versus Cancer-afledt keratinocytter. PLoS ONE 5 (4): e10369. doi: 10,1371 /journal.pone.0010369

Redaktør: Joanna Mary Bridger, Brunel University, England

Modtaget: November 24, 2009; Accepteret: 22 marts 2010; Udgivet: 28 April, 2010

Copyright: © 2010 Lambertini et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra den schweiziske National Foundation, et tilskud fra den Europæiske Union (Epistem, Framework sjette program, LSHB-CT-2005 til 019.067), og NIH Grants AR39190 og AR054856 og GPD De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Notch signalering spiller en central rolle i kontrollen af ​​cellernes skæbne bestemmelse, vækst og differentiering [1], [2]. Det er også en faktor for carcinogenese, med enten en positiv eller negativ rolle afhængigt celletype og specifikke kontekst [3], [4]. Den bedst karakteriserede “canonical” pathway af Notch-aktivering involverer proteolytisk spaltning og translokation af det cytoplasmiske domæne af receptoren til kernen, hvor det associerer med DNA-bindende protein CSL omdanne den fra en repressor til en aktivator af transkription [1], [ ,,,0],2]. Mest opmærksomhed er blevet givet til kontrol af Notch pathway på post-transkriptionel niveau, herunder behandling og modning af Notch-receptorer, aktivering af ligander på celleoverfladen, og protein modifikation og nedbrydning [1], [2]. Dog kan en primær form for regulering også være på niveauet for gentransskription. Ekspression af de fire Notch receptorgener og deres ligander reguleres i specifikke cellulære sammenhænge og kan ændres i cancerudvikling [3], [5]. Desuden aktivering af en receptor er modtagelig påvirke sit eget udtryk samt andre familiemedlemmer, og kan også kollidere, i en positiv eller negativ måde, på ligand udtryk [1], [2].

et eksempel på denne komplekse form for regulering af Notch udtryk er leveret af undersøgelser i keratinocytter, hvor denne vej spiller en central rolle i at fremme differentiering og undertrykke tumorigenese [3]. I det basale lag af epidermis, har gensidig negativ regulering mellem ligander af Delta familien og Notch receptorer blevet foreslået at styre balancen mellem formodede keratinocyt stamceller cellepopulationer og celler forpligtet til differentiering [6]. På den anden side har positiv feedback regulering mellem Notch receptorer og ligander af Jagged familien blevet impliceret som en mulig mekanisme til synkronisering af keratinocyt overgangen fra den basale prolifererende at suprabasale differentierende lag af [7] epidermis. Mens både Notch1 og Notch2 receptorer er udtrykt i de interfollicular epidermis, deres regulering og funktion er kun delvist overlappende. Især mens Notch2 niveauer er ensartet forhøjede i de differentierende lag af epidermis, ekspression af Notch1 slukkes i de yderste lag [7]. Dette kan være af funktionel betydning, da forhøjet Notch1 aktivitet, mens der kræves for engagement og ibrugtagning differentiering, kan derefter undertrykke de nyeste trin i denne proces [7], [8]. Tilsvarende i keratinocytafledte tumorer, ligesom kutane planocellulært karcinom (SCCS), basalcellekarcinomer (BCC) [9], [10], og sene fase cervikale karcinomer [11], er Notch1 udtryk faldet til et væsentligt større omfang end Notch2 . Dette er sandsynligvis funktionel betydning som, selv ved tilstedeværelse af Notch2, sletning af Notch1 genet er i sig selv tilstrækkelige til at fremme keratinocyt tumor udvikling [9], [11], [12].

