PLoS ONE: selvstyrende Stimulering af Cancer Cell Plasticitet af Human NKG2D lymfocyt receptor co-udtrykt med dets ligander på kræftceller

Abstrakte

Den stimulerende NKG2D receptor på lymfocytter fremmer tumor immun overvågning ved at målrette ligander selektivt induceret på kræftceller. Voksende tumorer modvirke ved at ansætte taktik at deaktivere lymfocyt NKG2D. Dette negative dynamiske er eskaleret som nogle menneskelige kræftceller co-opt udtryk for NKG2D og dermed supplere tilstedeværelsen af ​​dets ligander for autonom stimulering af onkogen signalering. Kliniske forening data indebærer relationer mellem cancerceller NKG2D og metastatisk sygdom. Her viser vi, at NKG2D fremmer kræftcelle plasticitet ved induktion af fænotypiske, molekylær og funktionelle signaturer diagnostiske af epitel-mesenkymale overgang, og stamceller-lignende træk

via

induktion af Sox9, et centralt transkriptionel regulator af brystkræft stamcelle vedligeholdelse. Disse resultater er opnået med model bryst tumor linjer og xenotransplantater blev sammenfattet af

ex

vivo

kræftceller fra primære invasive brystcarcinomer. Således kan NKG2D har kapacitet til at køre højmalign træk underliggende metastatisk sygdom

Henvisning:. Cai X, Dai Z, Reeves RS, Caballero-Benitez A, Duran KL, Delrow JJ, et al. (2014) selvstyrende Stimulering af Cancer Cell Plasticitet af Human NKG2D lymfocyt receptor co-udtrykt med dets ligander på kræftceller. PLoS ONE 9 (10): e108942. doi: 10,1371 /journal.pone.0108942

Redaktør: Eric Vivier, INSERM- CNRS- Univ. Méditerranée, Frankrig

Modtaget: Maj 16, 2014; Accepteret: August 27, 2014; Udgivet: 7 okt 2014

Copyright: © 2014 Cai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data (undtagen microarray data – se nedenfor) er inden for papiret og dets Støtte Information filer. Microarray data er tilgængelige på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/under tiltrædelsen kode GSE53961

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud P50 CA083636 og National Institutes of Sundhed tilskud R01 CA174470. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft celle plasticitet indebærer udvikling af egenskaber gør det muligt kræftceller til at tage afstand fra primær tumor, formidle, og udvide klonalt på fjerne steder. Denne proces er reguleret af epitel-mesenkymale overgang (EMT), og den indbyrdes erhvervelse af regenerativ cancer stamceller (CSC) attributter [1], [2]. Kendte førere af kræft celle plasticitet omfatter heterotypiske signaler fra tumor-associerede stromale og /eller immunsystem [1] celler. Vi har tidligere identificeret en utraditionel homotypisk receptor-ligand interaktion på kræftceller [3], og viser her, at resulterende signalering inducerer omprogrammering mod vandrende og dæmme-lignende kapacitet.

involveret receptor, NKG2D (natural killer gruppe 2 medlem D ), er en aktiverende lymfocytreceptoren primært på NK-celler og CD8 T-celler og er bedst kendt for at mediere immunovervågning af virusinficerede og maligne celler [4]. Humane NKG2D signaler

via

DAP10 (DNAX-aktiverende protein 10) adapter, som binder enten PI3K (phosphoinositid 3-kinase) eller Grb2 (vækstfaktorreceptor-bundet protein 2), dermed aktivere PKB /AKT (protein kinase B) eller MAP (mitogenaktiveret protein) kinase kaskader [5]. Ligander for NKG2D i mennesker omfatter glimmer og MICB (MHC klasse I-relaterede kæder A og B) og seks medlemmer af ULBP (UL-16 bindende protein) familie [6]. NKG2D ligander er stort set fraværende fra overfladen af ​​normale celler, men kan induceres af onkogenese-associerede stressreaktioner i cancerceller [7]. Denne selektive ligand udtryk giver NK-celler og CD8 T-celler til at målrette kræftceller, i hvert fald i de tidlige tumor stadier før immunosuppressive taktik voksende tumorer kvæle denne arm af immunresponset [4], [8].

