PLoS ONE: metastatiske potentiale og kemoresistens for Human kræft i bugspytkirtlen Stem Cells

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) typisk har kapacitet til at unddrage sig kemoterapi og kan være den vigtigste kilde til metastaser. CSCS til human pancreas ductal carcinoma (PDAC) er blevet identificeret, men hverken metastatisk potentiale eller kemoresistens af disse celler er blevet tilstrækkeligt vurderet. Vi har behandlet disse spørgsmål ved at undersøge side-befolkning (SP) celler isoleret fra Panc-1 og BxPC3 linjer af humane PDAC celler, oncogenotypes hvoraf forskellige. SP-celler kunne isoleres fra monolag af Panc-1, men kun fra sfæroider af BxPC3. Brug ortotopisk xenografter i svært immunkompromitterede NSG mus, fandt vi, at SP celler isoleret fra begge cellelinier producerede tumorer, der var stærkt metastatisk i modsætning til tidligere erfaringer med PDAC cellelinjer. SP celler fra begge cellelinier udtrykte ABCG2 transportør, som var påviseligt ansvarlig for SP fænotype. SP celler gav anledning til ikke-SP (NSP) celler

in vitro

in vivo

, en overgang, der var tilsyneladende på grund posttranslational hæmning af ABCG2 transporteren. Tyve-to andre linjer af PDAC celler udtrykte også ABCG2. Følsomheden af ​​PDAC SP celler til vinca alkaloid vincristin kunne øges kraftigt med verapamil, en generel inhibitor af transportører. I modsætning hertil verapamil havde ingen effekt på drab af PDAC celler ved gemcitabin, den aktuelle first-line terapeutisk for PDAC. Vi konkluderer, at isolationen af ​​SP celler kan være en praktisk og effektivt redskab for studiet af PDAC CSCS; at CSCS kan være de vigtigste forfædre metastase ved menneskelig PDAC; at ABCG2 transportøren er ansvarlig for SP fænotype i humane PDAC celler, og kan være en allestedsnærværende kilde til lægemiddel-resistens i PDAC, men giver ikke resistens over for gemcitabin; og at hæmning af ABCG2 kan tilbyde et nyttigt supplement i en terapeutisk angreb på CSCS af PDAC

Henvisning:. Bhagwandin VJ, biskop JM, Wright WE, Shay JW (2016) metastatiske potentiale og kemoresistens for Human Pancreas Kræft stamceller. PLoS ONE 11 (2): e0148807. doi: 10,1371 /journal.pone.0148807

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Juni 23, 2015; Accepteret 22. januar 2016 Publiceret: 9 feb 2016

Copyright: © 2016 Bhagwandin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Mest relevante data er inden papiret. Microarray data blev brugt fra Gysin undersøgelsen, hvis forfatterne kan kontaktes på [email protected]

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af: 1. National Aeronautics and Space Administration-Specialized Center of Research: NNJ05HD36G (VJB, WEW, JWS), og 2. National Institute of Health, Ruth L. Kirschstein National Research service Award, Institutional Training Grant (T32) for GW Hooper Research Foundation: CA09043 (VJB, JMB)

modstridende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) rækker blandt de mest dødbringende af humane maligniteter. Trods aggressiv kirurgi og anvendelse af moderne neoadjuverende og adjuverende kemoterapi, den samlede 5-års overlevelse er ca. 10-26% afhængigt af alvorligheden af ​​formidling (cancer.org og cancer.net). Kemoterapeutiske midler, såsom gemcitabin reducere primær tumorbelastning, men undlader at eliminere metastatisk leversygdom, den største årsag til dødelighed i PDAC. Kræft stamceller hypotese antyder, at en lille population af stamceller-lignende celler er ansvarlig for den vedvarende vækst af en tumor og modstand mod kemoterapeutiske midler [1]. Desuden er det blevet foreslået, at CSCS kan være den umiddelbare kilde af metastatiske celler, der uløseligt modstå kemoterapi [1,2]. Flere grupper har isoleret og karakteriseret pancreas CSCS ved anvendelse af kombinationer af celleoverflademarkører [enten CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ [3], eller CD133

