PLoS ONE: Antineoplastiske Virkninger af siRNA mod TMPRSS2-ERG Junction Oncogene i Prostata Cancer

Abstrakt

TMPRSS2-ERG

krydset onkogen er til stede i mere end 50% af patienter med prostatakræft og sit udtryk er ofte forbundet med dårlig prognose. Vores mål er at opnå gen knockdown af siRNA TMPRSS2-ERG og derefter at vurdere de biologiske konsekvenser af denne hæmning. Først, vi designet siRNAs mod de to

TMPRSS2-ERG

fusion varianter (III og IV), hyppigst identificeret i patienternes biopsier. To af de fem testede siRNA’er blev fundet effektivt inhibere mRNA af både

TMPRSS2-ERG

varianter og formindske ERG proteinekspression. Microarray analyse bekræftes yderligere ERG hæmning af både siRNA’er TMPRSS2-ERG og afslørede en fælles nedreguleret gen,

ADRA2A

, involveret i celledeling og migration. SiRNA mod TMPRSS2-ERG fusion variant IV viste de højeste anti-proliferative virkninger: signifikant nedsat cellelevedygtighed, øget spaltet caspase-3 og inhiberede en klynge af anti-apoptotiske proteiner. At foreslå en konkret terapeutisk tilgang, blev siRNA TMPRSS2-ERG IV konjugeret til squalen, som kan selv organisere som nanopartikler i vand. De nanopartikler af siRNA TMPRSS2-ERG-squalen injiceret intravenøst ​​i SCID-mus reduceret vækst af VCAP xenotransplanterede tumorer, hæmmet oncoprotein udtryk og delvist restaureret differentiering (fald i Ki67). Afslutningsvis dette studie byder på en ny udsigt til behandling for prostatakræft baseret på siRNA-squalen nanopartikler rettet mod

TMPRSS2-ERG

krydset onkogen

Henvisning:. Urbinati G, Ali HM, Rousseau Q, Chapuis H, Desmaële D, Couvreur P, et al. (2015) Antineoplastiske Virkninger af siRNA mod TMPRSS2-ERG Junction Oncogene i prostatakræft. PLoS ONE 10 (5): e0125277. doi: 10,1371 /journal.pone.0125277

Academic Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Januar 14, 2015; Accepteret: 22 Marts 2015; Udgivet: 1. maj 2015

Copyright: © 2015 Urbinati et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Stock: microarray data relateret til studiet er blevet indsendt til Array Express datalager på europæisk Bioinformatics Institute (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), under tiltrædelsen nummer:. E-mtab-2838

finansiering: den forskning, der fører til disse resultater har modtaget støtte fra Agence Nationale de Recherche (ANR), Program P2N, Grant N ° NANO 00301.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser .

Introduktion

Prostatakræft (PCA), en androgen-afhængige tumor, er blevet den hyppigste kræftform hos mænd (27% af alle kræfttilfælde hos mænd) og repræsenterer 4

th årsag til dødelighed ved kræft og 2

nd hos mænd. I 2014, den anslåede forekomst var på ca. 230.000 tilfælde i USA og 417.000 tilfælde i Europa (ACS American Cancer Society,

ACS

org

;… WHO europæiske Cancer Observatory,

eu-cancer

.

IARC

.

fr

). De væsentligste risikofaktorer omfatter alder, familie historie og sorte etniske resultater oprindelse men carcinogenese fra et samspil mellem både miljømæssige og endogene faktorer [1]. Den konventionelle behandling for prostatakræft er androgen deprivation terapi; Til trods for en høj respons på denne behandling, de fleste patienter videre til kastration resistens [2]. Siden 2010 har fem nye amerikanske Food and Drug Administration-godkendte behandlinger været tilgængelig for kastrationsresistent og metastatisk prostatakræft (Cabazitaxel, Enzalutamide, abirateronacetat, Sipuleucel T,

223Radium dichlorid). Men bivirkningerne af disse nye lægemidler er ikke endnu veletableret og patient overlevelse er kun svagt forbedret, hvilket resulterer i palliativ snarere end terapeutiske behandlinger [1, 3]. Derfor er udviklingen af ​​nye behandlingsformer stadig stærkt anbefales og uundværlig.

