PLoS ONE: Omfattende Undertrykkelse af All Apoptose proliferation Veje som en foreslåede tilgang til Kolorektal Cancer Prevention og Terapi

abstrakt

Mutationer i WNT /beta-catenin pathway er til stede i hovedparten af ​​alle sporadiske colorektale cancere (CRCs), og histondeacetylaseinhibitorer inducere apoptose i CRC celler med sådanne mutationer. Denne apoptose modvirkes af (1) den signalering heterogenitet CRC cellepopulationer, og (2) overlevelse pathways induceret af mitogener udskilt fra apoptotiske celler. Fænomenerne signalering heterogenitet og apoptose-induceret overlevelse udgør de umiddelbare mekanismer modstand mod histondeacetylaseinhibitorer og sandsynligvis andre kemoterapeutiske midler. Vi udforskes strategi forstærke CRC celledød ved at hæmme alle overlevelse veje induceret af pro-apoptotiske middel LBH589, en histondeacetylaseinhibitor: AKT, JAK /STAT, og ERK signalering. Den apoptose-styrke evnen af ​​en cocktail af syntetiske inhibitorer af proliferation blev sammenlignet med virkningerne af det naturlige produkt propolis. Vi udnyttede kolorektal adenom, lægemiddel-sensitive og lægemiddelresistente colorektal carcinomceller at evaluere den apoptotiske potentiale kombinationsbehandlingerne. Resultaterne antyder, at en effektiv tilgang til CRC kombinationsterapi er at kombinere apoptose-inducerende lægemidler (f.eks histondeacetylaseinhibitorer, såsom LBH589) med midler, der undertrykker alle kompenserende overlevelse pathways induceres under apoptose (såsom cocktail af inhibitorer af apoptosis- associeret proliferation). Den samme paradigme kan anvendes på en CRC forebyggelse tilgang, som den apoptotiske virkning af butyrat, en kost-afledt histondeacetylaseinhibitoren, forøges af andre diætetiske midler, som modulerer overlevelse pathways (fx propolis og kaffeekstrakt). Således kan kosttilskud sammensat af fermenterbare fiber, propolis, og kaffeekstrakt effektivt modvirke neoplastisk vækst i tyktarmen

Henvisning:. Bordonaro M, Drago E, Atamna W, Lazarova DL (2014) Omfattende Undertrykkelse af All Apoptose -inducerede Spredning Veje som en foreslåede tilgang til Kolorektal Cancer Prevention og terapi. PLoS ONE 9 (12): e115068. doi: 10,1371 /journal.pone.0115068

Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Italien

Modtaget: 11. juli, 2014 Accepteret: November 18, 2014; Udgivet: 11. december 2014

Copyright: © 2014 Bordonaro et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (1R15CA152852-01, Lazarova). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. M. Bordonaro, W. Atamna, og E. Drago har ingen konkurrerende interesser. Darina L. Lazarova har modtaget forskningsmidler fra Manuka Health New Zealand, Ltd, og hun er co-opfinderen af ​​patentansøgningen PCT /NZ2014 /000.060 indleveret via Patent Cooperation Treaty på vegne af Manuka Health New Zealand, Ltd, “Therapeutics kompositioner og anvendelser deraf “. Darina L. Lazarova har ingen økonomisk interesse i denne patentansøgning. Der er ingen konsulentfirmaer, ansættelser, produkter i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. De erklærede konkurrerende interesser ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Forbedring af anti-cancer forebyggende og terapeutiske strategier er faldet kræft-relaterede dødsfald med 20% i de sidste 20 år [1]. Desuden [2] begrebet onkogen afhængighed ansporet til udvikling af molekylært målrettede behandlinger. Men de fleste af disse behandlinger forlænge livet for kræftpatienter i gennemsnit et par måneder [3]. En årsag til dette resultat er, at neoplasmer udviser drug-resistente mutationer, der enten præ-eksisterende i et lavt antal cancerceller før behandling, eller erhverves efter lægemiddelindgivelse [3]. I mangel af resistens-mutationer, kræftceller også tilpasse sig det selektive stof pres ved at justere deres signalering niveauer. For eksempel,