+ /CXCR4

+ [4]], eller af SP fraktionering [5-8]. Den CSCS udtrykker CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ fås fra patientprøver eller CD133

+ /CXCR4

+ fra cellelinier har vist sig at være yderst tumorigen i NOD /SCID mus [3,4]. Men den metastatiske potentiale tumorer afledt af CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ CSCS er ikke blevet rapporteret, og tumorer fremkaldt med CD133

+ /CXCR4

+ CSCS var kun svagt metastatisk [4]. Alternativt er proceduren for SP fraktionering blevet anvendt til at berige for pancreas CSCS, men tumorer initieret af disse CSCS også metastaseret dårligt [5,6]. Vi har brugt ortotopisk injektion i alvorligt immundeficiente mus at forbedre evalueringen af ​​SP celler afledt fra PDAC cellelinier. Vores resultater tyder på, at CSCS inkluderet i PDAC SP fraktioner kan være stamfædre af metastaser, og vise, at transportøren ABCG2 er en udbredt, hvis ikke allestedsnærværende kilde til potentiel modstand lægemiddel i PDAC, men er ikke ansvarlig for resistens over for den første linje terapeutisk gemcitabin. SP celler afledt af humane PDAC cellelinjer tilbyder en bekvem middel til at udforske mekanismerne i tumorigenese, metastase og resistens.

Materialer og metoder

cellelinier

Bugspytkirtelkræft cancercellelinier blev opnået fra ATCC (Manassas, VA) og dyrket i DMEM i Panc-1-celler, eller RPMI for BxPC3 celler suppleret med 10% FBS. Den BxPC3 cellelinje blev også dyrket som sfæroider ved anvendelse uovertrukne bakteriologiske petriskåle (ikke-TC) og serum-frit DMEM suppleret med B27 (Invitrogen), en proprietær reagens, der vides at fremme væksten af ​​CD133

+ /CXCR4

+ CSCS [9]. Den binyrebarkkræft cellelinje H295 blev dyrket i DMEM suppleret med insulin, transferrin og selen (ITS), og 10% FBS.

In Vitro

Farmakologi

Til dosis respons-undersøgelser med gemcitabin, 1500 SP celler fra Panc-1 eller 10000 SP celler fra BxPC3 blev udpladet i 96-brønds skåle og behandlet 24 timer senere med to-fold seriefortyndinger af gemcitabin med eller uden 20 uM af verapamil. For vincristin undersøgelser, Panc-1, BxPC3, eller H295 SP-celler blev udpladet i skåle med 96 brønde. Hver cellelinje blev behandlet med to-fold seriefortyndinger af vincristin med eller uden 50 pM af verapamil. Efter en uge blev cellerne farvet under anvendelse af MTT-assayet. I hvert eksperiment blev BxPC3 celler dyrket som sfæroider på ikke-TC 96-brønds skåle i serumfrit DMEM suppleret med B27.

MTT assay

MTT-assayet blev anvendt til bestemmelse af grad af kemoresistens i SP og NSP-celler. Mediet fra lægemiddelbehandlede celler blev erstattet med 100 pi MTT substrat (5 ug /ml) fortyndet i assaymedier (phenol-fri DMEM, 25 mM HEPES, 1 mM Na-pyruvat) og anbragt i en vævskultur-inkubator i 4 timer. Substratet blev erstattet med 100 pi af opløsning opløsning (10% Triton X-100, 0,1 N HCI, 80% isopropanol) og forsigtigt omrystet i 5 minutter. Pladerne blev aflæst i en Tecan2 pladelæser ved en påvisning bølgelængde på 570 nm, og reference for 690 nm.