Tomlins

et al

., Opdagede et gen fusion navngivet TMPRSS2-ERG i mere end 50% af prostatakræft [4] . TMPRSS2-ERG skyldes omlejring påvirke kromosom 21 fører til fusion af et gen reguleret af androgener

TMPRSS2

, med den transkriptionelle faktor

ERG

[5]. Fusion af

TMPRSS2-ERG

fører til overekspression af ERG i prostata; dette fremmer prostata tumor initiering og progression. , Men en betydelig mængde data tyder på, at denne fusion giver en mere aggressiv fænotype og kan påvirker resultatet af lokaliserede tumorer behandlet med androgen deprivation terapi [5-11]. Der er observeret mere end 17 udskrifter for

TMPRSS2-ERG

krydset onkogen og den bedst kendte, beskrevet af Wang

et al

. betegnes som varianter I til VIII [12]. Blandt dem, de hyppigste varianter findes i patienternes biopsier er varianter III og IV og resultere fra at tilslutte exon 1 af

TMPRSS2

med exon 4 eller 5 i

ERG

hhv. Begge fusioner fører til en overekspression af afkortet men funktionelle ERG protein [12-14]. Desuden blev forskellige former for fusionstranskripter beskrevet inden for samme tumor [15, 16].

På trods af at små interfererende RNA’er (siRNA’er) er særdeles specifikke og effektive ved meget lave koncentrationer, de er ustabile i biologiske væsker og den hydrofile karakter hindrer deres mål levering og cellulær optagelse. At forbedre deres stabilitet, beskytte dem mod nukleaser nedbrydning og forbedre deres hydrofobe karakter, skal de bedre transporteres og afgives til legemet [17]. Vi har for nylig bevist effektiviteten af ​​”squalenoylation” teknologi til vectorise siRNA’er designet mod

RET /PTC1

RET /pTC3

junction onkogener, og foreslog, at squalenoylation tilbyder en ny ikke-kationiske platform for siRNA levering [18, 19]. Vel vidende, at en betydelig procentdel af prostata malignitet huser

TMPRSS2-ERG

krydset onkogen, vores mål er at indføre en ny potentiel terapeutisk tilgang siRNA rettet mod

TMPRSS2-ERG

krydset onkogen hos patienter med prostata kræft. Vores resultater påpege en konkret klinisk anvendelse for prostatakræft terapi baseret på TMPRSS2-ERG knockdown.

Materiale og metoder

Kemikalier

Alle de anvendte kemikalier var af højeste analysekvalitet . Squalen, siRNAs, MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid] reagens og paraformaldehyd (PFA, 16%) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Quentin Fallavier , Frankrig). 3′-thiol modificerede siRNA’er blev indkøbt fra Eurogentec (Belgien) og Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), Opti-MEM, føtale kalve sera (FCS), blev Lipofectamin RNAiMAX og PCR-primere købt hos Life Technologies (Saint Aubin, Frankrig). BD Matrigel (Basement Membrane Matrix vækstfaktor nedsat reference 356.234) blev købt fra Corning (Amsterdam, Holland). Bio-Rad-protein-assay blev indkøbt fra Bio-Rad Laboratories (Marnes-la-Coquette, Frankrig). Annexin-V-Fluos farvning kit blev indkøbt fra Roche (Meylan, Frankrig). NucView 488 caspase-3-kit blev købt fra VWR (Fontenay-sous-Bois, Frankrig). Proteome Profiler Menneskelig Apoptose Array kit blev købt fra R deres sekvenser er indrulleret i S2 tabel. Den siRNA kontrol har sekvensen af ​​siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) med fem misforhold. Alle enkeltstrengede siRNA’er blev syntetiseret af Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Quentin Fallavier, Frankrig) som 21-mer med to 3′-overhængende 2′-deoxynukleotid-rester for at tilvejebringe stabilisering mod nukleaser [21]. For at udføre squalen bio-konjugation, blev en 3-mercaptopropyl phosphatgruppen indført ved 3′-enden af ​​siRNA sense-strengen (syntetiseret af Eurogentec, Belgien).