Overraskende lidt er vide om kontrol med Notch1 genekspression. I keratinocytter, endogen p53 binder til Notch1 promotoren, øge dens transkription, og kompromitteret p53-funktion kan forklare, i det mindste delvis, det tumor-associerede ned-modulering af Notch1 udtryk [9], [13], [14]. Ligeledes faldt p53-niveauer via viral E6-afhængig nedbrydning kan forklare den allerede nævnte nedregulering af Notch1 ekspression i HPV-positive cervikale carcinomceller [14]. Kontrol af Notch1 ekspression med p53 også er relevant for keratinocyt respons på UV-lys, en væsentligste ætiologiske årsag hudældning og cancer [13], [14]. Udover keratinocytter og deres maligne modstykker, Notch1 ekspression er under positiv p53 kontrol i lunge- og prostatacancerceller, andre celletyper, hvor øget Notch signalering årsager væksthæmning [15], samt i kronisk lymfatisk leukæmi celler, hvor Notch signalering øger celleoverlevelse [16]. I mange af disse tilfælde blev p53 fundet at være specifikt involveret i kontrol af Notch1 genet med ringe eller ingen effekt på andre familiemedlemmer [9], [14], [15]. Interessant nok blev der ikke en sådan regulering findes i coloncarcinomceller, på trods af binding af p53 til Notch1 promotoren selv i disse celler, der peger på den sandsynlige samspil mellem p53 og andre endnu uidentificerede determinanter for Notch1 gentranskription [9].

Sp /KLF familien af ​​transkriptionsfaktorer består af proteiner med tre højt konserverede DNA-bindende zinkfinger-domæner, som genkender GC /CACCC bokse til stede i mange GC-rige promotorer [17]. Disse faktorer spiller en vigtig rolle i transkription af housekeeping-gener, såvel som gener med mere begrænsede celletypespecifikke funktioner [18]. Blandt KLF familiemedlemmer har Klf4 tiltrukket seneste opmærksomhed på grund af sin evne, sammen med andre faktorer, at omprogrammere celle skæbne beslutsomhed [19], samt fremme eller undertrykke udviklingen af ​​kræft i en kontekst afhængig måde [20]. Vi rapporterer her, at Klf4 i keratinocytter binder til Notch1 promotoren og sammen med Sp3, fungerer som en negativ regulator af Notch1 gentranskription, påvirker rekruttering af PolII præinitieringskomplekset gennem en separat mekanisme fra p53. Hæmning af Notch1 udtryk ved Klf4 er i overensstemmelse med den væsentlige rolle Klf4 i de sene stadier af keratinocytdifferentiering [21], som udtryk for Notch1 genet skal være slukket [7]. Dog kan den samme reguleringsmekanisme også bidrage til ned-modulering af Notch1 udtryk i keratinocytafledte tumorer, hvor Klf4 kan være afvigende overudtrykt.

Resultater

1. Transskription af Notch1 gen fra en “skarp peak ‘TATA mindre promotor

Udover inddragelse af p53 [9], [13], [14], [22], lidt er kendt om kontrol med Notch1 gentranskription . Det humane Notch1 genet er lokaliseret på kromosom 9 og struktureret i 34 exoner, der koder for et stort protein på ca. 270 kDa. For yderligere indsigt i transkriptionel kontrol af dette gen, sammenlignede vi dets opstrøms ikke-kodende sekvens i det humane versus muse genomer. Adskillige forudsagte p53-bindingssteder er til stede i 3,0 kb opstrøms sekvens af muse og humane Notch1 promotorer om end på forskellige positioner i forhold til initieringskodonen (fig. 1A). En gradient af stigende sekvenshomologi blev fundet mod humane og muse initieringskodoner, med 70% af sekvensidentitet i GC-rige domæne fra position -500 bp til ATG. Nukleotid analyse pegede endvidere på en formodet TFIID-bindingssted omkring position -230 bp omgivet af distale kerneelementer, mens ingen TATA bokse kunne identificeres (ved hjælp af TESS, Consite eller Genomatix programmer; www.cbil.upenn.edu/cgi-bin /tess /tess, asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite;. www.genomatix.de) (fig 1B)