immunfarvning af ABC transportører Salg

Panc-1, BxPC3 eller H295 celler blev trypsiniseret, vasket to gange med PBS, fikseret med 0,1% PFA i 10 minutter og permeabiliseret med 0,3% saponin i FACS-buffer. Begge celletyper blev farvet med BXP-53 (ABCG2, Santa Cruz) eller G-1 (ABCB1 /MDR-1, Santa Cruz) antistof fortyndet 1: 100 i FACS-buffer i 30 minutter på is, vasket to gange med PBS, farvet med FITC 1: 1000 i FACS-buffer i 30 minutter på is, vasket med PBS og analyseret på en FACSaria. Immunhistokemi: 5 um snit blev skåret fra paraffinindlejrede væv af primære tumorer, deparaffinerede med xylener, hydreret gennem graduerede alkoholer til PBS. Sektionerne blev underkastet varme epitopgenfinding, og resterende peroxidaseaktivitet blev standset med PBS /3% hydrogenperoxid mix. Farvning blev udført under anvendelse af Vectastain ABC elite kanin IgG kit (cat # PK-6101, Vectorlabs) med ABCG2 primære antistof 1:. 100 fortynding natten over (cat # GTX100436, Genetex) og modfarvet med Meyers hematoxylin

Side befolkning assay

SP assays blev udført som tidligere beskrevet [7,10]. Kort fortalt, 1 x 10

6 celler blev farvet med Hoechst 33342 (HOE) i en endelig koncentration på 5 ug /ml og verapamil kontroller blev forbehandlet med 100 uM af verapamil i 10min. Alle prøver blev inkuberet ved 37 ° C grader i 60 minutter med intermitterende blanding hvert 15. minut. Celler blev opsamlet og resuspenderet i PBS med 3% BSA, 0,01% DNase I, og 1 ug /ml propidiumiodid og filtreret gennem en 40 uM cellesigte. De BxPC3 sfæroider blev dissocieret ved normal trypsinisering før HOE farvning. Immuno-inhiberingsassay: før HOE farvning, Panc-1, BxPC3 og H295-celler blev forbehandlet med 5 ug af enten ABCG2 antistof, 5D3 (R og BxPC3 celler, der indeholder et tab af funktion mutation i

Smad4

CDKN2A

gener (som begge er relativt sjældne i PDAC) [12]. SP-fraktionen blev bestemt ved påvisning udelukkelse af det DNA-bindende farvestof Hoechst 33342 (HOE) af celler, en angivelse af transportør aktivitet [4,10]. Porten til SP blev bestemt ved verapamil hæmning, en bredt aktiv transporter antagonist. En SP fraktion 10% blev påvist i Panc-1-celler (Fig 1A), men i modsætning til en tidligere rapport [5], kan en SP fraktionen ikke påvises i BxPC3 celler opformeret i konventionel medium som 2D monolag (figur 1A). SP fraktionen tidligere rapporteret i BxPC3 celler blev ikke testet i et biologisk assay og derfor kan være et problem for flowcytometri instrumenttype, instrumentindstillinger eller farvning metode. I et forsøg på at afdække CSCS i BxPC3 cellelinje blev fraktionerede celler dyrket som sfæroider under betingelser, der skal fremme overlevelse og opformering af normale stamceller (se materialer og metoder). Dette gav en SP brøkdel af 5% i de kulturer BxPC3 spheroids (Fig 1B). I modsætning hertil Panc-1-celler ikke trives ved dyrkning under betingelserne anvendt med BxPC3 og kunne ikke anvendes til SP fraktionering. Evne sphæroider at afsløre SP fænotype i BxPC3 er i overensstemmelse med tidligere rapporter, at CSCS er beriget med sfæroider [13-15]. Det er bemærkelsesværdigt, at de to PDAC cellelinjer har tydeligt forskellige oncogenotypes, der kan tage højde for forskellene i deres SP indhold og svar på de specialiserede medium.