BRAF

-mutant melanomaceller udsat for vemurafenib udvikle resistens over for agenten ved opregulering deres BRAF udtryk [4]. Tilsvarende EGFR-mutant lungecancerceller behandlet med en EGFR-inhibitor nedregulere PTEN og øge AKT overlevelse signalering [5]. Derfor bør udformningen af ​​anticancerterapier tage hensyn ikke blot mutations landskab af en neoplasme, men også cellesignaleringskaskaden heterogenitet, der findes selv blandt genetisk identiske cancerceller [6]. Den signalerer heterogenitet er en del af de umiddelbare resistensmekanismer (IMR):. Det er disse ændringer i signalering kaskader, der forekommer inden for 24 timers behandling og tillader en brøkdel af en kræftcelle befolkning til at overleve narkotikabehandling

CRC-celler eksponeret for histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) også udviser IMR. Vi har fremlagt beviser, at HDAC-hæmmere inducere apoptose af CRC celler dels gennem hyperaktivering af WNT /catenin signalering [7]. Men CRC cellepopulationer er heterogene med hensyn til WNT /catenin niveauer, og celler, der ikke hyperinduce vejen, overlever eksponeringen for HDAC-hæmmere [7], [8]. Det signalerer heterogenitet af cellepopulationer ikke skyldes eksistensen af ​​celle subpopulationer med forudbestemte niveauer af WNT /catenin aktivitet. Således har vi flowcytometri-sorteret enkelt CRC celler med høj WNT /catenin signalering niveauer, og fandt, at de resulterende klonede populationer er så heterogene i Wnt signalering niveauer som den forælder populationen (data ikke offentliggjort). Denne heterogenitet er sandsynligvis vedligeholdes af lateral hæmning [9], en vedtagelse af en bestemt skæbne med et par celler fra en gruppe af tilsvarende celler [10]. I denne proces er stokastiske variationer i ekspressionen af ​​receptoren hak og dets ligander på tilstødende celler amplificeret gennem celle-til-celle-interaktioner. Samspillet mellem hak og dets ligander fører til frigivelse af deres intracellulære domæner. Cellerne med højere niveauer af NOTCH intracellulære domæne undertrykke WNT aktivitet; henviser til, at cellerne med højere niveauer af Notch-ligander øger WNT aktivitet [9]. I normale tarmceller, lateral hæmning bidrager til terminal differentiering [11]; dog i CRC-celler, lateral hæmning understøtter signalering heterogenitet uden terminal differentiering. Tilsvarende signalering heterogenitet er blevet observeret

in vivo

[12] – [15]

Den anden komponent i den IMR er apoptose-inducerede proliferation, et fænomen understøttes af de apoptotiske celler, der udskiller. mitogener. Disse mitogener stimulerer proliferation af overlevende celler i nogen apoptotisk population [16] – [21]. Vi har fundet, at i CRC cellepopulationer undergår HDACi-udløst apoptose, er der øget ekspression af mitogener og en efterfølgende induktion af adskillige overlevelse signalveje [9], [22]. Her rapporterer vi en strategi til at inhibere omfattende alle overlevelse veje, og forbedre den apoptotiske respons af CRC-celler til både syntetiske og kost-afledte HDAC-hæmmere (f.eks LBH589 og butyrat).

Materialer og metoder

1. Celledyrkning, rekombinante plasmider, og kemikalier

Den humane CRC cellelinie HCT-116 blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). HCT-116-cellelinjen blev genotypebestemt ved kort tandemgentagelse-analyse. Den samme analyse af HCT-R-celler bekræftede, at disse celler er relateret til forældrenes HCT-116 celler. Cellelinien HCT-R blev afledt fra HCT-116 ved dyrkning af parentale celler i stigende koncentrationer af butyrat som tidligere beskrevet [8]. HCT-116 og HCT-R cellelinier blev dyrket i alfa-MEM-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS). Humane colon microadenoma LT 97 celler en slags gave fra Dr. B. Marian (Institute of Cancer Research, Medical University Wien, Østrig). LT 97 celler blev dyrket som tidligere beskrevet [23], [24]. Følgende cellelinjer blev dyrket i alfa-MEM med 10% FBS: human småcellet carcinom binyre /cortex SW13-celler (minus fænotype, isoleret ved fortynding kloning fra en heterogen prøve ATCC CCL105 i laboratoriet af Dr. Elizabeth Hull, Midwestern University , AZ), human neural crest-afledte ikke-neuronal progenitor LA1-5s celler (leveret af Dr. R. Ross, Fordham University, NY), normal human føtal colon celler CCD841CoN ((ATCC CRL-1790), humane embryonale nyre epitelial HEK293T celler (ATCC CRL-1573) og muse embryonale fibroblaster CCL92 (ATCC CCL-92). Natriumbutyrat blev opnået fra Sigma, kaffesyre phenethyl ester (CAPE) Enhanced propolis (propolis med Cyclopower, med CAPE ved 6 mg /g ) fra Manuka Health New Zealand Ltd., AZD6244, LBH589, og MK2206 fra Selleck Chemicals, pyridon 6 fra Santa Cruz Biotechnology, frysetørret pulverkaffe (The Daily Chef, Sam West, Inc.). Alle agenter undtagen butyrat resuspenderedes i dimethylsulfoxid blev og stamopløsninger holdt ved -80 ° C. Butyrat blev opløst i vand og opbevares som 1,0 M stamopløsning ved 4 ° C. Mock behandling inkluderet dimethylsulfoxid i en mængde svarende til denne af de behandlinger med agenter opløst i dimethylsulfoxid.