I Ud over at modvirke immunreaktioner, nogle kræftceller co-opt NKG2D til deres egen fordel, supplerer tilstedeværelsen af ​​dets ligander for selvstændige stimulering af tumorigenese [3]. Variable proportioner af bryst-, ovarie-, prostata-, og tyktarmskræft celler udtrykker signalering dygtige NKG2D-DAP10 komplekser, der aktiverer den PI3K-AKT-mTOR (pattedyr mål for rapamycin) signalering akse og nedstrøms effektorer. Hertil kommer, som i lymfocytter, NKG2D-DAP10 stimulerer phosphorylering af ERK (ekstracellulær signal-reguleret kinase) og JNK i MAP kinase kaskader [3]. Patofysiologisk betydning af NKG2D-DAP10 signalering understøttes af en klinisk forbindelsesundersøgelse der etableres positive korrelationer mellem procentdele af cancerceller med overfladen NKG2D og tumorstørrelse og spredes [3]. Disse forbindelser var forlænget ved signifikante sammenhænge med lymfeknudemetastaser og ved trend korrelationer med grad og lymphovascular invasion, hvilket tyder NKG2D-DAP10 virkninger i formidling af tumorceller og metastasedannelse [3]. Den foreliggende undersøgelse omhandler kapacitet NKG2D-DAP10 at fremme kræft celle plasticitet underliggende metastatisk sygdom.

Resultater

Induktion af EMT omprogrammering af ligand stimulering af NKG2D

epiteltumor linjer udtrykker typisk NKG2D ligander men er enten negative for deres NKG2D-DAP10 receptor eller, som med MCF-7, BT-20, og MDA-MB-453 brystcancerceller linjer, næppe positiv som afspejlet ved minimale forskydninger af flowcytometri profiler og absolut lav NKG2D og DAP10 mRNA og protein-ekspression (figur S1A og S1B; se også figur 2B og 2C i referencerne 3 og 9, henholdsvis). Denne mangel på receptoren i tumor linier er imod relative rigdom, både mRNA og protein udtryk, på positiv

ex

vivo

kræftceller (Figur S1c-E, også henvise til figur 1C -E i henvisning 3). For at teste i en

i

vitro

model hvorvidt NKG2D inducerer EMT, vi således undersøgt MCF-7 celler, der var stabilt transficeret med NKG2D-DAP10 (MCF-7-TF celler), hvilket resulterer i overfladen udtryk på niveauer svarende til

ex

vivo

kræftceller (sammenligne figur S1c og figur S1F). Ved fasekontrastmikroskopi, MCF-7-TF celler udviste morfologiske transformationer i sammenligning med mock-transficerede kontrolceller, som udviste stramt grupperet brosten-lignende former. MCF-7-TF-celler, i modsætning hertil viste fibroblastlignende morfologier (figur 1A). Disse ændringer skyldtes ektopisk ekspression af NKG2D-DAP10 som den parentale fænotype blev restaureret ved rekombinant lentivirus-medieret RNAi målretning af NKG2D i MCF-7-TF-KO-celler (figur 1A, for flowcytometri profiler af disse model linjer se Figur S1A og S1F). Disse observationer antydede, at ligand-medieret stimulering af NKG2D resulterede i induktion af EMT, som involverer koordinerede molekylære og cellulære ændringer som fører til tab af epitelcelle-celleadhæsion, polaritet, og cytoskelet integritet, samtidig med erhvervelse af mesenchymale protein signaturer, spindel-celle former og invasive og vandrende evner [10], [11]. Diagnostisk for EMT er reduceret ekspression af cellen junction-associerede E-cadherin, og induktion af N-cadherin og cytoskeletale mellemliggende filament vimentin. Ved immunfluorescens mikroskopi, MCF-7-TF celler udviste de ændringer i epitel- og mesenchymale markørproteiner, der blev vendt ved RNAi målretning af NKG2D (figur 1A). Tilsvarende resultater blev opnået ved immunoblot og RT-PCR profilering (figur 1B). Udvidelse af data til supplerende markørproteiner og deres tilsvarende mRNA’er, herunder epiteliale stramme forbindelsesepitoper zona occludens-1 (ZO-1) og occludin, cytokeratin 19 (CK19) og mucin 1 (MUC1), og fibroblastoid α-glatmuskelactin (α -SMA), gav overensstemmende resultater (figur 1A og 1B) [12]. EMT er arrangeret af transkriptionsfaktorer, der omfatter Snail1 /2, Twist1 /2, Zeb1 /2, og LEF-1 [1]. Induktion af mRNA’erne for alle disse faktorer, undtagen for Zeb1 blev registreret med MCF-7-TF men ikke MCF-7-TF-KO-celler (Figur 1B). Inkubation af MCF-7-TF celler med en cocktail af antistoffer til relevante NKG2D ligander inhiberede alle registrerede protein og mRNA ændringer, hvilket således bekræfter ligand engagement (figur 1B) [3]. Vores tidligere undersøgelse fastslået kravet om celle-celle-kontakt for ligand-medieret stimulering af NKG2D-DAP10 signalering i cancerceller [3]. Derfor, som det ses ved flowcytometri, andelene af overfladen E-cadherin