(A) Panc-1 og BxPC3 celler blev farvet med Hoechst 33342 farvestof (5 ug /ml) og analyseret med et FACSaria flowcytometer, som beskrevet i Materialer og Metoder. Porten til SP celler blev bestemt ved behandling med verapamil (100 uM). Fraktionen af ​​celler i SP gate er givet i hvert panel. Profil af Panc-1 celler, øverste række; og BxPC3 celler, nederste række; verapamil kontrol (VP), højre paneler. (B) Øverste række: BxPC3 celler blev dyrket enten i standardmedium på vævskulturskåle (TC), i serumfrit DMEM med B27 (SFDB) på TC retter, eller som sfæroider i SFDB på uovertrukket bakteriologiske (ikke-TC) petri retter. Nederste række:. Kvantificering af SP ved FACS sortering for hver kultur tilstand, verapamil kontrol (VP), yderst til højre panel

tumorfremkaldende potentiale SP og NSP celler

Baseret på vores fortolkning af de offentliggjorte data [3,5,6,8], CSCS beriget ved selektion for celleoverflademarkører er væsentligt mere effektiv end SP CSCS i tumorigenese analyser. I et forsøg på at forbedre effektiviteten af ​​SP CSCS i analyser for tumorigenese, vi udnyttet ortotopisk injektion i pancreas af NSG mus, hvis alvorlig immundefekt gør dem særdeles følsomme over for tumorigenese ved xenografter [16]. Vi orthotopisk injiceret 500, 5000, eller 50000 af SP eller NSP celler fraktioneret fra luciferase-mærkede Panc-1 monolag eller BxPC3 sfæroider. Luciferase blev anvendt til at opnå billeder fra injicerede mus. Vi fandt, at 500 SP-celler var tilstrækkelig til at frembringe tumorer inden for to uger i hele kohorte af fem mus, hvorimod 500 NSP-celler gjorde dette på kun en enkelt mus ud af fem (fig 2A og 2B). Med tre måneder, men alle dyrene havde udviklet pancreas tumorer (se nedenfor, fig 3A). Disse resultater er en bestemt forbedring på tidligere erfaring med SP-celler, i hvilke et minimum på 10.000 celler blev forpligtet til at indlede tumorigenese, der var detekterbar inden for 4-5 uger [5,6]. Vi konkluderer, at vores protokol har forbedret effektiviteten af ​​tumorigenese ved CSCS indeholdt i SP fraktion fra PDAC cellelinier. Salg

SP og NSP celler blev opnået ved fraktionering ved anvendelse af portene, der er vist i figur 1. tumorfremkaldende potentiale SP og NSP blev testet ved orthotopisk injektion af 500, 5000, eller 50000 celler af luciferase-mærkede celler fra hver population ved anvendelse kohorter af fem NSG mus for hver dosis af celler. Efter to uger blev den relative mængde af tumor volumen detekteret ved hjælp af real-time

in vivo

bioluminescens billeddannelse. (A) Panc-1 monolag celler (B) BxPC3 sfæroider celler. (C) Histogram af tumorincidensen for hver kohorte af fem NSG mus, Students

t

test =

P

. 0,002

SP og NSP celler isoleret fra Panc-1 monolag og BxPC3 sfæroider, så orthotopisk injiceres som 500 celle alikvoter i kohorter af tre NSG mus. Dyrene blev opretholdt i tre måneder og derefter undersøgt for primære og metastatiske tumorer. (A) Sammenligning af primære tumorer og metastaser genereret af SP, højre spalte og NSP-celler, venstre kolonne isoleret fra Panc-1 monolag og metastaser isoleret fra BxPC3 sfæroider. Den øverste række viser primære tumorer og den anden række illustrerer metastaser for begge cellelinier. (B) Tumorceller blev isoleret fra primære og metastatiske tumorer og analyseret for SP-indhold. Primær tumor, toppaneler; metastatisk site, bundpaneler. (C-D) SP og NSP-fraktioner blev isoleret fra Panc-1 og BxPC3 celler og udpladet igen i kultur, ved hjælp af standard medium til celler fra Panc-1 på normale vævskulturskåle og sfæroide medium til BxPC3 celler på ikke-TC retter. Efter en uge uden passage blev hver belagt fraktion analyseret ved FACS. Procentdelen af ​​celler i SP porten er givet i hvert panel.

