PLoS ONE: CD4 + T-celler, der udtrykker Latency-associeret peptid og Foxp3 Er en Aktiveret undergruppe af Regulatory T-celler beriget med patienter med kolorektal Cancer

Abstrakt

Latency-associeret peptid (LAP) – udtrykker regulatoriske T-celler ( tregs) er vigtige for immunologisk selvtolerance og immun homøostase. For at undersøge betydningen af ​​LAP i human CD4

+ Foxp3

+ tregs, designet vi en tværsnitsundersøgelse, der involverede 42 kolorektal cancer (CRC) patienter. De fænotyper, cytokin-frigivelse mønstre og undertrykkende evne tregs isoleret fra perifert blod og tumorvæv blev analyseret. Vi fandt, at populationen af ​​LAP-positive CD4

+ Foxp3

+ tregs steget betydeligt i perifert blod og cancer væv af CRC patienter sammenlignet med den i det perifere blod og væv hos raske forsøgspersoner. Både LAP

+ og LAP

– tregs havde en lignende effektor /memory fænotype. Men LAP

+ tregs udtrykte flere effektor molekyler, herunder tumornekrosefaktorreceptor II, granzym B, perforin, Ki67, og CCR5, end deres LAP

– negative modstykker. In vitro immunosuppressiv aktivitet af LAP

+ tregs, der udøves via en transformerende vækstfaktor-β-medieret mekanisme, var mere potent end den for LAP

– tregs. Desuden berigelsen af ​​LAP

+ treg befolkning i perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) i CRC patienter korreleret med kræft metastaser. Afslutningsvis fandt vi, at LAP

+ Foxp3

+ CD4

+ Treg celler repræsenterede en aktiveret undergruppe af tregs have mere potent regulatorisk aktivitet i CRC patienter. Den øgede hyppighed af LAP

+ tregs i PBMC’er af CRC patienter tyder deres potentielle rolle i kontrollen immunrespons til kræft og præsenterer LAP som en markør for tumor-specifikke tregs i CRC patienter

Henvisning:. Mahalingam J Lin CY, Chiang JM, Su PJ, Chu YY, Lai HY, et al. (2014) CD4

+ T-celler, der udtrykker Latency-associeret peptid og Foxp3 Er en Aktiveret undergruppe af Regulatory T-celler beriget med patienter med kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (9): e108554. doi: 10,1371 /journal.pone.0108554

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA

Modtaget: April 3, 2014 Accepteret: August 24, 2014; Udgivet den 30. september, 2014

Copyright: © 2014 Mahalingam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Rådet, Taiwan (NSC Grant NSC 99-3112-B-182-011, 97-2314-B-182A-027) og CMRPG 380.362, 380.743, 392.087 fra Chang Gung Memorial Hospital. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Alle forfattere har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Immunosuppressive funktioner af en specialiseret undergruppe af T-celler er afgørende for immune regulering. Regulatoriske T-celler (tregs) spiller en central rolle i opretholdelsen af ​​perifer selv-tolerance og immune homeostase [1] – [3]. Flere linjer af beviser tyder på, at forkhead transskription faktor (Foxp3) udtrykkende CD4

+ tregs er heterogene i deres udvikling og funktioner. Således naturlige tregs henvises til CD4

+ Foxp3

+ tregs af thymus oprindelse, mens induceret tregs (iTregs) er en T-celle population perifert konverteret fra CD4

+ Foxp3

– T-celler [4] – [6]. Huehn et al. var den første til at påvise eksistensen af ​​forskellige delmængder af tregs, naive tregs og effektor memory tregs, baseret på ekspressionen af ​​CD103, en receptor for α

E integrin der guider T-celler til betændte steder [7]. Den immunmodulatoriske funktion aktiveret eller effektor tregs relateret til ekspressionen af ​​en række molekyler, såsom kemokinreceptorer CCR6 og CCR5, cytotoksisk T-lymfocyt-antigen-4 (CTLA-4), tumornekrosefaktor-receptor (TNFR) II blev derefter undersøgt i kroniske inflammatoriske sygdomme, graft-versus-host sygdom, og tumorer [8] – [15]. Sakaguchi et al. yderligere afgrænset rolle Foxp3