2. Western blot-analyser og antistoffer Salg

Western blot analyser blev udført som tidligere [25] rapporterede. Følgende antistoffer blev anvendt: et antistof mod phospho-p44 /42 MAPK (ERK1 /2-) (Thr202 /Tyr204) (# 4370, Cell Signaling Technology), et antistof, der genkender phospho-Stat3 (Tyr705) (# 9145, Cell Signaling Technology ), anti-Ser473-phosphoryleret AKT (sc-7985, Santa Cruz Biotechnology), anti-AKT (sc-8312, Santa Cruz Biotechnology), anti-beta actin (A5441, Sigma-Aldrich), anti ERK (# 9102, Cell Signaling Technology), anti STAT3 (# 9139, Cell Signaling Technology), anti-pcJUN og c-jun (sc-16312-R og sc-45, Santa Cruz Biotechnology). Alle antistoffer blev anvendt ved arbejdstryk fortynding af 1:1,000, undtagen den anti-actin-antistof, som blev anvendt ved 1:5,000 fortynding. Lysater blev opnået via to forskellige metoder: ved at anvende en natriumdodecylsulfat holdig lyseringsbuffer og kvantificering af proteinkoncentrationen [25], eller ved lysering lige antal celler (10

6) direkte i Laemmli-puffer. Rutinemæssigt blev celler udpladet en dag før behandling og eksponeret i 17 eller 20 timer med LBH589 (50 nM), MK2206 (1 uM), AZD6244 (0,5 uM), pyridon 6 (1 uM), kaffeekstrakt (1 mg /ml), propolis (100 ug /ml), eller butyrat (5 mM). Kvantificering af Western Blot billeder, blev udført med ImageJ software (public domain software udviklet af Research Services Filial af National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA).

3. Apoptotisk og klonale vækstassays

CRC-celler blev udpladet 24 timer forud for analyse i 24-brønds plader ved 70.000 per brønd, og udsat for behandlinger i 24 timer (f.eks LT97 og HCT-116 celler) eller 48 timer (HCT-R-celler). Alle celler (flydende og vedlagt) blev høstet og farvet for apoptotiske og nekrotiske markører med PE Annexin V Apoptose Detection Kit I (BD Biosciences, # 559.763). Flowcytometri analyser blev udført med FACS Aria II og Diva software; analyserede vi i alt 50.000 begivenheder pr prøve. Procent apoptose blev beregnet ved at dividere antallet af apoptotiske celler med det samlede antal analyserede celler og multiplicere forholdet med 100. For klonal vækst analyser blev enkelte celler udpladet ved 100-200 celler pr brønd i en seks-brønds plade og behandlet med midlet (r) i 24 timer. Kolonier blev talt efter 14 til 20 dage efter fjernelse af midlet (erne). Alle eksperimenter blev udført fire til seks gange med tredobbelte prøver pr eksperiment.

4. Statistik

Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse fra mindst tre sæt uafhængige forsøg. Uparret Student t-test-analyse blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​statistiske forskelle. Forskelle blev betragtet signifikant ved P 0,05. For klonale vækst og apoptotiske analyser blev statistiske forskelle mellem gruppe midler bestemmes af envejs analyse-of-variansanalyse (ANOVA) med GraphPad Prism 6 software, og post-test beregninger, der brugte Bonferroni korrektion for at justere for flere sammenligninger med 95 % tillid.