Metastatisk potentiale SP CSCS

De seneste oplysninger tyder på, at CSCS kan være kilden til metastatisk sygdom [17,18 ]. Men tidligere bestræbelser ikke opnået kraftig metastase med CSCS beriges ved anvendelse af enten celleoverflademarkører eller SP fraktionering. Dette var tilfældet for celler, der repræsenterer enten PDAC eller andre former for malignitet [3,4,19-24]. I et forsøg på at forøge metastase af tumorer dannet ud fra SP-celler, vi igen anvendes ortotopisk injektion i NSG mus. Vi isolerede SP og NSP-fraktioner fra Panc-1 monolag celler og BxPC3 sfæroide celler, derefter injiceret 500 af disse celler ind i pancreas af tre NSG mus i hver kohorte. Med tre måneder, havde både SP og NSP-celler fra hver cellelinie producerede primære tumorer på ca. 1 cm i størrelse (fig 3A). Derudover var der alvorlig metastatisk leversygdom i musene injiceret med SP-celler, næsten effacing den normale leverparenkym (Fig 3A, højre paneler). De dyr, der havde modtaget NSP-celler indeholdt også levermetastaser, men metastaserne blev begge få i antal og signifikant mindre (Fig 3A, venstre paneler). Vi konkluderer, at tumorer produceret med SP celler afledt fra enten monolag eller sfæroider er aggressivt metastatisk.

Primære tumorer initieret med SP-celler fra enten Panc-1 eller BxPC3 indeholdt en SP brøkdel af nogenlunde samme størrelse som den, der findes i cellelinierne (figur 3b). Desuden er størrelsen af ​​SP fraktionen var endnu lavere i metastaser (fig 3B) efter aftale med tidligere rapporter [8,25]. Disse resultater antyder, at CSCS eller andre komponenter af SP fraktionen population fostret mange NSP-celler under tumorgenese og metastase. blev observeret yderligere beviser for en sådan begivenhed, når SP og NSP-celler blev fraktioneret fra Panc-1 monolag og BxPC3 sfæroider, og derefter dyrket

in vitro

uden passage. Efter en uge, med kun 2,5 fordoblinger, et stort flertal af de dyrkede SP celler fra begge linjer nu fraktioneret som NSP-celler (Fig 3C og 3D), og således synes at replikere de begivenheder, der fandt sted

in vivo

under løbet af tumorigenese. I modsætning hertil de dyrkede NSP-celler fra begge linjer indeholdt beskedne mængder af SP-celler (fig 3C og 3D). Dette fund kunne repræsentere enten et spor forurening af NSP fraktion eller et lavt niveau af omdannelse af NSP-celler til SP fænotype. Uanset deres kilde, tilstedeværelsen af ​​SP-celler i NSP fraktion udgør en potentiel forklaring på tumoren initieret af NSP fraktionen i fig 2A, den tilsyneladende evne NSP celler til at producere tumorer i en forsinket måde (Fig 3A), og metastaserne der fandt sted i mus, som fik NSP-celler (fig 3A).