(A) Nukleotidsekvens sammenligning af 3,0. kb opstrøms region af den humane og muse Notch1 gener, med stigende homologi hen imod den kodende region illustreret ved en grå intensitet gradient. Positionen af ​​formodede p53-bindingssteder, som forudsagt af en bioinformatik program (Matlnspector, https://www.genomatix.de) er indiceret, i forhold til initieringskodonet. “Canonical” p53-bindingssteder er sammensat af to halve steder med nukleotidsekvensen RRRCA /T-T /AGYYY (med R = purin, og Y = pyrimidin), adskilt af et afstandsstykke af 0-21 nukleotider. Quarter-sites (RRRCW og WGYYY) kan være til stede i en head to head, eller hoved til hale orientering, som angivet med pile (→ eller ←). Tal over og nedenfor henviser til den matchende score mellem nukleotidsekvensen for hver lokalitet og forventet matrix, med en perfekt match = 1,00, og en “god” match 0,80. (B) Core promotor-dele af det menneskelige Notch1 gen med angivelse af GC-rige proksimale region, formodet TFIID bindingssted og distale kerneelementer (DCE) [53] (som identificeret af TESS-programmet) og Notch1 transcription start-sites ( TSS). (C) Eksperimentel bestemmelse af Notch1 TSS med 5 ‘RACE. Humane primære keratinocytter blev anvendt som kilde til totalt RNA til 5 ‘RACE amplifikation under anvendelse Generacer og en specifik revers primer placeret på 242 bp fra initieringskodonen. Kloning og sekventering af amplifikationsproduktet reaktionsprodukt (som vist efter gelelektroforese) pegede på en større TSS ved position -262, og en anden ved position -259. Rækkefølgen af ​​overlappende initiator elementer (Py Py A (1) NT (3) Py Py), i vores tilfælde TCA (1) CT (3) AG for de store TSS, og CTA (1) GT ( 3) GC for anden TSS, er angivet med fed skrift, mens de første nukleotider fra to TSS er i kursiv.

at etablere eksperimentelt transkriptionsstartsitet (TSS) i Notch1 udskrift i primære humane keratinocytter (HKC), vi klonet og sekventeret produkterne fra 5′-RACE (hurtig amplifikation af 5′-komplementær DNA-ender) omsætning fra disse celler (fig. 1C). Resultaterne pegede på en vigtigste TSS af det humane Notch1 gen ved position -262 bp fra ATG, med en anden mindre TSS ved -259 bp. Således er transskription af Notch1 genet drevet af en CpG ø promotor, som i modsætning til de fleste initiativtagere til denne klasse [23], har karakter af en “skarp peak ‘promotor, med præcis TSSs formentlig bestemt af en overlappende initiator (INR) element [24].

2. Kortlægning af den funktionelle Notch1 promotor-regionen i normal versus kræftceller

mRNA-ekspression kan styres på flere niveauer, fra de første trin i transskription (initiering /forlængelse) til RNA behandling og stabilitet [25]. Real time RT-PCR-analyse med primere specifikke for 5′- og 3′-regioner af Notch1 transkriptet og første intron viste, at højere ekspression af Notch1 mRNA tidligere rapporteret i HKC versus keratinocytafledte cancerceller [9], [11] var opretholdes uanset de specifikke områder af Notch1 afskrift der blev analyseret (fig. 2).

(A) Organisation af Notch1 gen, med angivelse af den åbne læseramme (ORF) med kodning exons og intervenere introns (sorte tykke kasser og linjer, henholdsvis) og 5 ‘og 3’ uoversatte regioner (UTR). Positionen af ​​forskellige sæt af primere anvendes til real time RT-PCR-analyse er også indiceret (tynde pile). (B) Samlet RNA fra primære humane keratinocytter (HKC), cervikale carcinomceller (HeLa, Caski og SiHa), og huden (SCC13) og mundtlig (SCCO28) pladecarcinom celler blev analyseret ved real-time RT-PCR med primere svarende til anden region i Notch1 genet som angivet i (A). Af denne og alle andre figurer, værdier normaliseret til 36B4 og /eller 18S RNA-niveauer, og udtrykt som i forhold til dem i primære keratinocytter.