-. /N-cadherin

+ mesenkymale MCF-7-TF celler korreleret med cellekultur sammenflydning (figur 1C)

(A) fasekontrastmikroskopi viser overgangen fra epithelial til fibroblastoid figurer af MCF-7-TF versus mock-transficeret kontrol, og fænotypisk reversion af MCF-7-TF-KO celler, der udtrykker NKG2D RNAi. Ved immunfluorescens mikroskopi, MCF-7-TF celler udviser formindsket E-cadherin, ZO-1, occludin, og MUC1, og induceret N-cadherin og vimentin. (B) Tilsvarende immunoblot (øverste felt) og RT-PCR (midterste panel) data, herunder den yderligere CK19 og α-SMA markører. Tab af epitel- og forstærkningen af ​​mesenchymale markører er svækket, når MCF-7-TF-celler præinkuberes med antistof cocktail til NKG2D ligander. Nederste panel viser EMT-associerede transkriptionsfaktor RT-PCR profiler af MCF-7-TF og styreledninger og dæmpning af tab og gevinst begivenheder ved antistof maskering af NKG2D ligander. (C) Flowcytometri af MCF-7-afledte linier dyrket til lav eller høj sammenløb for E-cadherin og N-cadherin. Tal i kvadranter indikerer celle proportioner i procent. Bemærk, at denne opdagelse er mere følsom derefter fremgangsmåden anvendt i (A). (D) Eksempler data, der viser øget

i

vitro

migration og invasion af MCF-7-TF versus mock transficeret negative kontrol og MCF-7-TF-KO celler. Tilstedeværelsen af ​​anti-ligand-antistof cocktail reverserer motilitet gevinster. Tal angiver celletal i tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter. (E) Grafisk visning af motilitet data med søjler, der repræsenterer gennemsnitlige celletal (+/- SD) stammer fra tre uafhængige forsøg med hver fire mikroskopiske felt tæller. En asterisk angiver

s

0,005. (F) Billeddannelse af MCF-7-TF cellemigration versus kontrol linjer i sårheling assays ved fasekontrastmikroskopi over tid. (G) RT-PCR af Snail1, Snail 2, og Sox9 fra forældrenes, NKG2D-udtømte eller scrRNAi-transducerede MCF-7 celler.

(A) ved fasekontrastmikroskopi, MCF-7- TF celler tilbage til epithelmorfologi når de udsættes for inhibitorer af PI3K (LY294002) eller pan-AKT (AKTV), men ikke af MEK1 /2 (U0126) eller JNK (SP600125). (B, C) Inhibering af PI3K eller AKT vender EMT-protein markør og transskriptionsfaktor profiler i MCF-7-TF og Dox-inducerede MCF-10AT-TF-celler, vist ved immunoblot og /eller RT-PCR. (D, E) Hæmning af PI3K eller AKT reducerer migrerende og invasive aktiviteter MCF-7-TF og Dox-inducerede MCF-10AT-TF celler. Barer repræsenterer betyde celletal (+/- SD) stammer fra tre uafhængige

i

vitro

migrationseksperimenterne og invasion med hver fire mikroskopiske felt tæller. En asterisk angiver

s

. 0,005

EMT-associeret ombygning af celle-celle og celle-matrix adhæsion forlener kræftceller med vandrende og invasive kapacitet [10]. Vi testede for øget motilitet af MCF-7-TF celler i standard assays scoring migration gennem mikroporøs membran eller traversion af rekonstitueret basalmembran (Matrigel). Ved sammenligning med MCF-7 mock-transficeret kontrol, disse eksperimenter afsløret om seks- og 12 gange stigninger i migrerende og invasive aktiviteter henholdsvis af MCF-7-TF-celler, som blev undertrykt i NKG2D-depleteret MCF-7 TF-KO-celler (figur 1D og 1E). For en alternativ fremgangsmåde, skrab sårlukning ved sammenflydende monolag af MCF-7-TF og kontrolceller blev afbildet ved fasekontrastmikroskopi. Betragtninger MCF-7-TF celler opnået fuldstændig sårlukning inden for 72 timer, lidt, hvis nogen ændring blev set med den negative kontrol celler (Figur 1F). Tilsammen disse resultater afsluttede

i

vitro

undersøgelser af MCF-7-TF celler tyder på, at NKG2D-DAP10 har kapacitet til at aktivere kræftcellen EMT.