ABCG2 er ansvarlig for SP fænotype i PDAC cellelinjer

ATP bindende kassette (ABC) transportvirksomheder er en vigtig kilde til narkotika resistens i humane tumorer [26,27]. To af disse transportører, ABCG2 /BCRP og ABCB1 /MDR-1, angives at være de vigtigste kilder til SP fænotype i humane tumorcellelinier [19,20]. Det er tidligere blevet rapporteret, at PDAC celler udtrykker ABCG2, men ikke MDR-1 [5,6,28,29]. Men ABCG2 aktivitet er afhængig af ekspression på celleoverfladen, som reguleres af posttranslationel modifikation og opdeling [30]. Derfor har vi farvet for de to transportører på overfladen af ​​Panc-1 og BxPC3 celler. Som kontrol anvendte vi H295 celler, adrenocorticale carcinomaceller, som udtrykker MDR-1 [31,32]. Vi fandt, at Panc-1 og BxPC3 celler udtrykte kun ABCG2 på deres overflade, hvorimod H295 celler udtrykte kun MDR-1 (fig 4A). De FACS data viser, at hele befolkningen i Panc-1 og BxPC3 celler udtrykte ABCG2 (Fig 4A), og vi opnåede lignende resultater ved at bruge immunhistokemi at undersøge primære tumorer genereret fra SP og NSP celler, og fire humane PDAC patientprøver (Fig 4B og 4C).

(A) Cell overflade farvning af ABCG2 (5D3-antistof) og ABCB1 /MDR-1 (MRK-16-antistof) på Panc-1 monolag celler, BxPC3 sfæroide celler og H295 celler. (B) Immunhistokemi farvning af ABCG2 om SP og NSP genereret primære tumorer (positiv DAB pletten, brun). (C) Immunhistokemi farvning af ABCG2 på primære PDAC tumorer fra fire patienter (positiv DAB pletten, brun).

allestedsnærværende ABCG2 i cellepopulationerne rejst uortodokse mulighed for, at transportøren ikke var ansvarlig for SP fænotype. For at teste denne mulighed, behandlede vi cellerne med blokerende antistoffer for ABCG2 [33] og MDR-1 [34] før udførelse af SP fraktionering. Inhibering af ABCG2 reducerede SP brøkdel af Panc-1-celler og BxPC3 sfæroider til 1,04% (9,5 gange reduktion) og 0,01% (400 gange reduktion), (fig 5). I modsætning hertil inhibering af MDR-1 havde ingen virkning på SP indholdet af de to PDAC cellelinier, men reducerede SP fraktionen i H295-celler med mere end ni gange (figur 5). Vi konkluderer, at ABCG2 transporteren er ansvarlig for SP fænotype i Panc-1 og BxPC3 celler. På trods af den allestedsnærværende transportøren i cellepopulationer, skal det være aktiv i kun den begrænsede del af cellerne slags som SP. Det er tidligere blevet rapporteret, at aktiviteten af ​​ABCG2 er underlagt posttranslationel kontrol fra Akt [30], som kan forklare eksistensen af ​​NSP-celler.

Inhibering af SP fænotype. Celler blev behandlet med blokerende antistoffer for ABCG2 (5D3) og MDR-1 (MRK-16), og derefter fraktioneret ved FACS som beskrevet i Materialer og Metoder. H295, øverste række; Panc-1 monolag, midterste række; og BxPC3 sfæroider, nederste række. Kolonner 1-4 er som mærket i figuren:. Ubehandlet, verapamil (VP), 5D3 antistof, og MRK-16 antistof

For at afgøre, hvor udbredt udtryk for ABCG2 muligvis i PDAC, vi opnåede tidligere offentliggjorte microarray data fra 22 bugspytkirtelkræft cellelinjer [35] og sammenlignede udtryk for ABCG2 som i MDR-1. Tre normale pancreatiske epiteliale cellelinjer blev også analyseret i arrayet undersøgelsen og blev anvendt her til at normalisere cancercellelinie data. Påfaldende er alle pancreascancer cellelinie udtrykte ABCG2 2-5 fold over normale pancreatiske epiteliale cellelinjer, hvorimod ingen af ​​cellerne udtrykte MDR-1 (figur 6). Vi konkluderer, at ekspression af ABCG2 kan være en allestedsnærværende egenskab ved PDAC celler, måske repræsenterer en atavisme fra en normal stilk-lignende celle, der giver anledning til CSCS, og således, at tumorer.