Resultater

1. Udvikling af inhibitor cocktail af apoptose proliferation (ICAP)

Vi har vist, at HDAC-hæmmere inducere apoptose af CRC celler med mutationer i WNT /catenin vej [7], og niveauerne af celledød er augmented ved at undertrykke induktion af AKT signalering [22], [26]. At analysere alle overlevelse pathways induceret i apoptotiske CRC cellepopulationer, vi udnyttet HCT-R-celler, som er relativt HDACi-resistente sammenlignet med parentale HCT-116-celler [8]. Bestemte vi evnen af ​​en inhibitor cocktail af apoptose-associeret proliferation (ICAP) at forøge apoptose i CRC cellepopulationer udsat for LBH589, en HDACi der er i kliniske forsøg. For at sikre den kliniske relevans af tidligere resultater [22], [26], vi ansat farmakologisk relevante koncentrationer af LBH589 (50 nM) og hæmmere af overlevelse veje [27], [28]. HCT-R celler udsat for LBH589 udviste forøgede niveauer af tre overlevelse pathways medieret af phosphoryleret AKT, STAT3 og ERK1 /2 signalmolekyler (figur 1A). LBH589-behandlede celler udviste 15,5 ± 2,8% apoptose, og tilsætningen af ​​MK2206, et Pakt inhibitor, næsten tredoblet niveauerne af apoptose til 42,5 ± 8,6%, p = 0,007 (figur 1B). Dette fund er i overensstemmelse med observationer, at undertrykke Pakt niveauer ved MK2206 eller kaffesyre phenethyl ester øger apoptose i CRC celler [22]. Tilsætning af pyridon 6, en JAK /STAT-inhibitor, og AZD6244, en adenosin trifosfat-konkurrencedygtige inhibitor af MEK1 /2 [29], [30] øget apoptose yderligere. Eksponering for ICAP alene resulterede i apoptose på 14,0 ± 4,0% sammenlignet med 7,1 ± 2,0% apoptose induceret af mock behandling. Almindelige envejs ANOVA afslørede statistisk signifikante forskelle mellem gruppen betyder, F (5,12) = 38,56, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni korrektion for at justere for flere sammenligninger med 95% sikkerhed er angivet statistisk signifikante forskelle (P 0,05) i de apoptotiske niveauer mellem mock behandling og alle tre kombinationsbehandlinger med LBH589, samt mellem LBH589 behandling og alle tre kombination behandlinger med LBH589. Der var ingen statistisk signifikante forskelle mellem de apoptotiske niveauer af mock-, LBH589-, og ICAP – behandlede celler. Der var ingen statistisk signifikante forskelle i apoptose induceret af LBH589 + MK2206 og de andre to kombination LBH589 behandlinger, samt mellem LBH589 + MK2206 + pyridone6 og LBH589 + ICAP.

A. Western blot-analyser af HCT-R CRC celler udsat for spotte (C) behandling, 50 nM LBH589 (L), 1 uM MK2206 (M), 0,5 uM AZD6244 (A), eller 1 uM pyridon 6 (P) i 20 timer. Samme antal celler blev lyseret direkte i Laemmli-buffer og analyseret for ekspressionsniveauer af phosphorylerede og totale niveauer af AKT, ERK1 /2, og STAT3. B. Apoptotisk analyser af HCT-R-celler eksponeret i 48 timer til de behandlinger, i (A). Stjerne angiver statistisk signifikante forskelle (P 0,05) mellem de apoptotiske niveauer. Yderligere statistisk signifikante forskelle er angivet i teksten.