MCF- 7 er en luminal brystcancer linje med epiteliale funktioner samt nogle konstitutiv epithelial til mesenchymal plasticitet, hvilket er typisk for de fleste brysttumor linjer [13], [14]. Derfor Snail1 og Snail2 mRNA’er kunne påvises ved høj-cyklus (36 runder) RT-PCR i utransficerede MCF-7 moderceller (figur 1G). I overensstemmelse med en involvering af endogen NKG2D i Snail1 /2-induktion, NKG2D depletion i MCF-7-NKG2D RNAi-celler førte til reduktion eller tab af disse transkripter sammenlignet med scrambled RNAi kontrol transduktanter (MCF-7-scrRNAi celler; Figur 1G, for flowcytometri profiler af disse model linjer se Figur S1A og S1G). Endogen NKG2D kan således i princippet have en kapacitet til at fremme differentiering i retning mesenchymale signaturer men disse virkninger kan ikke trænge grundet dens knappe ekspression. Følgelig tilstedeværelse eller mangel på endogen NKG2D ekspression i brystkræft linjer, såsom epitel MCF-7 (NKG2D

+) eller mesenchymal SUM149PT (NKG2D

-), er unaligned med deres hovedsageligt epitel versus mesenchymal repræsentationer [3 ], [9], [14], [15].

Induktion af kræftcelle EMT er en generel kapacitet på NKG2D-DAP10

til bekræftelse af vigtigste resultater på tværs af forskellige tumor linjer, vi testede NKG2D-DAP10 transfektanter af SUM149PT brystkræft [9], A375 melanom [3], og MDAH-2774 ovariecancerceller, og i flere detaljer MCF-10AT præmaligne mammaepitelceller, som var co-transduceret med lentivirale konstruktioner for doxycyclin (Dox) -inducerbare NKG2D og DAP10 ekspression (figur S2A og S2B). Forskellig fra MCF-7-celler, alle disse fire linier mangler endogene NKG2D (Fig S2A og S2B) [3], [9], men deler evnen til at undergå EMT [13], [16] – [19]. Som med MCF-7-TF celler, signalering sprogfærdighed ektopisk udtrykte NKG2D-DAP10 er blevet vist for SUM149PT-TF og A375-TF linjer [3], [9], og blev bekræftet med den nyligt genererede MDAH-2774-TF og MCF-10AT-TF celler ved immunoblot detektion af phosphokinases

P

-Akt

S473 og

P

-ERK1 /2

T202 /Y204 efter anti-NKG2D antistof krydsbinding ( Figur S2C).

Med alle fire tumor linjer, ektopisk NKG2D-DAP10 udtryk (konstitutiv eller Dox-induceret) præget morfologiske (vises kun for MCF-10AT-TF-celler), markørprotein, og transkriptionelle EMT signaturer optaget med MCF-7-TF-celler (Figur S3A-D). Desuden flowcytometri for Dox-inducerede MCF-10AT-TF celler til overfladen E-cadherin og N-cadherin bekræftede, at aktivering af EMT var celle kontakt- og dermed formodentlig ligand-afhængig (figur S3E). Alle tumor linjer med konstitutiv eller Dox-induceret ektopisk NKG2D-DAP10 udtryk udstillet markant forøget

i

vitro

vandrende og invasive aktiviteter (figur S3F).