In vitro

celle transfektion

Transiente transfektioner blev udført for at: i) vurdere den mest effektive siRNA TMPRSS2-ERG designet [siRNA III (1, 2, 3), eller IV (1, 2)], ii) finde mest effektive siRNA koncentration, iii) vurdere effektiviteten af ​​siRNAs, iv) analysere de knockdown virkninger på cellelevedygtighed, apoptose og genregulering, v) kontrollere

TMPRSS2-ERG

knockdown effektivitet, med og uden transfektionsmidler, efter siRNA TMPRSS2-ERG squalenoylation. Salg

Transiente transfektioner blev udført ved anvendelse af lipofectamin RNAiMAX transfektion middel ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, 8 × 10

5 VCAP celler blev podet i seks-brønds plader indeholdende DMEM suppleret med 10% FCS, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (10 ug /ml) under anvendelse af forskellige siRNA koncentrationer og 6 pi Lipofectamine RNAiMAX. Celler blev inkuberet med siRNA i 24 timer, 48 timer og 72 timer. FAM-mærket siRNA Kontrol blev brugt til at overvåge effektiviteten af ​​siRNA transfektion.

For valg af en effektiv siRNA koncentration blev VCAP celler transficeret med den valgte effektive siRNA’er TMPRSS2-ERG III eller IV på 2,5 nM, 10 nM, 25 nM og 50 nM koncentrationer og inkuberet i 48 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingerne, blev mRNA og proteiner ekstraheret fra cellerne, der skal analyseres for gen og protein knockdown.

Real time PCR (RT-qPCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra VCap celler under anvendelse RNeasy mini-kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig). Første streng cDNA blev genereret med M-MLV RT buffer pakke (Promega, Charbonnières-les-Bains, Frankrig). Real-time PCR (qPCR) blev udført med StepOnePlus PCR System (AB Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, Frankrig) under anvendelse GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Charbonnières-les-Bains, Frankrig) ifølge producentens anvisninger. Prøver blev kørt tredobbelt; genregulering blev bestemt ved 2

-ΔΔCt metode og normaliseret til GAPDH niveauer. For Knockdown eksperimenter, er resultater gives som relative mRNA-niveauer sammenlignet med ikke-behandlede celler.

Immunoblotting

totalt protein ekstrakter blev opnået ved hjælp af M-PER-reagens (Thermo Fisher Scientific Courtaboeuf, Frankrig) suppleret med en proteasehæmmer cocktail (Roche, Neuilly sur Seine, Frankrig). Proteiner blev titreret ved Bio-Rad-assay ifølge producentens anvisninger. Prøver blev derefter fyldt på 10% polyacrylamidgel (NuPAGE Bis Tris Mini Gels 10%, Life Technologies, Saint-Aubin, Frankrig) og proteiner blev overført under anvendelse af iBlotDry Blotting System (Invitrogen, Frankrig). Membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med en af ​​følgende primære antistoffer: monoklonalt kanin ERG (EPR 3864 (2); 1: 500, ABCAM Biochemicals, Paris, Frankrig) eller monoklonalt kanin Caspase-3 (1: 1000, Cell Signalling teknologi, Saint Quentin en Yvelines, Frankrig Ref:. 9662). Monoklonale muse-GAPDH-HRP (1: 1000, Cell Signalering teknologi, Saint Quentin en Yvelines, Frankrig Ref:. 3683) blev anvendt som intern kontrol. Blots blev derefter vasket og inkuberet med tilsvarende sekundære anti-kanin eller anti-mus-antistoffer konjugeret til HRP (peberrodsperoxidase, 1: 3000, Cell Signalling teknologi). Bånd blev visualiseret ved forøget kemiluminescens reagens (Invitrogen, Frankrig).