2. Propolis forøger apoptose induceret af LBH589 eller 5-fluoruracil i CRC-celler Salg

propolis, en honningbi produkt, forøger apoptose induceret af kosten-afledte HDACi butyrat via delvis undertrykkelse af AKT og JAK /STAT signalering [26]. Derfor vi ræsonnerede, at propolis kan forstærke LBH589 apoptose via den samme mekanisme. At sammenligne evne propolis og ICAP at undertrykke apoptose induceret overlevelse veje, vi udsættes HDACi-resistente HCT-R-celler til at spotte behandling, LBH589, LBH589 + propolis eller LBH589 + ICAP. Tilsætning af propolis augmented LBH589 apoptose fra 16,5 ± 2,0% til 30,1 ± 4,5%, P = 0,013 (2A); henviser, tilsætning af ICAP forstærket LBH589 apoptose fra 16,5 ± 2,0% til 60,0 ± 10,6%, P = 0,004 (2A). Almindelige envejs ANOVA afslørede statistisk signifikante forskelle mellem alle gruppe betyder, F (5,12) = 39,35, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni korrektion for at justere for flere sammenligninger med 95% sikkerhed afslørede statistisk signifikante forskelle (P 0,05) i de apoptotiske niveauer mellem mock behandling og de to LBH589 kombinationsbehandlinger, men ikke LBH589 alene. Signifikante forskelle blev også noteret for de apoptotiske niveauer induceret af LBH589 og LBH589 + ICAP, samt ved LBH589 + propolis og LBH589 + ICAP. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem apoptose af celler udsat for spottes propolis eller ICAP behandling. Western blot-analyser afslørede, at i LBH589-behandlede HCT-R-celler, co-behandling med propolis faldt pSTAT3 niveauer ved seks-fold og Pakt niveauer 1,7 gange; henviser til, at samtidig behandling med ICAP resulterede i ikke-detekterbare niveauer af både pSTAT3 og Pakt (Fig.2B). Den mest markante forskel mellem de to kombinationsbehandlinger med LBH589 var, at i forhold til eksponeringen for LBH589 alene, tilsætning af propolis øget pErk1 /2 niveauer med 20%; henviser til, at ICAP faldt pErk1 /2 niveauer med otte gange (Fig.2B).

A. HCT-R eller HCT-116-celler blev eksponeret i 48 timer eller 24 timer respektivt, at spotte (M), 50 nM LBH589 (L), LBH589 og 100 pg /ml propolis (LP), LBH589 og ICAP (LC), 100 pg /ml propolis (P), eller alene ICAP (C). B. HCT-R-celler blev udsat for de behandlinger i A i 17 timer. og totale cellelysater blev analyseret ved western blotting. C. HCT-R og HCT-116-celler blev eksponeret i 48 timer eller 24 timer respektivt, at spotte (M), 10 uM 5-fluoruracil (F), 5-fluoruracil og 100 ug /ml propolis (FP), 5- fluorouracil og ICAP (FC), propolis (p), eller alene ICAP (C).

HCT-R-celler er relativt resistente over for de apoptotiske virkninger af HDAC-hæmmere i en del på grund af deres opreguleret overlevelse signalering selv i fravær af behandling [8], [22]. For at vurdere betydningen af ​​de overlevelse veje i HDACi-sensitive CRC celler, vi udnyttet HCT-116 celler, hvorfra HCT-R-celler blev afledt [8]. I HCT-116-celler, behandling med LBH589 alene resulterede i en seks gange forøgelse af apoptose (mock behandling resulterede i 10,4 ± 1,8% apoptose, og LBH589 eksponering ved 50 nM førte til 64,2 ± 10,0% apoptose, P = 0, Fig. 2A). Tilsætning af propolis eller ICAP augmented yderligere den apoptotiske virkning af LBH589: eksponeringen for LBH589 + propolis resulterede i 81,3 ± 6,3% apoptose (P = 0,072), og LBH589 + ICAP førte til 96,0 ± 1,5% apoptose (P = 0,006), 2A. En-vejs ANOVA viste statistisk signifikante forskelle mellem gruppen betyder, F (5,12) = 162,1, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni angivet statistisk signifikante forskelle (P 0,05) i de apoptotiske niveauer mellem mock behandling og alle tre behandlinger, der omfattede LBH589. De samme signifikante forskelle blev noteret for de apoptotiske niveauer induceret af propolis eller ICAP, og alle tre behandlinger, der omfattede LBH589. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem de apoptotiske niveauer af celler udsat for spottes propolis eller ICAP behandling

LBH589 er meget effektivt inducerer apoptose af CRC-celler med mutationer i WNT /catenin pathway.; dog er midlet stadig i kliniske forsøg. Derfor spurgte vi, om propolis og ICAP augment apoptose induceret af 5-fluorouracil, en vigtig komponent i de nuværende anti-CRC terapeutiske regimer. 5-fluorouracil (5-FU) inducerer lave niveauer af apoptose i HCT-116-celler ved uopnåelige