afhængighed af EMT omprogrammering om aktivering af PI3K-AKT

for at lokalisere NKG2D-DAP10 signalering krav til EMT aktivering, MCF-7-TF og Dox-inducerede MCF-10AT-TF-celler blev udsat for farmakologiske hæmmere af PI3K (LY294002), pan -Akt (AKT Inhibitor V), MAP kinase kinase (MEK1 /2) opstrøms for ERK (U0126), og JNK (SP600125). Induktion af alle tidligere undersøgte EMT kriterier, herunder morfologiske ændringer (kun vist for MCF-7-TF celler), diagnostisk protein markør og transkriptionsfaktor-signaturer og motilitet, var afhængige af PI3K-AKT signaling akse uden mærkbar bidrag ERK og JNK (Figur 2A-E). I en supplerende tilgang, blev NKG2D udtrykt i MCF-10AT celler ved transduktion sammen med DAP10 muteret ved enten dens PI3K /p85 (M88Q *) eller Grb2 (N87Q *) bindingssted [20]. Efter bekræftelse af korrekt udtryk og funktion af variant NKG2D-DAP10 komplekser (figur 3A og 3B), testning for induktion af EMT parametre konstateret deres afhængighed af rekruttering af PI3K /p85, men ikke af Grb2 (figur 3C-E).

(A) Immunopræcipitering (IP) og immunoblot (IB) i NKG2D og /eller DAP10 (N87Q * eller M88Q *) i transducerede MCF-10AT-celler (top to paneler). Bottom tre paneler viser primær påvisning af DAP10 og gensidigt udelukkende sammenslutning af sin N87Q * og M88Q * varianter med p85 og Grb2 hhv. (B) Signaling funktionalitet DAP10 N87Q * og M88Q * varianter. Bemærk, at ERK er nedstrøms for PI3K. EGF blev tilsat til kontrol aktiverings, DMSO for kontrol opløsningsmiddel. (C, D) Tilbageførsel af EMT protein markør og transskription markør profiler ved ekspression af DAP10 (M88Q *) med nedsat binding af p85, vist ved immunoblot og /eller RT-PCR. (E) DAP10 variant M88Q * men ikke N87Q * reducerer vandrende og invasive aktiviteter Dox-induceret MCF-10AT celler, der udtrykker de respektive NKG2D-DAP10 mutant-komplekser. Barer repræsenterer gennemsnitlige celletal (+/- SD) stammer fra tre uafhængige

in vitro

migrationseksperimenterne og invasion med hver fire mikroskopiske felt tæller. En asterisk angiver

s

. 0,005

Foreningen af ​​NKG2D-DAP10 med EMT underskrifter fra

ex vivo

kræftceller

Signaling sprogfærdighed den NKG2D-DAP10 receptor i brystkræftceller er blevet dokumenteret [3] og blev bekræftet her med yderligere to brystkræft prøver (Figur S1H). Antistof-medieret receptor krydsbinding induceret AKT fosforylering neden for PI3K i brystkræftceller sorteret for fravær af CD45 (hæmatopoietisk celle udelukkelse), udtryk for EpCAM (kræftcelle inklusion), og NKG2D. Udseende af phospho-AKT (

P

-Akt) var følsom over for LY294002 og dermed afhængig af PI3K. For at sikre den biologiske relevans af NKG2D-DAP10 i EMT omprogrammering blev frisk isolerede cellesuspensioner fra 12 primære invasive brystkræft prøver (benævnt BT1 til BT12) undersøgt af multi-parameter overflade flowcytometri for CD45, EpCAM, NKG2D, og ​​E -cadherin

– /N-cadherin

+ EMT signatur. EpCAM er en

bona fide

kræftcelle markør selvom nedregulering kan forekomme under EMT [12], [21]. Faktisk EpCAM udtryk blandt CD45

– cellepopulationer var heterogen i alle undtagen en (BT8) af de 12 tumor celle suspensioner (Figur 4A). Vi undersøgte derfor CD45

-EpCAM

høj og CD45

-EpCAM

lave celler separat til overfladen NKG2D og E-cadherin /N-cadherin mønstre. I overensstemmelse med vores tidligere fund [3], NKG2D

+ kræftceller var til stede i alle 12 brystkræft prøver, der spænder mellem 0,5 og 27,8% (gennemsnit 9,7 +/- 9,1%) af de samlede CD45

-EpCAM

høje celler (tabel S1). EMT repræsenterer et kontinuum med epitel /mesenkymale hybrid og fuldt skiftet mesenkymale-lignende tilstande [10], [11], [21]. Baseret på vores resultater med de model tumor linjer, bør kræftcelle NKG2D således være forbundet med både hybrid (E-cadherin

+ N-cadherin

+) og yderligere differentieret (E-cadherin

N-cadherin

+) fænotyper. I 9 af de testede (BT4 til BT12) 12 tumor cellesuspensioner, de fleste NKG2D

+ blandt CD45

-EpCAM

høje celler havde E-cadherin /N-cadherin mønstre i overensstemmelse med enten delvis (E- cadherin

+ N-cadherin

+) eller mere skred (E-cadherin

-N-cadherin

+) EMT (figur 4A og 4B). Bortset fra BT8, BT11, og BT12 suspensioner, skævvridning mod de fænotyper var ikke synlige blandt de matchede NKG2D

– kræftceller. I tre tilfælde (BT1, 2, og 3), kræft celler med blandede eller mesenkymale underskrifter var begrænset til NKG2D

+ delmængde, men blev ikke fremherskende (figur 4B).