Levedygtighed assay

levedygtighed VCAP celler blev vurderet ved MTT-analysen efter 72h inkubation med siRNA’er TMPRSS2-ERG eller Kontrol på 50 nM koncentration. MTT-assay blev også udført 72h efter celletransfektion med siRNA TMPRSS2-ERG III og IV ved 0,1 nM, 1 nM, 2,5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM og 200 nM koncentrationer. Resultaterne er middelværdien ± SD af to uafhængige forsøg indeholdende 8 replikater for hver tilstand og er udtrykt som levedygtighed procentdel af behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler.

Whole-genomet microarray analyse

Tre uafhængige transfektioner blev udført med 50 nM siRNA TMPRSS2-ERG III, siRNA TMPRSS2-ERG IV og siRNA Kontrol på VCap celler. Totale RNA’er af ubehandlede og transficerede celler blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy mini-kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig). Protokollen er detaljeret i Array Express (Tiltrædelse nummer: E-mtab-2838) og tidligere beskrevet af Gilbert-Sirieix [22]. Den mRNA blev derefter mærket med fluorescerende lavt input lineær forstærkning kit (Agilent Technologies, Massy, ​​Frankrig). Kort beskrevet revers transkription blev udført under anvendelse M-MLV revers transkriptase. Derefter blev cyanin 3-mærkede cDNA’er genereret under anvendelse af T7 RNA-polymerase. Hybridiseringer blev udført i 17 timer ved 60 ° C på Agilent human hele genomet oligo microarray 8x60k, enten med 1 ug af ubehandlede celler eller med siRNA TMPRSS2-ERG III, siRNA TMPRSS2-ERG IV eller siRNA Kontrol transficerede celler. Slides blev scannet ved hjælp af Agilent 2505 C DNA microarray scanner og microarray billeder blev analyseret med Feature udvinding softwareversion 10.7.3.1 (Agilent Technologies). Rå datafiler blev normaliseret med Limma procedure. Vi definerede op- eller ned-regler som nøgletal større end to gange mellem VCAP celler transficeret med siRNA (TMPRSS2-ERG III, TMPRSS2-ERG IV og Kontrol-sekvenser) og ubehandlede VCAP celler, erhvervet med en fold opdagelse sats ≤ 0,05 og en minimum intensitet ≥ 100. Ved fortolkningen af ​​den biologiske betydning af genomiske data, brugte vi den opfindsomhed software (www.ingenuity.com). Derefter blev ægtheden af ​​microarray data valideret af RT-qPCR, af nogle af de TOP 10 op- eller ned-regulerede gener ved siRNA TMPRSS2-ERG III og IV. Gen-specifikke primere blev designet ved hjælp af Oligo Explorer 1.1.0 og Oligo Analyzer 1.0.2 programmer (Kuopio University, Kuopio, Finland, primere sekvenser er hyret i S3 tabel). Primere blev selekteret med en smeltetemperatur på 60 ° C og en amplikonstørrelse på 100-200 baser. Prøver blev kørt i to eksemplarer med primer sæt af genet af interesse og

GAPDH

som intern kontrol gen.