Disse resultater antydede, at transskription af Notch1 genet er forskelligt kontrolleret i normal versus kræftceller allerede ved de indledende trin i transskription. For yderligere at teste denne mulighed, vi bestemt den minimale funktionelle region i Notch1 promotoren og vurderet, om en sådan region er forskelligt aktiv i normal versus kræftceller. Til dette formål blev de 2,4 kb region af Notch1 promotoren opstrøms for initieringskodonet klonet ind i et luciferase reporter, efterfulgt af promotor aktivitetsassays i HKCs versus HeLa-celler. At teste en række fragmenter med progressivt reduceret længde fra 5′-enden, viste, at en 342 bp region fra initieringskodonen bevarer fuld promotoraktivitet i HKCs, mens yderligere afkortning af Notch1 promotoren til -315 bp og -300 bp regioner førte til gradvis reduceret aktivitet (fig. 3A). Notch1 promotorregioner med fuld aktivitet i HKCs var betydeligt mindre aktive i HeLa-celler, hvilket afspejler forskellene i endogene Notch1 gentranskription, mens forskellen i promotoraktivitet blev mindre med kortere Notch1 promotorfragmenter (fig. 3A).

(a) Forskellige fragmenter af den humane Notch1 promotoren med faldende 5 ‘ender blev klonet ind i et luciferasereporterplasmid, efterfulgt af forbigående transfektion i primære humane keratinocytter og HeLa-celler (sorte og grå bjælker, henholdsvis) sammen med en Renilla minimal reporter for normalisering . Promotoraktivitet blev målt 48 timer efter transfektion. Relative promotoraktivitet af de forskellige reportere i HKC versus HeLa også blev beregnet (højre tabel). (B) fragmenter af det humane Notch1 promotor med hel eller delvis deletion af sekvensen fra TSS til initieringskodonen (mangler nukleotiderne -159 til -1, og -262 til -1, henholdsvis) blev klonet ind i et luciferasereporterplasmid, efterfulgt af forbigående transfektion /promotor aktivitetsassays i primære humane keratinocytter og HeLa-celler som i den foregående panel. Relative promotoraktivitet i HKC versus HeLa blev også beregnet. (C) Total RNA fra primære keratinocytter og forskellige cancerceller linjer, herunder PC3, Caski og HeLa fra to forskellige kilder (HeLa # 1 og 2), blev anvendt til RT-PCR-amplifikation af 5’-UTR region i Notch 1 gen (primer position -262 /-174). Bemærk den hurtigere vandrende bånd opnået med HeLa prøver. Kloning og sekventering af overlappende genomiske region (fra position -392 bp til -1 i Notch1 promotor) viste en deletion fra position -215 til -202 i HeLa-celler. (D) Det samme Notch1 genomiske region plus /minus ovennævnte deletion blev klonet ind i et luciferasereporterplasmid, efterfulgt af promotor aktivitetsassays i HKC versus HeLa-celler, målt som i (A) og (B).

Nucleotidsekvenser nedstrøms for transcription start sites (TSS) spiller også en vigtig rolle i kontrollen af ​​promotoraktivitet, der kræves til dannelsen af ​​transkription pre-initierings- og initieringskomplekser [26]. I overensstemmelse med betydningen af ​​denne region, blev promotoraktivitet væsentligt nedsat, når sekvensen af ​​Notch1 promotoren nedstrøms for TSS til initieringskodonet (fra -262 til -1), helt eller delvist deleteret (med promotor-konstruktioner mangler nukleotiderne -159 til -1, og -262 til -1 henholdsvis) (fig. 3B). Selv i dette tilfælde reelt faldt promotoraktivitet blev ledsaget af en mindre forskel mellem normale celler og cancerceller (fig. 3B).