+ CD4

+ tregs baseret på ekspressionen af ​​CD45RA og Foxp3 og delt CD4

+ Foxp3

+ tregs i tre fænotypisk og funktionelt forskellige undergrupper, nemlig ikke-undertrykkende, hvile, og aktiveret tregs; sidstnævnte menes at virke som suppressorer af immunrespons og mediatorer af immun hæmostase [16]. Vi havde tidligere vedtaget denne klassifikation og fundet, at hos patienter tyktarmskræft, kun det aktiverede og ikke de naive tregs akkumuleret i tumorstedet, undertrykt effektor T-celleproliferation in vitro, og korreleret med tumorprogression [17]. Vi har foreslået, at i betragtning af den forskellen regulerende aktivitet af humant tregs, er det nødvendigt at adskille Foxp3

+ tregs i funktionelle undergrupper og at målrette en bestemt treg subpopulation for at sikre en vellykket immunterapi.

En række undersøgelser har vist, at transformerende vækstfaktor (TGF) -β spiller en kritisk rolle i immunsuppression udøves af Foxp3

+ tregs [18] – [22]. TGF-β i kombination med IL-2 kraftigt inducerer differentieringen af ​​naive tregs i funktionel Foxp3

+ iTregs [19]. Latens-associeret peptid (LAP) er den N-terminale propeptid af TGF-β prækursor, at ikke-kovalent binder til TGF-β, der udgør en latent TGF-β-kompleks og lette frigivelsen af ​​TGF-β1 i den ekstracellulære matrix [23]; efterfølgende, den aktiverede TGF-β fremmer omdannelsen af ​​naive tregs til iTregs og medierer Treg-associeret immunsuppression [24]. LAP udtrykkes på cellemembranen af ​​mange immunceller, herunder tregs, og deltager i immunregulering. TGF-β-afhængige LAP-udtrykkende tregs har vist undertrykkende evne hos mus og mennesker. Således er en delmængde af inducerbar LAP-positive Foxp3

-CD4

+ tregs undertrykt allergisk inflammation hos mus [25] – [27]. Gandhi et al. rapporterede, at denne nye Treg population, isoleret fra humant perifert blod, undertrykte proliferationen af ​​andre T-celler in vitro, som blev delvist medieret af TGF-β og IL-10 [28]. Vores tidligere undersøgelse har vist, at populationen af ​​CD4

+ LAP

+ -celler blev øget i det perifere blod af colorektal cancer (CRC) patienter; Desuden er disse celler demonstrerede en TGF-β-afhængige undertrykkende fænotype [29]. Vigtigere er det, vi observerede en beskeden stigning i CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler i CRC patienter, disse tregs sjældent blev observeret hos raske personer. Chen et al. opnået lignende resultater i en murin eksperimentel autoimmun encephalitis (EAE) model, hvor en unik undergruppe af LAP-udtrykkende CD4

+ CD25

+ tregs udviste mere potente undertrykkende evne end LAP-negative tregs [30]. Eksistensen af ​​CD4

+ CD25

+ LAP

+ tregs med undertrykkende aktivitet blev også observeret i autoimmun syndrom af scurfy mus [31]. Men hos mennesker, den immunmodulerende rolle LAP udtrykker CD4

+ Foxp3

+ tregs er ikke godt karakteriseret. I dette arbejde har vi vist, at CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ treg befolkning var let øget i det perifere blod af CRC patienter og præsenteret en distinkt delmængde af aktiverede tregs der potent undertrykte effektor celler gennem en TGF -β-relaterede mekanisme. En højere procentdel af LAP

+ tregs korreleret med tumor progression, tyder på, at LAP

+ tregs spille en vigtig rolle i immun tolerance over for CRC.

Materialer og metoder

Patienter

i alt 42 CRC-patienter og 21 raske donorer blev indskrevet i denne undersøgelse. De 42 CRC patienter blev nyligt diagnosticeret med sygdommen og gennemgik kolektomi uden præoperativ kemoterapi og /eller strålebehandling på Chang Gung Memorial Hospital, Linkou filial, Taoyuan, Taiwan. Blodprøver blev opsamlet fra patienterne ved venepunktur før operation. Patienternes kliniske karakteristika, herunder tumor patologi, CRC scenen, og carcinoembryonisk antigen niveauer blev hentet fra de medicinske journaler.