Annexin-V apoptose assay

Apoptose blev bestemt ved flowcytometri analyse under anvendelse af et Annexin-V-Fluos farvning kit, der indeholder både Annexin-V bundet til fluorescein og propidiumiodid (PI). VCAP celler blev transficeret med 50 nM siRNA TMPRSS2-ERG III, IV eller siRNA Control i tilstedeværelse af Lipofectamine RNAiMAX. Efter 72h eller 96h inkubationer, medium og celler blev opsamlet og centrifugeret, derefter farvet under anvendelse af Annexin-V-Fluos farvning kit ifølge producentens instruktioner. Prøverne blev derefter analyseret ved flowcytometri (Accuri C6 Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, USA). Ti tusind begivenheder i den udvalgte population blev analyseret og elektronisk kompensation af instrumentet blev udført for at udelukke overlapning af de to emissionsspektre (fluorescein og PI). Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og behandlede celler i hver fase af celledød blev sammenlignet med ikke-behandlede celler.

Cell apoptose analyser

Apoptose blev evalueret af IncuCyte systemet (Essen Instruments, Ann Arbor, Michigan, USA), som tillader overvågning af levende celler i kultur over tid og kvantificerer apoptotiske celler ved at tælle fluorescerende kerner stede pr mm

2 område i hvert billede. Caspase-3/7-substrat (NucView488 caspase-3 kit) blev anvendt til at følge caspaseaktivitet i levende celler i realtid. Når substratet spaltes af aktiveret caspase-3/7 er høj affinitet DNA farvestof frigivet og migrerer til cellekernen til at farve det lyst. Brønde blev scannet (6 billeder /brønd) hver 12 h ved IncuCyte til overvågning af fluorescens for hvert billede. Salg

VCAP celler (30.000 /brønd) blev podet i plader med 96 brønde med 100 pi DMEM indeholdende FCS og antibiotika, og transficeret med 50 nM siRNA TMPRSS2-ERG III, IV eller siRNA Control. Apoptose afsløring kit NucView 488 caspase-3/7 blev tilsat, og celleplader blev anbragt i IncuCyte under inkuberingsbetingelser. Eksperimentet blev udført tredobbelt og det fluorescerende apoptotiske signal i siRNA transficerede celler blev sammenlignet med den for ikke-behandlede celler.

Proteome apoptose profiler matrix

Først transient transfektion af siRNA’er TMPRSS2-ERG III, IV og siRNA Kontrol blev udført i VCap-celler i 72 timer, som beskrevet ovenfor. Cellerne blev lyseret og proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bio-Rad assay ifølge producentens anvisninger. Hvert protein prøve (ikke-behandlede VCap celler, behandlet VCap celler med siRNA’er TMPRSS2-ERG III, IV eller siRNA Control) blev derefter inkuberet natten over med “Humant Apoptose Array” (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant niveau

Resultater

Identifikation af TMPRSS2-ERG varianter i VCAP celler

Først vi karakteriseret TMPRSS2-ERG transskription produkter i VCAP cellelinje, der endogent udtrykker

TMRPSS2-ERG

fusion onkogen. Otte specielt designet primere blev anvendt til at genkende de varianter af TMPRSS2-ERG fra I til VIII (S1 tabel). Som vist i tabel 1, ved RT-qPCR, fusion varianter III og IV viste sig at være højt udtrykt i VCap celler (Ct henholdsvis 20 og 23), mens varianter I, II, VII og VIII blev svagt udtrykt (Ct 30 ). Fusion varianter V og VI blev ikke fundet at blive udtrykt i denne cellelinie. Da fusion varianter III og IV er højt udtrykt i VCAP celler og svarer til de hyppigste varianter til stede i prostatakræft biopsier, blev de udvalgt til yderligere undersøgelser med knockdown af siRNA.

siRNA’er TMPRSS2-ERG mod varianter III og IV reducere onkogen udtryk og påvirke VCAP cellernes levedygtighed

Vi har designet 10 siRNAs TMPRSS2-ERG på tværs af krydset: exon 1 TMPRSS2-exon IV ERG for variant III og exon 1 TMPRSS2-exon V ERG for variant IV . Ifølge Reynold regler [20], tre siRNA-sekvenser mod variant III TMPRSS2-ERG og to siRNA-sekvenser mod variant IV blev udvalgt til at være potentielt effektiv mod hver af varianterne, som vist på S2 tabel.