PCR-amplifikation af genomisk DNA, der tager sigte på at vurdere dets methylering tilstand som vist nedenfor, afsløret eksistensen af ​​en lille deletion i Notch1 promotor-regionen af ​​to forskellige stammer af HeLa-celler, som ikke var til stede i andre kræftceller som PC3 og Caski (fig. 3C). Ved kloning og sekventering denne region, vi kortlagt sletningen til -215 til -202 bp position, lige neden for TSS. Funktionelle promotor aktivitet analyser af den klonede promotorområde promotor i HKC versus HeLa-celler viste, at denne 10 nukleotider sletning ikke påvirkede promoter aktivitet eller dens differential regulering i normal versus cancerceller (fig. 3D).

3. Negativ kontrol af Notch1 gentransskription ved Klf4 og Sp3

Den differentielle transkription aktivitet af GC-rige proximale region af Notch1 promotoren kan være knyttet til en anden methyleringsstadiet i HKCs versus HeLa-celler. Træk ned assays med antistoffer mod methyleret DNA efterfulgt af PCR-amplifikation pegede på en betydelig grad af methylering af det første intron-område (mellem nukleotider + 1168 /+ 1798) i HeLa-celler, men ikke i HKCs, som kunne bidrage til forskellige transkription af Notch1 gen (fig. 4A). Imidlertid blev ingen påviselig methylering fundet i Notch1 promoter region, der kan tegne sig for sine forskellige aktiviteter i de to celler. En anden mulighed er, at forskellen Notch1 promoter aktivitet er knyttet til transskriptionsfaktorer, som binder til denne region og kontrollerer dens aktivitet. Transkriptionsfaktorer med den højeste sandsynlighed for at binde til GC rige domæner som den foreliggende i Notch1 promotoren proksimale område er zinkfinger-proteinerne i SP- og KLF familier [27]. En eller flere af disse faktorer kan være udtrykt forskelligt i normale versus cancerceller. Faktisk real time RT-PCR af HKCs versus et panel af cervikal carcinom og keratinocytafledte SCC-celler viste, at af de adskillige Sp /KLF familiemedlemmer, der blev undersøgt, Klf4 var stærkt og konsekvent opreguleret i cancerceller (fig . 4B). Sp1 og Sp3 var også opreguleret i disse celler, omend i mindre grad end Klf4, mens ekspression af andre familiemedlemmer, såsom KLF5 eller KLF10a blev kun svagt påvirket og /eller ned-moduleret (fig. 4B). Der blev observeret mindre forskelle på proteinniveauet, sandsynligvis som følge af post-transkriptionelle og /eller protein-destabilisering begivenheder (fig. 4C).

(A) kerneekstrakter fra primære humane keratinocytter (HKC) og HeLa-celler blev immunfældet med antistoffer mod methyleret DNA, efterfulgt af PCR-analyse af det udfældede DNA med primere specifikke for de angivne regioner i Notch1 promotoren og første intron-region. PCR med primere specifikke for et kendt methyleret genet blev anvendt som positiv kontrol. (B) I alt RNA-prøver fra primære humane keratinocytter (HKC) og de angivne cancer cellelinjer blev analyseret ved realtids RT-PCR med primere specifikke for Sp1, Sp3, Klf4, KLF5 og KLF10a. (C) Primære keratinocytter, HeLa og SCC13 celler blev analyseret ved immunblotting med antistoffer mod Sp1, Sp3 og Klf4, med β-actin som lige lastning kontrol.

For at vurdere de funktionelle konsekvenser af øget Klf4 udtryk på Notch1 transskription blev to komplementære metoder iværksat. I den første blev HKCs forbigående transficeret med en Notch1 reporter; promotoraktivitet blev undertrykt ved samtidig transfektion med en Klf4 ekspressionsvektor (fig. 5A). Som en anden tilgang, blev HKC inficeret med en Klf4 udtrykker retrovirus. Real time RT-PCR samt immunoblot-analyse viste, at endogen Notch1 ekspression blev signifikant reduceret i disse celler som følge af Klf4 over-ekspression (fig. 5B, C).