Blod og vævsprøver

Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev isoleret ved Ficoll- Paque Plus densitetsgradientcentrifugering metode [12]. Lymfocytter blev også isoleret fra de operativt fjernede enheder af både tumor- og ikke-tumorvæv. Ikke-tumorvæv blev udvalgt fra resektionsranden af ​​prøven og bekræftet at være ikke-kræft ved patologisk undersøgelse. Tumor og ikke-tumor-væv blev fint skåret og knust, inkuberet med 0,1% collagenase D (Sigma-Aldrich, USA) i HBSS i 30 min ved 37 ° C og filtreret gennem en nylonnet. Enkelt cellesuspension blev fremstillet med Ficoll (Pharmacia, USA), og leukocytter blev separeret fra interfasen, som tidligere beskrevet [29].

Etiske erklæring

Signed informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere før indskrivning. Undersøgelsen protokol blev konstrueret i overensstemmelse med de etiske retningslinjer for Helsinki-deklarationen fra 2008 og blev godkendt af Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan.

Antistoffer og reagenser

Frisk opnået humane lymfocytter blev farvet med de følgende fluorescerende antistoffer mod human leukocyt overflademarkører: CD4-peridinin-klorofyl-cyanin 5 (PerCP-Cy5.5), CD25-phycoerythrin (PE) eller -allophycocyanin (APC), CD45RA-fluoresceinisothiocyanat (FITC ), CCR7-PE, CCR5-FITC, CCR4-PE-Cy7, CD62L-PE, Ki67-PE eller APC fra (BD Biosciences, USA), og LAP (PE og APC) fra (R 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001) blev betragtet som statistisk signifikant. De statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, USA).

Resultater

En gruppe af CD4

+ Foxp3

+ tregs fortrinsvis udtrykker LAP i CRC patienter

Vi undersøgte først udtryk for overfladen LAP på CD4

+ Foxp3

+ tregs isoleret fra CRC patienter. Pålideligheden af ​​LAP farvning blev bekræftet ved isotypekontrol monoklonale og rekombinant LAP (rLAP) monoklonale antistoffer. (Figur S1) Sammenligningen mellem CRC patienter og raske donorer (HD) afslørede, at LAP udtryk i CD4

+ Foxp3

+ T celler isoleret fra PBMC’er var steget betydeligt i kræftpatienter (CRC: 18,8% ± 9,2% vs. . HD:. 7,8% ± 3,3%, fig 1A og B). Endvidere Fig 1C viser, at procentdelen af ​​CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler var signifikant højere i tumorvæv end i ikke-tumorvæv af CRC patienter (12,4% ± 8,8% vs. 5,5 % ± 3,8%, P = 0,02). Resultaterne antyder, at den forøgede population af CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs i CRC kan spille en vigtig rolle i regulering anti-tumor immunrespons.

(A) Procentdelen af LAP

+ celler i gated CD4

+ Foxp3

+ subpopulationer af kolorektal cancer (CRC) patienter og raske donorer. Sammenlignet med raske donorer viste CRC patienter en øget frekvens af LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ T-celler i perifert mononukleære blodceller (PBMC’er) og tumor-infiltrerende lymfocytter (tils). (B). PBMC’er fra CRC patienter og raske donorer blev isoleret, og procentdelen af ​​LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ tregs blev beregnet ved FACS-analyse. Forskellen mellem prøver blev analyseret ved Students

t

-test (*** P 0,001). (C). Lymfocytter blev isoleret fra tumor og ikke-tumor-væv af CRC patienter, og procentdelen af ​​LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ T-celler blev beregnet ved FACS-analyse. CRC-TIL’er, tumorinfiltrerende lymfocytter; CRC-NILS, ikke-tumor væv-infiltrerende lymfocytter. Forskellen i andelen af ​​CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler mellem CRC-NIL og CRC-TIL-populationer blev analyseret ved Students

t

-test (* P 0,05 , ** P 0,01, og *** P. 0,001)

fænotype CD4

+ Foxp3

+ tregs af CRC patienter blev analyseret på grundlag af ekspressionen af ​​overfladen hukommelse cellemarkører CD45RA og CCR7 (fig. 2A). CD45RA og CCR7 ekspressionsmønstre indikerede, at både LAP