in vivo

koncentration på 10 uM (mock celler udviser 10,4 ± 1,8% apoptose, og 5-FU-behandlede celler . – 33,1 ± 3,2% apoptose, P = 0, 2C i samme koncentration agenten ikke inducere signifikant apoptose i HCT-R-celler: mock-behandlede celler udviser 7,1 ± 1,8% apoptose, og 5-FU-behandlede celler – 9,5 ± 1,3% apoptose, P = 0,14, 2C den kombinerede eksponering af HCT-116 celler til 5-FU + propolis eller 5-FU + ICAP ikke øge de apoptotiske niveauer sammenlignet med behandling med 5-FU. alene: 5-FU eksponering resulterede i 33,1 ± 3,2% apoptose, 5-FU + propolis behandling førte til 33,2 ± 3,8% apoptose, og 5-FU + ICAP – til 35,5 ± 9,0% apoptose (2C) Almindelig en-. vejs ANOVA viste statistisk signifikante forskelle mellem gruppen betyder, F (5,12) = 18,31, P. 0,0001 post-test beregninger med Bonferroni korrektion for at justere for flere sammenligninger med 95% sikkerhed er angivet statistisk signifikante forskelle (P 0,05) i apoptotiske niveauer mellem mock behandling og alle tre behandlinger, der omfattede 5-FU. Den samme signifikant forskel blev observeret for de apoptotiske niveauer induceret af propolis eller ICAP sammenlignet med alle tre behandlinger, der omfattede 5-FU

Begge propolis og ICAP fordoblet den apoptotiske respons af HCT-R-celler til 5-FU.: sammenlignet med 5-FU alene, 5-FU + propolis behandling førte til 23,1 ± 3,6% apoptose, P = 0,003, og 5-FU + ICAP – 22,3 ± 2,2% apoptose, P = 0,001, 2C. En-vejs ANOVA af apoptotiske niveauer af HCT-R celler udsat for kombinationsbehandlinger med 5-FU og ICAP eller propolis afslørede statistisk signifikante forskelle mellem gruppe betyder: F (5,12) = 28,81, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni korrektion angivet statistisk signifikante forskelle (P 0,05) i de apoptotiske niveauer mellem mock behandling og 5-FU + propolis, mellem mock behandling og 5-FU + ICAP, og mellem 5-FU behandling og kombinationsbehandlinger af 5-FU + propolis og 5-FU + ICAP. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem de apoptotiske niveauer af fingeret og 5-FU-behandling.

3. Målretning apoptose-associeret proliferation som tyktarmskræft forebyggende tilgang

de den kliniske anvendelse af ICAP og en propolis supplement til at øge anti-cancer behandlinger vil kræve validering gennem randomiserede kliniske forsøg, anvendelse af en kost baseret supplement i CRC forebyggelse er mere håndgribeligt. Butyrat, et fermenteringsprodukt af fiber i tyktarmen og en HDACi, inducerer apoptose i de fleste CRC cellelinier, og denne virkning kan forklare delvis beskyttende rolle af fiber mod CRC [31]. Svarende til apoptose induceret af LBH589, er apoptose initieret af butyrat modvirket af overlevelse signalering. Derfor kan en CRC forebyggende tilgang kombinerer butyrat med hæmmere af overlevelse veje. Propolis forøger butyrat-induceret apoptose ved at undertrykke to overlevelse veje: AKT og JAK /STAT [26]; men i vores analyser af LBH589-behandlede CRC celler, propolis ikke alene ikke undertrykke, men i virkeligheden, augmented pErk1 /2 niveauer. Da undertrykkelse af ERK-signalering af MEK1 /2-inhibitoren AZD6244 forbedret den apoptotiske virkning af LBH589 (figur 1B), vi ræsonnerede, at butyrat /propolis-induceret apoptose kan ligeledes forøges ved at målrette ERK-signalering med kost-afledte forbindelser. Baseret på en litteratursøgning har vi fokuseret på flere rapporterede kost-afledte ERK1 /2-hæmmere, blandt hvilke var ursolsyre, curcumin sulforafan og kaffe. Fra screenet forbindelser ingen undertrykt pErk1 /2 plan i butyrat /propolis-behandlede CRC celler; Tilsætning af kaffeekstrakt øget apoptose af HCT-R-celler (figur 3a). En-vejs ANOVA viste statistisk signifikante forskelle mellem gruppen betyder: F (7,25) = 50,96, P 0,0001, (Fig.3A). Post-analyser med Bonferroni korrektion blev udført for alle otte grupper af behandlinger; Men vi fokuseret på, om at tilføje kaffeekstrakt til tidligere karakteriseret og rapporteret af os kosten agenter påvirket apoptotiske niveauer af HCT-R-celler. , Fandt vi, at der var statistisk signifikante forskelle (P 0,05) i de apoptotiske niveauer mellem følgende behandlinger: butyrat versus butyrat + kaffe, butyrat + propolis versus butyrat + propolis + kaffe og propolis versus propolis + kaffe. De to regimer, der inducerede de højeste niveauer af apoptose i HCT-R-celler, propolis + kaffe og butyrat + propolis + kaffe, reducerede pSTAT3 til målbart niveauer og Pakt niveauer ved tre gange (Figs.3A og 3D).