effektiviteten af ​​siRNA designet mod

TMPRSS2-ERG

i tavshed den tilsvarende fusion onkogen blev først testet af RT-qPCR på 24, 48 timer og 72 timer i VCap celler. Som vist i tabel 2, blev fire siRNAs fundet effektiv i gendæmpning [siRNA TMPRSS2-ERG III (1, 2, 3) og TMPRSS2-ERG IV (1)]. Bemærkelsesværdigt, siRNA TMPRSS2-ERG III (1) og siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) viste en bedre langsigtet mRNA inhibering sammenlignet med siRNA ERG (ved 72 timer: 70% inhibering med vores udformet siRNA

vs

30 % inhibering med kommercialiseret siRNA ERG). Notatet siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) forårsagede den højeste hæmning af TMPRSS2-ERG mRNA niveauer for både varianterne III og IV (tabel 2). Som forventet havde scramble siRNA (siRNA Control) ikke nogen inhibering af fusionsgenet transkripter.

Derefter undersøgte vi effektiviteten af ​​siRNA’er TMPRSS2-ERG på inhibering af protein-ekspression ved 24 timer, 48 timer og 72h ved Western blot under anvendelse af ERG-antistof (figur 1a). Blandt de siRNA’er konstrueret mod TMPRSS2-ERG variant III, både siRNAs TMPRSS2-ERG III (1) og (2) viste en bedre lyddæmpende effekt end TMPRSS2-ERG III (3) og nåede deres maksimale aktivitet ved 72 timer. Om siRNA TMPRSS2-ERG variant IV, kun siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) viste et fald i ERG proteinindhold. Ligesom i det foregående siRNA, blev den højeste knockdown effektivitet observeret ved 72 timer (figur 1a).

VCAP celler blev transficeret i 24 timer, 48 timer og 72 timer med 50 nM siRNA’er TMPRSS2-ERG III (1, 2, 3 ), siRNA’er TMPRSS2-ERG IV (1, 2), siRNA mod ERG vildtype eller siRNA Control. en. Western blot-analyse: ekspressionen af ​​ERG protein påvist ved Western blot viste virkningerne af siRNA’er mod TMPRSS2-ERG, ERG vildtype eller siRNA Control. GAPDH blev anvendt som intern kontrol (billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg). b. MTT celleviabilitetstest: VCap-celler blev transficeret med siRNA TMPRSS2-ERG III (1, 2), TMPRSS2-ERG IV (1) og siRNA Kontrol ved 50 nM koncentration og inkuberet i 72 timer. Søjler repræsenterer gennemsnit ± SD af 2 uafhængige eksperimenter indeholdende 8 gentagelser for hver tilstand. Antallet af levedygtige celler blev målt og 100% cellelevedygtighed svarer til antallet af levende celler inkuberet kun med transfektion middel. *** =

s

0,001, signifikant fald i forhold til ubehandlede celler eller siRNA Kontrol (Kruskal Wallis efterfulgt af Tukey og Dunnet test).

For at forstå de biologiske virkninger af onkogenet knockdown, vurderede vi levedygtigheden efter transfektion af siRNA [siRNA TMPRSS2-ERG III (1 og 2), IV og siRNA Kontrol] ved 50 nM koncentration i VCap celler. Som vist i fig 1b viste MTT-assays en signifikant inhibering i væksthastighed for alle siRNA’er sammenlignet med ubehandlede celler (

s Restaurant 0,0001). Men kun siRNA’er TMPRSS2-ERG III (1) og IV (1) viste et fald i vækstrate (henholdsvis 20% og 40%) sammenlignet med siRNA kontrol (figur 1b).

Tilsammen resultater viser, at både siRNA’er TMPRSS2-ERG III (1) og TMPRSS2-ERG IV (1) er meget effektive til mRNA og protein hæmninger og formindske cellevæksthastigheden. Derfor blev disse siRNAs udvalgt til yderligere omfattende undersøgelser og frem udpeget som siRNA TMPRSS2-ERG III og siRNA TMPRSS2-ERG IV, henholdsvis.