+ og LAP

– delmængder af Foxp3

+ CD4

+ T-celler havde hovedsagelig et effektor /memory fænotype i perifert blod samt i tumor lokaliteter af CRC patienter (fig. 2B) [17]. Således har LAP-positive tregs i CRC ikke forskellige fra deres LAP-negative modstykker i ekspression af effektor /memory fænotype.

PBMC og TIL-suspensioner blev analyseret for ekspression af fænotypiske markører CCR7 og CD45RA at evaluere differentieringstrinet af CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler. (A) Dot blot repræsenterer den naive (N, CD45RA

+ CCR7

+), central hukommelse (CM, CD45RA

-CCR7

+), effektor memory (EM, CD45RA

– CCR7

-), og terminal effektor (TE, CD45RA

+ CCR7

-) CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs. (B) Differentiation stadier af CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs i det perifere blod, tumorvæv, og ikke-tumorvæv af CRC patienter blev bestemt ved flowcytometri. Hver prik repræsenterer den gennemsnitlige ± SD af en individuel prøve.

Forhøjet udtryk af aktiverede Treg-relaterede markører i CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler

Vi undersøgte ekspressionen af ​​treg-associerede aktiverende /effektormolekyler, herunder TNFR super familiemedlemmer, granzym B, perforin, Ki67, CTLA-4, og Tim-3, i CD4

+ Foxp3

+ T celler. Sammenlignet med CD4

+ Foxp3

+ LAP

– T-celler, CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler viste signifikant højere udtryk for TNFRII, granzym B, perforin, Ki67 og Tim-3 og lavere ekspression af CTLA-4 (fig. 3A). Disse data indikerer, at i CRC, en øget andel af LAP-positive CD4

+ Foxp3

+ tregs har en aktiveret prolifererende fænotype.

(A) PBMCer fra CRC patienter blev analyseret for ekspression af Treg markører TNFR II, granzym B, perforin, Ki67, CTLA-4, og Tim-3 ved FACS. Histogrammet er udtryk for Treg markører i CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs og CD4

+ Foxp3

+ LAP

– tregs; udtrykket forskellen mellem T-cellepopulationer blev analyseret ved parret

t

-test (* P 0,05, ** P 0,01 og *** P 0,001). (B) Typiske histogrammer repræsenterer procentdelen af ​​CD62L-, CCR4-, og CCR5-positive CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs og CD4

+ Foxp3

+ LAP

– tregs; ekspressionsniveauerne af CD62L, CCR4, og CCR5 blev sammenlignet mellem begge T-cellepopulationer. Data blev analyseret ved parret

t

-test (* P 0,05, ** P 0,01, og *** P 0,001).

Flere linjer af beviser fra muse og humane studier tyder på, at ekspressionen af ​​visse chemokinreceptorer, herunder CCR4 og CCR5, er karakteristisk for en aktiveret undergruppe af CD4

+ Foxp3

+ tregs. Ekspressionen analyse af CCR4, CCR5, og L-selectin (CD62L) indikerede, at CD62L blev signifikant nedreguleret i CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler sammenlignet med deres LAP

– negative modstykker ( gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI), 594 ± 41,9 vs. 684 ± 70,9, P = 0,006); udtryk for CCR4 var ens, hvorimod den i CCR5 steg i CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler sammenlignet med CD4

+ Foxp3

+ LAP

– T-celler ( CCR4: 40,7% ± 5,9% vs. 37,7% ± 6,2%, P = 0,2; CCR5: 13,2% ± 1,9% vs. 6,2% ± 1,7%, P = 0,001). Disse resultater indikerer, at CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs har en aktiveret fænotype.

CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs udviser potent TGF -β-afhængig suppression evne

TGF-β er et immunsuppressivt cytokin vides at spille en kritisk rolle i dannelsen og funktionel aktivitet af tregs. Membrane TGF-β opretholdes i en latent form af ikke-kovalent binding til LAP. For at undersøge associationen af ​​LAP-positive treg fænotype med TGF-β, vi analyserede TGF-β-produktion i CRC Foxp3

+ LAP

+ tregs stimuleret med PMA /ionomycin. Som vist i fig. 4A, TGF-p-niveauer var højere i LAP-positive Treg delmængde end i LAP-negative Treg delmængde (7,50% ± 1,1% vs. 2,8% ± 1,1%, P = 0,001), hvilket antyder, at CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ celler udøver deres regulerende funktion gennem TGF-β vej.

(A) udtrykket af TGF-β i CD4

+ Foxp3

+ LAP

+, CD4

+ Foxp3

+ LAP

– og CD4

+ Foxp3

+ tregs blev analyseret ved FACS. T-celler blev stimuleret in vitro som beskrevet i Materialer og metoder, og TGF-β-ekspression blev sammenlignet mellem disse tre grupper af parret

t

-test (** P 0,01). (B) CD4

+ CD25

+ LAP

+ T-celler og CD4

+ CD25

+ LAP

– T-celler blev separeret ved cellesortering under anvendelse FACSAria og stimuleret med anti- CD3 og anti-CD28-antistoffer i 96 timer. T-celleproliferation blev bedømt ved thymidin [

3H] inkorporering og udtrykt som middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg; data blev analyseret ved parret

t

-test (* P 0,05). (C) Anti-TGF-β-antistof (10 ug /ml) blev tilsat til CD4

+ CD25

+ LAP

+ tregs samdyrket med CD4

+ CD25

LAP

+ T-celler (forholdet 01:01) og aktiveres af anti-CD3 og anti-CD28 mAb’er. Procentdelen af ​​undertrykkelse i nærvær eller fravær af anti-TGF-β-mAb er udtrykt som middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 ved parret

t

-test

Næste, vi evaluerede udtryk for LAP blandt CD4

+ CD25

-, CD4

+. CD25

lo, og CD4

+ CD25

hi subpopulationer af CD4

+ tregs og fandt, at i CRC patienter, LAP-positive CD4

+ Foxp3

+ tregs blev hovedsageligt observeret inden CD4

+ CD25

hi rum. Derefter CD4

+ CD25

+, CD4

+ CD25

-, CD4

+ CD25

+ LAP

+, og CD4

+ CD25

+ LAP

– Treg populationer blev separeret ved cellesortering, og deres evne til at inhibere proliferation af frisk isolerede CD4

+ CD25

– T-celler blev vurderet ved [H

3] thymidininkorporering assay . Blandt disse Treg subpopulationer, CD4

+ CD25

+ LAP

+ -celler udviste den mest potente undertrykkende evne (P 0,03;. Figur 4B), som blev inhiberet in vitro ved indgivelse af anti-TGF β-antistof (fig. 4C). Berigelse i perifert blod CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler korrelerede med CRC progression.

Den kliniske relevans af CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler i CRC blev undersøgt i 42 CRC patienter (deres demografiske og kliniske karakteristika er vist i tabel 1). Kun 9 patienter havde tilbagevendende cancer eller sygdomsprogression. Procentdelen af ​​CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler i CD4

+ Foxp3

+ T-celle population korrelerede ikke med den for CD4

+ Foxp3

+ T-celler i CD4

+ T-celle populationen i perifert blod. I tumor-infiltrerende lymfocyt (TIL) befolkning, procentdelen af ​​CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler korrelerede med den af ​​CD4

+ Foxp3

+ T-celler (r

2 = 0,1, P = 0,04). Andelen af ​​CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler omvendt korreleret med den for CD8

+ T-celler i perifert blod (R

2 = 0,2, P = 0,01); i TIL, en tendens til omvendt korrelation mellem CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ og CD8

+ T-celler blev observeret; men det ikke var statistisk signifikant (r

2 = 0,08, P = 0,18). Desuden fandt vi ingen korrelation mellem cirkulerende CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler og andre inflammatoriske celler, såsom neutrofiler, lymfocytter og monocytter (fig. 5A). Undersøgelsen omfattede 26 patienter med tyktarmskræft og 16 patienter med endetarmskræft; Men andelen af ​​cirkulerende eller tumor infiltrerende CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler i CD4

+ Foxp3

+ T-celle population var ikke forskellig mellem de to grupper af CRC patienter (fig 5B).