A-C. Celler blev udsat for spotte (M), 5 mM butyrat (B), 1 mg /ml ristet kaffe ekstrakt (R), 100 ug /ml propolis (P), butyrat og kaffeekstrakt (BR), butyrat og propolis (BP) , propolis og kaffeekstrakt (PR), eller butyrat, propolis og kaffeekstrakt (BPR). Apoptose blev målt ved flowcytometri som beskrevet i Materialer og Metoder. D-F. Celler blev udsat for behandlinger som beskrevet ovenfor i 17 timer, og totale cellelysater blev analyseret ved western blotting.

HCT-R-celler sandsynligvis repræsenterer de sene stadier af neoplastisk udvikling, når der etableres lægemiddelresistens. Men det er mere relevant at afprøve nogen CRC forebyggende strategi i celler, der repræsenterer tidligere neoplastiske stadier. Derfor analyserede vi virkningerne af kost-afledte stoffer i LT97 cellelinie etableret ud fra en human colon microadnoma [23], [24], og HCT-116 colon carcinomceller, der er følsomme over for kemoterapeutiske lægemidler. Sammenlignet med HCT-R-celler, både LT97 og HCT-116 cellelinier er mere følsomme over for butyrat-induceret apoptose; derfor, målte vi apoptose ved 24 timer efter administration af forskellige regimer. I HCT-116-celler, butyrat behandling resulterede i 36,8 ± 3,4% apoptose sammenlignet med mock-celler, der udviste 8,8 ± 0,4% apoptose (3B). De højeste niveauer af apoptose blev opnået ved kombinationerne af butyrat + propolis (46,0 ± 2,0%), butyrat + kaffe (65,8 ± 3,5%), og butyrat + propolis + kaffe (73,9 ± 3,7%); de samme kombinationer af midler undertrykkes også niveauerne af pSTAT3 (Fig.3E). En-vejs ANOVA for niveauerne af apoptose af HCT-116 celler udsat for kosten agenter afslørede statistisk signifikante forskelle mellem gruppen betyder: F (7,23) = 168,7, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni korrektion for at justere for flere sammenligninger med 95% sikkerhed er angivet statistisk signifikante forskelle (P 0,05) i de apoptotiske niveauer mellem alle behandlinger undtagen butyrat behandling i forhold til butyrat + propolis, butyrat behandling i forhold til propolis + kaffe, og butyrat + kaffe behandling i forhold til butyrat + kaffe + propolis

Vi har tidligere fastslået, at LT97 celler er meget følsomme over for Wnt signalering hyperaktivering og cellevækst anholdelse i tilstedeværelse af butyrat [32].; i disse celler, mock behandling resulterer i 12,2 ± 0,7% apoptose, og butyrat eksponering i 27,8 ± 5,0% apoptose. Eksponering af LT97 celler til propolis + kaffe eller propolis + butyrat resulterede i statistisk sammenlignelige niveauer af apoptose: 22,1 ± 4,7% og 25,6 ± 2,1%, hhv. De højeste niveauer af apoptose blev opnået ved kombinationsbehandlinger butyrat + kaffe (34,7 ± 5,7%) og butyrat + kaffe + propolis (47,9 ± 8,2%), og der var ingen statistisk signifikant forskel i de apoptotiske niveauer opnås ved de to behandlinger ( P = 0,08). One-Way ANOVA for niveauerne af apoptose af LT97 celler udsat for kosten agenter afslørede statistisk signifikante forskelle mellem gruppen betyder: F (7,16) = 22,57, P 0,0001. Post-test analyser af de behandlinger, der omfattede kaffeekstrakt indikerede, at der var ingen statistisk signifikante forskelle mellem de apoptotiske niveauer af celler udsat for butyrat versus butyrat + kaffe og propolis versus propolis + kaffe; men der var en statistisk signifikant forskel mellem apoptose induceret af butyrat + propolis og butyrat + propolis + kaffe (P 0,05). Under de anvendte betingelser, vi var ude af stand til at opdage pSTAT3 niveauer i LT97 celler; dog udsat for butyrat + propolis + kaffeekstrakt øget perk detekterbare niveauer i forhold til mock-behandlede celler (Fig.3F). Tilsvarende eksponering af HCT-116-celler og butyrat + propolis + kaffeekstrakt øget Perk niveauer ved to-fold; dog var sådan virkning ikke observeret i HCT-R-celler (Figs.3A, B). Vi analyserede også niveauerne af pc-jun, da denne vej kunne påvirke apoptose og celleoverlevelse. I alle celler, i alt c-jun-niveauer øges med behandlinger, og pc-jun-niveauer afspejles nøje denne stigning (Figs.3D, E, F).