(A) Primære keratinocytter blev co transficerede med en journalist, der indeholder den minimale funktionelle Notch1 promotor (fra -392pGL4) sammen med en ekspressionsvektor for menneskers Klf4 eller tom vektor kontrol. Renilla minimal reporter blev anvendt til intern normalisering, og promotoren blev målt 48 timer efter transfektion. Vist er resultaterne af to forskellige forsøg. (B) Primære keratinocytter blev inficeret med en retroviral vektor, der udtrykker KlfF4 (pMSKlf4) eller en tom vektor kontrol og høstet efter 48 timer, efterfulgt af bestemmelse af Klf4 og Notch1 mRNA ekspression ved real-time PCR. Effektivitet af infektion med pMSKlf4 virus blev også vurderet af de udbredte morfologiske ændringer med udfladning af celler (øvre paneler). (C) primær keratinocytter blev inficeret med en KlfF4 udtrykkende retrovirus versus en tom vektorkontrol som i det foregående panel, efterfulgt af immunoblotanalyse med antistoffer mod Notch1, Klf4 og γ-tubulin som lige loading kontrol. Højre panel: data blev kvantificeret ved densitometrisk scanning af autoradiogrammet og udtrykt som arbitrære enheder efter normalisering for γ-tubulin udtryk. Lignende resultater blev opnået i et andet uafhængigt forsøg.

Omvendt at teste, om Klf4 suppression fører til Notch1 opregulering, HKC samt HeLa-celler blev transficeret med siRNA’er for Klf4. Effektivt ned-modulering af dette gen havde indvirkning på Notch1 gentransskription, og blev observeret tilsvarende mangel på virkninger efter knock-down af Sp3 og Sp1 (fig. 6A og data ikke vist). Den kombinerede siRNA-medieret knockdown af Klf4 og Sp3 resulterede i konsistent opregulering af Notch1 ekspression i både HKCs og cancerceller (HeLa og SCC13 celler), med samtidig knock-down af Sp1 der ingen yderligere virkninger (Fig. 6B , C og data ikke vist).

(a) primære keratinocytter blev transficeret med to sæt siRNA’er for Klf4, Sp1 eller Sp3 parallelt med scrambled siRNA kontrol i 48 timer, efterfulgt af ekspression analyse af de målrettede gener ved real time RT-PCR og immunoblotting (venstre og midterste paneler henholdsvis) De samme RNA-prøver blev også analyseret for niveauer af Notch1 ekspression (højre panel). (B) primære keratinocytter, blev transficeret som i den foregående panel med to forskellige sæt af siRNAs for Klf4 og Sp3 (siRNA-1, siRNA-2) (venstre søjler) eller med siRNA’er for Klf4, Sp1 og Sp3 (højre kolonne), efterfulgt af real time RT-PCR-analyse af Notch1 ekspression. Vist er den beregnede gennemsnit af fire forskellige forsøg under anvendelse af 36β4 og 18S RNA til intern normalisering. (C) HeLa og SCC13 celler blev transficeret med to forskellige sæt af siRNA’er for Klf4 og Sp3 (siRNA-1, siRNA-2) efterfulgt af bestemmelse af Notch1 ekspression ved real-time RT-PCR som i det foregående panel. Primære keratinocytter og SCC13 celler blev transficeret med siRNA’er mod de angivne gener efterfulgt af immunoblotanalyse af Notch1 proteinekspression med γ-tubulin som lige loading kontrol. Højre panel: data blev kvantificeret ved densitometrisk scanning af autoradiogrammet og udtrykt som arbitrære enheder efter normalisering for γ-tubulin udtryk