Lave koncentrationer af siRNA TMPRSS2-ERG III og IV hæmme onkogen og oncoproteinet udtryk men påvirkede ikke cellernes levedygtighed

for at vurdere den optimale koncentration skal yderligere bruges til

in vivo

undersøgelser, vi undersøgt, om siRNA TMPRSS2-ERG III og IV kunne hæmme TMPRSS2-ERG genet og proteinniveauer ved lavere koncentrationer end 50 nM. RT-qPCR og Western blot blev udført ved 48 timer (tid, der svarer til den højeste nedregulering aktivitet). Interessant, hæmmende effekter af både siRNAs TMPRSS2-ERG blev observeret starter ved 2,5 nM koncentration (

s

0,001, figur 2a til RT-qPCR og 2b til Western blot). Derefter blev cellelevedygtighed også testet efter 72 h transfektion af siRNA TMPRSS2-ERG III, IV og siRNA kontrol fra 0,1 til 200 nM koncentrationer. Notatet både siRNAs TMPRSS2-ERG III (

s

0,05) og IV (

s

0,001) signifikant hæmmet vækst rate startende fra 50 nM, mens lavere koncentrationer ikke påvirkede celle levedygtighed og højere koncentrationer forøgede ikke celle dødelighed (figur 2c). Om siRNA kontrol blev et fald i cellelevedygtighed bemærket ved høje koncentrationer (100 nM, 150 nM og 200 nM), sandsynligvis på grund af utilsigtede toksiske virkninger, mens det ikke påvirker cellernes levedygtighed ved 50 nM koncentration. Derfor 50 nM koncentration synes at være den optimale dosis for at opnå de bedste specifikke virkninger i form af gen knockdown effektivitet og celle mortalitet (figur 2).

VCAP celler blev transficeret i 72 timer fra 2,5 nM til 50 nM med siRNA TMPRSS2-ERG III, siRNA TMPRSS2-ERG IV eller siRNA Control. en. RT-qPCR analyse: relative TMPRSS2-ERG fusion varianter III og IV mRNA niveauer blev analyseret og sammenlignet med ikke-behandlede celler. Resultaterne er normaliseret til GAPDH mRNA-ekspression. Barer: middel ± SD af tre uafhængige forsøg. * =

s

0,05; *** =

s

0,001, signifikant ændring i forhold til ubehandlede celler ved hjælp af Kruskal Wallis efterfulgt af Tukey og Dunnet-testen. b. Western blot-analyse blev anvendt til at påvise virkningerne af siRNA TMPRSS2-ERG III, IV eller siRNA Kontrol på ekspressionen af ​​ERG-protein. GAPDH blev anvendt som intern kontrol (billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg). c. MTT levedygtighedsassay: siRNA TMPRSS2-ERG III, siRNA TMPRSS2-ERG IV eller siRNA Kontrol blev transficeret i 72 timer ved forskellige koncentrationer (0,1 nM-200 nM). Et hundrede procent cellelevedygtighed svarer til antallet af levende celler inkuberet med kun transfektion middel. Resultaterne er middelværdien ± SD af to uafhængige forsøg, der indeholder 8 gentagelser for hver tilstand. * =

s

0,05, ** =

s

0,01, *** =

s

0,001, signifikant fald i forhold til ubehandlede celler (TA ) eller siRNA Kontrol (Kruskal Wallis efterfulgt af Tukey og Dunnet test)

Kombination af siRNA TMPRSS2-ERG III og IV ikke forbedre knockdown effekt og cellevækstinhiberingen

Vi derefter vurderes, om den kombination af begge siRNAs TMPRSS2-ERG III og siRNA TMPRSS2-ERG IV forbedret TMPRSS2-ERG gen og protein hæmninger. b. c. b. c.