For at teste effekten af ​​kaffe på forskellige niveauer, vi er udsat HCT-116-celler til 0,25, 0,5 og 1 mg af kaffeekstrakt per milliliter medium. Den høje dosis af et milligram per milliliter var baseret på kaffe indtagelse studier med ileostomi frivillige [33], og den gennemsnitlige samlede mængde af fluider i maven, tyndtarmen og colon [34]. Ved 1 mg /ml, kaffeekstrakt resulterede i 23,7 ± 4,6% apoptose sammenlignet med mock behandling, 8,4 ± 0,4% apoptose (P = 0,001), Fig.4A. Behandling af cellerne med butyrat + propolis resulterede i 39,3 ± 5,1% apoptose, og tilsætningen af ​​0,25, 0,5, eller 1,0 mg /ml kaffeekstrakt øget apoptose til 51,8 ± 5,7% (P = 0,017), 64,8 ± 3,2% (P = 0), eller 77,4 ± 4,1% (P = 0), henholdsvis Fig.4A.

A. HCT116-celler blev eksponeret i 24 timer for at spotte (M), 1 mg /ml ristet kaffe ekstrakt (R), 5 mM butyrat og 100 pg /ml propolis (BP) eller butyrat /propolis og stigende koncentrationer af kaffeekstrakt: 0,25, 0,5 eller 1,0 mg /ml. Apoptose blev målt ved flowcytometri som beskrevet i Materialer og Metoder. B. HCT-116-celler blev behandlet som i (A) i 17 timer og totale cellelysater blev analyseret ved western blotting. C. HCT-116 og LT 97 celler blev udsat i 20 timer, og HCT-R-celler blev udsat i 42 timer for at spotte (M), 0,5 uM AZD6244 (A), kombinationen; 5 mM butyrat, 100 pg /ml propolis, 1 mg /ml ristet kaffe ekstrakt (BPR), eller BPR og 0,5 uM AZD6244 (BPR-A). Apoptose blev målt ved flowcytometri som beskrevet i Materialer og Metoder. Statistisk signifikante forskelle i apoptotiske niveauer er noteret af stjerner (P 0,05). D. Klonal vækstassays. Procent klonal vækst blev beregnet ved at dividere antallet af cellekolonier med antallet af udpladede celler og gange med 100. Forholdene mellem klonal vækst blev beregnet ved at dividere procent klonal vækst i mock-behandlede prøver ved den procent klonal vækst i agent- behandlede prøver. Forsøg blev gentaget fire til seks gange med tredobbelte prøver per eksperiment. Statistisk signifikante forskelle blandt cellelinier i deres gennemsnitlige forhold blev bestemt ved envejs ANOVA. For celler udsat for butyrat, F (6,31) = 10,26, P 0,0001; for celler eksponeret for propolis og kaffeekstrakt, F (6,28) = 5,493, P = 0,0007, og for celler udsat for butyrat, propolis og kaffeekstrakt, F (6,26) = 10,56, P 0,0001. De post-test beregninger brugte Bonferroni korrektion for at justere for flere sammenligninger med 95% sikkerhed. Blandt de celler udsat for butyrat, statistisk signifikante forskelle (P 0,05, CI 95%) blev påvist i HCT116 vs. CCL92, HCT116 vs. HEK293, HCT116 vs. SW13, HCT116 vs. LA1-5s, HCT116 vs. HCT-R , CCD841CoN vs. HEK293, og CCD841CoN vs. HCT-R-celler.