(A) Sammenhæng mellem LAP

+ Foxp3

+ CD4

+ T-celler og CD4

+ Foxp3

+ T-celler, CD8

+ T-celler, totale lymfocytter, monocytter og neutrofiler (r

2 og P-værdier) blev evalueret af Pearson korrelation metode. (B) Den procentdel af LAP

+ tregs i PBMC og TIL-populationer blev sammenlignet mellem CRC patienter med endetarm og tyktarm tumorer; data blev analyseret ved parret

t

-test (* P 0,05). (C) CRC patienter blev grupperet på basis af tilstedeværelsen eller fraværet af lymfekirtel eller fjernmetastaser. Procentdelen af ​​CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs i PBMC og TIL-populationer blev sammenlignet blandt de patientgrupper med forskellige CRC etaper og de raske donorer. Statistisk analyse blev udført ved envejs ANOVA (** P 0,05, ** P 0,01, og *** P 0,001).

Endelig har vi undersøgt sammenhængen mellem CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler med tumor stadie. Som vist i fig. 5C, procentdelen af ​​CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-celler i det perifere blod af metastatiske patienter signifikant større end den, CRC patienter uden metastaser og hos raske donorer. Endvidere størrelsen af ​​CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Treg befolkning blev forøget i tumorvæv sammenlignet med ikke-tumorvæv (figur 5C). Følgelig er forhøjelsen af ​​LAP

+ tregs i det perifere blod af CRC patienterne kunne afspejle stigningen af ​​LAP

+ tregs i tumorvæv og kunne korreleres med kræft stadium, hvilket antyder, at størrelsen af ​​perifert blod LAP- positive CD4

+ Foxp3

+ T-celle delpopulation kan tjene som et surrogat markør for immunosuppression proces i CRC.

diskussion

resultaterne af vores undersøgelse viser, at LAP udtryk mærker en delpopulation af CD4

+ Foxp3

+ tregs med potente undertrykkende evne. Selv om de fleste af CD4

+ Foxp3

+ tregs i CRC patienter er klassificeret som aktiveres, blandt dem, LAP-positive tregs har endnu mere potent undertrykkende funktioner. Dette manifesteres ved højere ekspression af aktiverede cellemarkører, forøget produktion af immunsuppressiv TGF-β, og mere potent undertrykkende evne in vitro i LAP-positive tregs sammenlignet med LAP-negative tregs. Vores resultater antyder, at LAP kan være en potentiel markør for at identificere en undergruppe af tregs, der udviser TGF-β-beslægtede undertrykkende funktioner. Dette Treg subpopulation blev beriget i det perifere blod af CRC patienter, hvilket korrelerede med tumorprogression, hvilket antyder, at CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs kan have klinisk anvendelse som markører for tumorspecifikke tregs i CRC patienter.

Den funktionelle rolle af LAP i tregs er ikke klart. LAP forbliver kovalent forbundet med TGF-β efter spaltning fra forstadiet peptidet og danne det inaktive latent TGF-β-kompleks; Det bidrager derfor til forebyggelse af ukontrolleret aktivering af TGF-p-receptorer. Nakaruma et al. var de første til at påvise, at både murine og humane CD4

+ CD25

+ tregs kunne udøve TGF-β-afhængige suppression af effektorceller, der blev vendt af den rekombinante LAP. De viste også, at LAP-positive CD4

+ T-celler kunne undertrykke colitis in vivo, hvilket tyder på, for første gang, kan der LAP betragtes som en regulatorisk markør [24]. Qida et al. endvidere dokumenteret, LAP-ekspression på murine CD4