(A) Eksempler (bryst cancer prøver BT4 og BT5) af multiparameter flowcytometri dot plots illustrerer cancercelle gating baseret på fravær af CD45 og tilstedeværelse af EpCAM (høj eller lav) og efterfølgende visning af E-cadherin /N-cadherin fænotyper af NKG2D

+ eller NKG2D

– cancer celle delmængder. Tal i kvadranter indikerer celle proportioner i procent. Quadrant porte er baseret på fluorescens-minus-one isotype Ig kontrol farvninger. (B, C) Grafisk visning af data fra 12 brystcancerprøver (BT1-BT12), der blev analyseret som i (A). E

+ N

-, E

+ N

+ og E

N

+ henvise til E-cadherin og N-cadherin status. Farver svarer til prik plot kvadranter i (A). Se hovedteksten for yderligere forklaring.

NKG2D

+ celler blev også bemærket blandt CD45

-EpCAM

lave tumor cellepopulationer, bestående mellem 0,3 og 59,3% (gennemsnit 12,6 + /- 18,9%) (tabel S1). I alt men BT1 prøve, NKG2D

+ CD45

-EpCAM

ringe bestande også fortrinsvis vises EMT fænotyper. Især i udvalgte prøver (Bt3, BT5, BT6, og BT12), andele af mesenkymale (E-cadherin

N-cadherin

+) celler var betydeligt større blandt NKG2D

+ CD45

– EpCAM

lav sammenlignet med NKG2D

+ CD45

-EpCAM

høje celler, hvilket antyder, at EpCAM nedregulering kan forekomme sent i EMT-processen (figur 4B og 4C). Tilsammen disse observationer bekræftede konklusionerne med model tumor linjer, understøtter en fremtrædende rolle NKG2D som en naturlig aktivator af EMT i kræft. Dette stemmer overens med det faktum, at NKG2D

+ celler udgjorde væsentlige proportioner, når det optages som procent af de samlede hybride og mesenkymale markør profil-positive celler (tabel S1). Alle 12 tumor-suspensioner indeholdt varierende forhold mellem CD45

-EpCAM

– celler, der manglede E-cadherin og N-cadherin og derfor ikke kunne henføres til en bestemt celletype. Med undtagelse af fire tumor prøver (BT2, Bt3, BT11, og BT12), NKG2D

+ celler var fraværende blandt de befolkninger.

NKG2D inducerer EMT i en tumor xenotransplantat model

komplementær evidens for en rolle NKG2D i EMT blev opnået fra tumorer afledt af SUM149PT-TF eller negative kontrolceller orthotopisk xenotransplanteret i bryst-fedtpuder NOD /SCID-mus, en model eksperiment, der var med til at etablere NKG2D-drevet tumorgenicitet [9]. Mere direkte

in vivo

beviser var ikke opnåeligt, da spontane eller kræftfremkaldende-induceret kræft i mus mangler NKG2D udtryk [3]. Den SUM149PT linje er fænotypisk heterogen, husly betydelige delmængder af celler med mesenkymale markør profiler [14]. Derfor kan immunhistokemi udgøre vanskeligheder i vurderinger af EMT-associerede ændringer. Undersøgelse af xenograft tumorafledte cellesuspensioner ved flowcytometri eksponeret kraftigt forøgede repræsentationer af hybrid /mesenchymale fænotyper i alle fem NKG2D

+ SUM149PT-TF i modsætning til NKG2D

– mock kontroltumorer (figur 5). EMT-associeret vandrende aktivitet xenotransplanted SUM149PT-TF celler kan have bidraget til udbredelsen forbedret tumorceller tidligere observeret i denne dyremodel [9].