Microarray analyse af ABCG2 og MDR -1 i 22 bugspytkirtelkræft cellelinjer [36]. Den log

2 udtryk data for ABCG2 og MDR-1 fra tre ikke-maligne humane pancreas duktale epiteliale cellelinjer (hPDEC; # 904, # 916, # 515) blev midlet og trækkes fra loggen

2 fra hver kræft i bugspytkirtlen cellelinie og afbildet som en vandfald og Manhattan plot, Students

t

test =

P

. 0,001

Den ABCG2 transporter ikke giver modstand til gemcitabin

gemcitabin er generelt den første linje behandling til patienter med PDAC, men den dystre overlevelsesraten for sygdommen afspejler et relativt begrænset reaktion på lægemidlet. Modstanden i PDAC SP celler til gemcitabin er blevet tilskrevet udstrømning af ABCG2 [5]. Hvis det var korrekt, så hæmning af transportøren ved bredt aktive antagonist verapamil bør øge følsomheden af ​​PDAC celler til gemcitabin [27]. Vi bekræftede først tilstedeværelsen af ​​transporteren-medieret resistens i PDAC cellelinjer ved behandling SP-celler fra Panc-1, BxPC3 og H295 med enten vincristin eller en kombination af vincristin og verapamil (Fig 7A, 7C og 7E og tabel 1). Verapamil stærkt forbedret drabet ved vincristin af SP celler fra alle tre linjer. I modsætning hertil verapamil havde ingen effekt på drab af Panc-1 og BxPC3 SP celler ved gemcitabin (figur 7B, 7D og 7E og tabel 1), hvilket viser, at tilstedeværelsen af ​​ABCG2 eller MDR-1 havde ikke er tildelt resistens mod gemcitabin på enten cellelinie. Vi konkluderer, at transportøren normalt er bosiddende i PDAC celler ikke bidrager til de begrænsninger af gemcitabin som terapeutisk for sygdommen.

Dosis respons af SP celler fra (A) H295, (C) Panc-1 monolag celler, og (E) BxPC3 sfæroide celler til vincristin (VCR) og kombinationen af ​​vincristin med verapamil (VCR-VP) blev bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. Tilsvarende blev dosisrespons af SP-celler fra (B) H295, (D) Panc-1 monolag celler og (E) BxPC3 sfæroide celler til gemcitabin (GEM) og kombinationen af ​​gemcitabin med verapamil (GEM-VP) bestemt under anvendelse af MTT-assayet. Alle datapunkter blev dannet fra et enkelt forsøg og repræsenterer middelværdien af ​​seks brønde pr koncentration behandling, normaliseredes til middel af seks interne ubehandlede kontrolbrønde, derefter transformeret ved naturlig log og vises som en fire-parameter variabel plot som funktion af log ( lægemiddel) versus respons. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse for middelværdi (SEM) fra seks brønde i et enkelt eksperiment, alle graferne blev dannet ved anvendelse Prism statistisk analyse software, Students

t

test =

P

0,0002 .

diskussion

SP celler af PDAC

Etablerede linjer af humane cancerceller har længe været anvendt som eksperimentelle surrogater for prøver taget direkte fra tumorer for både studiet af tumorigenese og screening for nye lægemidler. Nytten af ​​cellelinjer afledt af human PDAC dog er blevet kompromitteret af svigt af tumorer fremstillet med sådanne celler til at vise den robuste metastaser, der er så typisk for den kliniske sygdom. Her demonstrerer vi en løsning på dette problem. Når orthotopisk sprøjtes ind svært immunkompromitterede NSG mus, SP celler fra PDAC cellelinjer gav anledning til tumorer, der var aggressivt metastatisk. I modsætning hertil NSP-celler var mindre tumorigene, og de resulterende tumorer var dårligt metastatisk. Da SP fraktionen beriget for CSCS, disse resultater er i overensstemmelse med den opfattelse, at CSCS kan være de vigtigste stamfædre for metastaser [2,17,18]. Neoplastiske organoids afledt af både murine og humane PDAC også give anledning til metastatisk sygdom, når podet orthotopisk i immunkompromitterede mus [16]. Det er stadig uvist, om metastaser i dette system stammer fra en karakteristisk undergruppe af celler i tumorerne, og i så fald, om de er de CSCS af tumoren.