+ T-celler blev induceret ved TGF-β uafhængigt af Foxp3 [25]. Shevach et al. observeret ekspressionen af ​​TGF-β-LAP komplekser på aktiverede tregs men ikke på hvilende tregs induceret via ikke-antigen stimulation [21], [31], [32]. LAP

+ tregs undertrykte proliferationen af ​​aktiverede T-celler, men ikke af naive T-celler i en TGF-β-afhængig måde og medieret infektion tolerance ved omdannelse Foxp3-negative tregs til funktionelt aktive Foxp3-positive tregs [32]. Det antages, at LAP-TGF-β-kompleks udgør en vigtig mekanisme til tregs at opretholde immune homøostase via TGF-β-signalering.

Chen et al. har yderligere funktionelt karakteriseret CD4

+ CD25

+ LAP

+ tregs i en murin autoimmun encephalitis (EAE) model [30]. CD4

+ CD25

+ LAP

+ treg befolkning havde højere frekvens af Foxp3 udtryk og produceret forhøjede niveauer af effektor molekyler og cytokiner end deres LAP-negative modstykker. LAP-udtrykkende tregs var anergiske og undertrykkende in vitro; men deres supprimerende aktivitet var mere potent i sammenligning med den for andre Treg typer. Disse celler udtrykte både TGF-β og dets receptorer; undertrykkelse evne LAP

+ tregs blev vendt ved TGF-β neutralisering, hvilket indikerer, at CD4

+ CD25

+ LAP

+ tregs var, i det mindste delvist, reguleret på en TGF-β- afhængig måde. Endvidere in vivo adoptiv overførsel af CD4

+ CD25

+ LAP

+ tregs lindres EAE, hvilket bekræfter den immunosuppressive Styrken af ​​dette Treg population. Baseret på disse resultater, kunne LAP betragtes som en markør til identifikation af en undergruppe af CD4

+ CD25

+ tregs med potente undertrykkende evne [30]. Hos mennesker Shevach et al. viste, at tilstedeværelsen af ​​overfladen TGF-β kompleksbundet med LAP induceret Foxp3 og resulterede i undertrykkelse af responderceller, der antyder, at der både Foxp3 og LAP kunne give mere potent undertrykkende aktivitet på human Treg cellepopulation [31].

selvom rolle LAP-positive tregs ikke er fuldt belyst, de tilgængelige data tyder på, at LAP kan være et nyttigt biomarkør at identificere aktiveret tregs i mus og mennesker. Hos mus kan LAP anvendes til in vitro-selektion af ekspanderet CD4

+ Foxp3

+ undertrykkende tregs [33], mens hos mennesker, er det blevet foreslået som markør for at overvåge tregs efter anti-CTLA-4 immunterapi [34]. Vores undersøgelse styrker endvidere den opfattelse, at LAP udtryk kan skelne aktiveret tregs, især dem, der cirkulerer i det perifere blod hos CRC patienter. Vigtigst, tumor progression korreleret med øget andel af LAP

+ tregs. Taget sammen antyder disse data, at cirkulerende LAP-positive CD4

+ Foxp3

+ tregs, snarere end den generelle befolkning af CD4

+ Foxp3

+ T-celler, kan anvendes som en mere nøjagtig og specifik markør til overvågning af immunologiske status kræftpatienter.

som konklusion, CD4

+ tregs, der udtrykker både Foxp3 og LAP udviser højere immunsuppressiv aktivitet end andre Treg celle delmængder. Den undertrykkende LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ tregs regulere immunresponser, i det mindste delvist, via TGF-β-signalering. Den berigelse af CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ tregs i det perifere blod af CRC patienter kan potentielt anvendes til overvågning af kræft immunterapi i kliniske omgivelser.

Støtte oplysninger

figur S1.

Ekspression af LAP. (EN). Isotypen kontrol monoklonalt antistof (IC) og rekombinant LAP (rLAP) blev bekræftet pålideligheden af ​​farvning. (B). Identifikation af CD4

+ Foxp3

+ T-celler. Isotypen kontrol monoklonalt antistof (IC) blev anvendt til at bekræfte LAP

+ T-celler farvning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0108554.s001

(TIF)