Den nødvendige kombineret knockdown af Klf4 og SP3 til opregulering af Notch1 udtryk kan. forklares ved samtidig binding af disse faktorer til Notch1 promotoren. Faktisk viste kromatin immunofældning (chip) analyser i HKCs og HeLa-celler, at både Klf4 og Sp3 binde GC rige proksimale region af Notch en promotor (fig. 7A-D). Interessant nok i HKCs, Sp1 viste sig også at binde til denne region, men i langt mindre grad end til den proksimale region i p21WAF1 /Cip1 promotor, en veletableret Sp1 target [28]. Nr Sp1-binding til Notch1 promotoren blev fundet i HeLa-celler (fig. 7B). Lignende Chip assays blev ligeledes udført med antistoffer mod et ubeslægtet GC-bindende transkriptionsfaktor, Maz [29]. Mens Maz1 viste sig at binde til p21-promotoren lighed med Sp1, Sp3 og Klf4, var der ringe eller ingen binding af dette protein til den proksimale region i Notch1 promotoren (fig. 7B, C).

( A) Forudsagt Klf4- og Sp1 /SP3 bindingssteder i -340 /-300 bp Notch1 promoter region. Vist er nukleotidsekvensen for denne region med, på toppen, de forudsagte bindingssteder for Klf4- og Sp1 /SP3. (B og C) primære keratinocytter (HKC) og HeLa-celler blev bearbejdet for chromatin immunoprecipitation (chip) analyse med antistoffer mod Sp1, Sp3 (B), Klf4 (C) eller Maz, som anført, efterfulgt af amplifikation af to Notch1 promotorregioner placeret mellem bp -740 /-262 (Chip 1) og omkring -6600 bp (Chip 2), der indeholder og mangler henholdsvis formodede Sp1 /SP3 og Klf4 bindingssteder. Amplifikation af den proksimale promotor regionen af ​​p21

WAF1 /Cip1 genet (Chip p21) blev anvendt som positiv kontrol. Un-udfældet kromatin præparater blev anvendt til parallelle amplifikationsreaktioner som “input” DNA kontroller. (D) chip assays med anti-SP3 og Klf4 antistoffer og ikke-immune IgG’er som i de foregående paneler blev efterfulgt af real time PCR amplifikation af regionen1 af Notch1 promotoren. Mængden af ​​udfældet DNA blev beregnet i forhold til det samlede input kromatin og udtrykt i procent af den samlede efter følgende formel [54]: Procent total = 2ΔCt × 5, hvor ACt = Ct (input) – Ct (immunfældning), og Ct er tærsklen cyklus.

4. Modsat kontrol over Notch1 transskription af p53 versus Klf4 /Sp3

Et vigtigt spørgsmål er, om p53 og Klf4 /Sp3 kontrol Notch1 gentranskription gennem separate eller konvergente mekanismer. En vigtig regulerende trin er transkriptionsfaktor-afhængig rekruttering af transkription pre-initieringskompleks, indeholder RNA-polymerase II (PolII), til at målrette promotorer [30]. For at vurdere, om dette indledende trin i Notch1 transskription er under p53 og Klf4 /Sp3 kontrol blev to komplementære metoder iværksat. I HeLa-celler, hvor p53-niveauer er meget lav på grund af E6-afhængig nedbrydning vurderede vi virkningerne af øget p53 ved adenoviral-medieret overekspression. I kontrolforsøg HeLa-celler, viste chip assays ringe eller ingen binding af PolII til promotoren og 3’UTR af Notch1 genet, mens en sådan binding var let påviselige i celler med forøget p53-ekspression (fig. 8A). I HKC, hvor niveauet af Klf4 normalt lav, vi evaluerede effekten af ​​øget Klf4 udtryk via retroviral infektion. Chip assays viste binding af PolII til promotoren og 3’UTR af Notch1 genet i kontrol- HKCs, mens ingen sådan binding kunne påvises i celler med forøget Klf4 ekspression (fig. 8B).