En nylig rapport har beskrevet adskillelse af CSCS fra SP fraktionen af ​​flere tumortyper ved anvendelse af autofluorescens [15]. I modsætning hertil SP fraktion, som vi afledt af PDAC cellelinjer viste en beriget evne til at producere meget metastatiske tumorer, egenskaber på forekomst af CSCS. Vi bemærker, at der var en væsentlig forskel på, hvordan de to undersøgelser forberedt celler til FACS sortering. Ellers kan vi ikke forklare forskellen mellem de to sæt resultater.

For at opnå en SP fraktion fra BxPC3 cellelinie, måtte vi udbrede cellerne under betingelser, der fremmet vækst som sfæroider. Vi kan tænke på to mulige forklaringer på denne observation. For det første kan SP-celler være til stede i linjen, men i antal for lavt til påvisning af SP fraktionering. Da vækstbetingelserne var designet til at favorisere stamceller-lignende celler, kan de give en selektiv fordel for overlevelse og formering af SP celler, herunder delmængden af ​​disse celler, der opfører sig som CSCS i tumorigenese assays. Det er bemærkelsesværdigt, at sfæroiderne har ry for at være sagens natur beriget for CSCS [9,13,14]. Alternativt kan cellekulturmediet fremme konvertering af NSP til SP celler, svarende til konvertering fra ikke-CSCS til CSC tidligere beskrevet til human melanom og brystkræft [37,38]. Vi fik en antydning af en sådan konvertering fra tilstedeværelsen af ​​SP celler i kulturer af NSP celler, selv om SP cellerne kunne være opstået i stedet fra en selektiv fordel, at kontaminerende SP celler ved formering

in vitro

. Uanset forklaringen på adfærd BxPC3 celler, resultaterne tyder på, at dyrkning af celler som sfæroider kan være et generelt middel til at afdække en SP fænotype i tumorcellelinier, der ellers ikke viser, at fænotype.

Tidligere rapporter har beskrevet evne SP celler at gyde NSP-celler [21-25,39-41], meget som CSCS tjene som kilde til de mere modne celler, der udgør hovedparten af ​​tumorer. I overensstemmelse med disse iagttagelser, der var en overflod af NSP celler i PDAC tumorer initieret af SP celler i vore eksperimenter, og dyrke SP celler

in vitro

resulterede i NSP celler hurtigt at blive det store flertal af befolkningen. Da hele populationen af ​​celler indeholder ABCG2, en mulig forklaring på overgangen til NSP fænotype er den tidligere beskrevne posttranslationel hæmning af transportør aktivitet ved Akt [30].

Den ABCG2 transportør som mægler af SP fænotype og kemoresistens

Vi identificerede ABCG2 transporteren som mægler af SP fænotype i Panc-1 og BxPC3 celler, og fandt udtryk for, at transporter i toogtyve andre PDAC cellelinjer. Den tilsyneladende allestedsnærværende ABCG2 i PDAC celler antyder, at ekspression af transportøren kan være en tilbagevenden til en evolutionær nedarvet type, der ligner en normal stam- eller progenitorcelle, der giver anledning til stamcellen for PDAC. Det er fortsat uklart, i hvilket omfang ABCG2 er ansvarlig for den ildfaste natur PDAC. På den ene side, observerede vi, at ABCG2 ikke udstrømning gemcitabin, en førende lægemiddelkandidat til behandling af PDAC.