Cellesuspensioner fra tumorer afledt af immunsvækkede mus orthotopisk xenotransplanterede med brystkræft SUM149PT- TF-celler (øvre søjlediagram) er stærkt skæv retning af hybrid E-cadherin

+ /N-cadherin

+ og yderligere overført E-cadherin

– /N-cadherin

+ fænotyper sammenlignet med kontrol mocktransfekterede SUM149PT celletumorer (lavere bar graf). E

+ N

-, E

+ N

+ og E

N

+ henvise til E-cadherin og N-cadherin status; MID, identifikation mus nummer.

Instruktion af stemness omprogrammering af NKG2D

Ud over at tillægge vandrende evner, EMT transskription faktorer Snail1 og Twist regulere overflade markør profiler, der definerer bryst kræft cellepopulationer beriget for cellerne med stamceller-lignende egenskaber [22] – [24]. I overensstemmelse med induktion af Snail1 og Twist, ektopisk NKG2D-DAP10 udtryk (konstitutiv eller Dox-induceret) var forbundet med brystkræft stamcelle-lignende CD24

– /CD44

+ profil skift i MCF-7-TF , MCF-10AT-TF og SUM149PT-TF linjer (figur 6A) [22], [25]. Men kun en lille brøkdel af celler med CSC-lignende fænotyper betegnes som funktionelle CSCS [2]. Mere relevante for EMT-stemness indbyrdes kan være, at EMT transkriptionsfaktorer, såsom Snail2 eller Zeb1 i samarbejde med separate genetiske kredsløbssystemer, også regulere funktionelle bryst CSC stater [2], [26] – [28]. Ved microarray genekspression profilering, vi identificeret en fremtrædende induktion af Sox9 transkriptionsfaktoren i MCF-7-TF sammenlignet med mock-transficerede kontrolceller (se microarray data på http: //www.ncbi.nlm.nih/geo/under tiltrædelse kode GSE53961), der uafhængigt blev bekræftet ved kvantitativ RT-PCR og immunoblot (figur 6B og 6C).

(A) To farve flowcytometri af CD24 /CD44-mønstre i stabilt transficerede MCF-7-TF og SUM149PT-TF, og Dox-inducerede transduceret MCF-10AT-TF-celler (alle vist med rødt) i forhold til negative kontroller (vist med blåt). Farvede tal i kvadranter angiver tilsvarende celle proportioner i procent. De viste data er repræsentative for tre eksperimenter. (B) Kvantitativ RT-PCR af Sox9 i MCF-7 og MCF-10AT-afledte model linjer. Eksperimentelle data søjler repræsenterer fold-stigninger over negative kontrol datasæt på én. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. En asterisk angiver

s

0,005. (C) Tilsvarende immunoblot data for Sox9 og actin kontrol. (D) fasekontrast mikrografier af mammospheres dannet af MCF-7-TF og inducerede MCF-10AT-TF versus negative kontrol linjer. Søjlediagram på højre (grå søjler) opsummerer data som antal organoids ( 100 um diameter) tælles i tre sæt tredobbelte brønde hver podes med 10

3 MCF-7-TF celler. Sorte søjler repræsenterer eksperimenter udført med MCF-7-TF celler under de samme betingelser i tilstedeværelse af inhibitorer af PI3K (LY294002), pan-AKT (AKTV), MEK1 /2 (U0126), eller JNK (SP600125). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. DMSO tjener kontrol som opløsningsmiddel. (E, F) Som i (D), med MCF-7-celler, der udtrykker TF Sox9 eller Snail2 RNAi eller scrRNAi kontroller. (G) fasekontrast mikrografier af mesenkymale versus epiteliale celle morfologier af cellelinier vist i (E, F). (H) Grafisk visning af proportioner Sox9

+ /Snail2

+ celler blandt NKG2D positiv eller negativ CD45

-EpCAM

+

ex vivo

brystkræft celler (prøver BT13 til BT18) bestemt af multi farve flowcytometri.

Sox9 virker kooperativt med Snail2 (Slug) og i mindre grad Snail1 som en mester regulator af mamma stamceller tilstand [28]. Således ved positivt at regulere Sox9 foruden Snail2 og Snail1 (se figur 1B), NKG2D kan have kapacitet til at fremme funktionel stamcellelignende egenskaber. Dette begreb blev støttet af tre-dimensionelle Matrigel organoide kulturer og klassiske mammosphere analyser. I begge typer forsøg, MCF-7-TF-celler dannede talrige store ( 100 um) organoids hvorimod mock-transficeret kontrol eller MCF-7-TF-KO-celler genereret kun få celleklynger, der var typisk små (Figur 6d). Som med EMT omprogrammering, organoide formation var afhængig af PI3K-AKT uden tilsyneladende involvering af ERK eller JNK (figur 6D). Tilsvarende dokumentation for kapaciteten af ​​NKG2D at fremkalde Sox9 og organoide dannelse blev opnået med Dox-induceret MCF10AT-TF-celler (figur 6B-D).