(A) HeLa celler blev inficeret med en rekombinant adenovirus, der udtrykker vildtype-p53 (Adp53) eller GFP kontrol (AdGFP) og forarbejdet til chip assays med antistoffer mod RNA-polymerase II (α-PolII) og ikke-immune IgG’er som kontrol. PCR-amplifikation af de angivne regioner i Notch1 genet blev udført parallelt med tilsvarende forstærkning af input kromatin-DNA’et. Højre paneler: til kvantificering af resultaterne, chromatinet immunopræcipiteret materiale blev også analyseret ved real time PCR-amplifikation af de angivne regioner i Notch1 promotoren, parallelt med input chromatin DNA, efterfulgt af en beregning af binding efter samme formel anvendes i fig. 7D. (B) Primære keratinocytter (HKC) blev inficeret med en retroviral vektor overudtrykker Klf4 (pMSKlf4) eller tom vektor kontrol (Ctrl) i 48 timer efterfulgt af chip assays for PolII bindende som i den foregående panel, herunder kvantificering af resultaterne af real time PCR (højre paneler).

Funktionelt, at vurdere, om øget p53-ekspression og Klf4 /Sp3 ned-modulation kan synergi blev to komplementære metoder iværksat. I den første blev HeLa-celler inficeret med en p53 udtrykker adenovirus plus /minus knock-down af Klf4 og Sp3 udtryk. I det andet blev HeLa-celler transficeret med siRNA’er specifikke for UBE3A protein, en negativ regulator af p53 stabilitet, som en metode til at øge endogen p53-ekspression [14]. Øgede p53 niveauer ved enten tilgange forårsagede den forventede induktion af Notch1 ekspression. Den kombinerede knockdown af Klf4 og Sp3 forårsagede også en stigning af Notch1 udtryk, men ingen additive eller synergistiske effekter blev observeret ved samtidig forøget af p53 og knock-down af Klf4 og Sp3 (fig. 9A og B).

(a) HeLa-celler blev transficeret med siRNA’er for Sp3 og Klf4 parallelt med scrambled siRNA kontroller fulgt, 48 timer efter transfektion ved infektion med en p53 udtrykkende adenovirus (Adp53) eller GFP kontrol (AdGFP), i 24 timer. Niveauer af Notch1 mRNA-ekspression blev bestemt ved real-time RT-PCR. De forventede ændringer af p53, Sp3 og Klf4 ekspression blev også bekræftet ved realtids RT-PCR, med resultater svarende til dem, der er vist i foregående figurer. (B) HeLa-celler transficeredes med siRNA’er for UBE3A, Klf4 og Sp3 alene eller i kombinationer som angivet, parallelt med scrambled siRNA kontrol. UBE3A og Notch1 ekspression blev vurderet ved real-time RT-PCR. (C og D) Primære keratinocytter (HKC) (C) og HeLa og SCC13 celler (D blev inficeret med en Klf4 udtrykker retrovirus eller tomme vektor kontrol i 48 timer, efterfulgt af infektion med Adp53 eller AdGFP virus i 24 timer. Notch1 mRNA niveauer blev vurderet ved real-time RT-PCR.

for at vurdere, om Klf4 kan undertrykke de induktive virkninger af p53, HKCs, HeLa og SCC13 celler blev inficeret med Klf4 udtrykker retrovirus eller tomme vektor kontrol, efterfulgt af infektion med p53 udtrykkende adenovirus eller GFP kontrol. øgede p53 niveauer forårsaget induktion af Notch1 ekspression i kontrol HKCs samt i HKCs hvor Notch1 genet blev ned-moduleret som en konsekvens af forøget Klf4 ekspression (fig. 9C). a mere omfattende induktion af Notch1 ekspression blev forårsaget af Ad-p53 infektion af cancerceller, såsom HeLa og SCC13 celler, som deler et muteret eller tavs p53 pathway og lave endogene Notch1 niveauer [9], [11]. i disse celler, som udtrykker højt niveau af endogen Klf4, gjorde yderligere udtryk for Klf4 ikke falde Notch1 udtryk og ikke forstyrre dens induktion af p53 (fig. 9D).

Således p53 og Klf4 konvergere på kontrol af Notch1 gentranskription i den indledende trin i PolII rekruttering, med p53 induktion sker gennem en separat mekanisme fra Klf4 /Sp3 undertrykkelse.

Diskussion