Sox9 og Snail2 er begge nødvendige for mammaepitelceller at komme ind og stabilt opretholde en funktionel stamcelle tilstand [28]. Følgelig RNAi-medieret nedbrydning af Sox9, og særskilt for Snail2 ophævede organoide dannelse i MCF-7-TF mammosphere kulturer [Figur 6E og 6F). I modsætning Snail2, som menes at bidrage til stamceller induktion

via

aktivering af en EMT, er virkningerne af Sox9 i EMT omprogrammering betragtet mindre [28]. Derfor EMT-associerede morfologiske ændringer af MCF-7-TF-celler blev således vendt af RNAi-medieret nedbrydning af Snail2 men ikke af Sox9 (figur 6G).

definere kendetegnende for højeste plasticitet cancerceller er deres effektive tumor initiering ved xenografting i immunsvækkede mus. Vores tidligere musemodel undersøgelse påviste markant reducerede latenstider og forbedrede tumor hændelser med orthotopisk transplanteret MCF-7-TF versus kontrol linjer [9]. Disse resultater er i overensstemmelse med NKG2D-medieret induktion af Sox9 og Snail2 og medfølgende erhvervelse af CSC kapacitet. Denne induktion gav også en forklaring på den observerede forbedrede tumor initiering af utransficerede MCF-7-celler, der udtrykker minimal endogent NKG2D (figur 1G, for flowcytometri profiler af den parentale MCF-7, MCF-7-NKG2DRNAi, og MCF-7-scrRNAi linjer se Figur S1A og S1G) [9]. For at undersøge for relevans i humane kræftformer,

ex vivo

tumorceller fra seks primære invasive brystkræft prøver (BT13 til BT18) blev testet for associationer mellem NKG2D og Sox9 og Snail2 ved polykromatisk flowcytometri. I alle tumorer, andele af CD45

-EpCAM

+ celler co-udtrykker Sox9 og Snail2 var signifikant større blandt NKG2D

+ i forhold til NKG2D

– celler (Figur 6H). Tilsammen disse resultater understøtter tumorigen betydning af NKG2D

via

Sox9- og Snail2-medieret induktion af CSC træk.

Diskussion

Høj plasticitet kræftceller betragtes største syndere af tumor formidling og igen stiger efter konventionel kræftbehandling [2], [29]. Nærværende undersøgelse viser, at koopterede udtryk for, og signaler ved, NKG2D på kræftceller fremmer kræftcelle plasticitet med differentiering mod mesenchymale fænotyper og formidling-enabling og tumor-initierende kapacitet. Fysiologiske betydning understøttes af sammenfatning af EMT og Sox9 signaturer optaget med model tumor linjer ved primær invasiv brystkræft. Det er sandsynligt, at den rolle, NKG2D som drivkraft for kræftcelle plasticitet er bredt anvendelig, der strækker sig i det mindste i æggestokkene, colon og prostata-carcinomceller [3].

Relevansen af ​​EMT, og ved følgeslutning af stemness omprogrammering, i menneskelig tumor udvikling er ikke ukontroversiel [30]. Men nylige flowcytometri-baserede demonstrationer af cirkulerende tumorceller med epitelial, mesenkymale eller hybride signaturer og tilhørende metastase-initierende kapacitet, udgør direkte beviser for menneskelig kræftcellen plasticitet og dets patofysiologisk betydning [21], [31]. Vores multi-parametrisk encellede analyse af

ex vivo

tumor cellesuspensioner udvider denne dokumentation til primær brystkræft og afdækker, at blandet epitel /mesenkymale og mesenkymale-lignende brystkræft celle fænotyper er mere udbredt og formentlig mere kompleks end tidligere antaget. Fordi de fleste NKG2D

+ brystkræft celle populationer undersøgte blev skæv mod hybride og mesenkymale fænotyper og repræsenterede materielle proportioner alle celler med disse differentiering stadier, kan NKG2D muligvis have en fremtrædende rolle i EMT induktion.