PLoS ONE: Acid Gradient tværs plasmamembranen kan køre Fosfat Bond Syntese i cancerceller: Sur Tumor Milieu som en potentiel energikilde

abstrakt

Aggressive cancere udviser en effektiv omdannelse af store mængder af glucose til lactat ledsaget af syresekretion, et fænomen populært kendt som Warburg virkning. Den sure mikromiljø og den basiske cytosolen skabe en proton-gradient (syre gradient) over plasmamembranen, der repræsenterer proton-motiv energi. Stigende eksperimentelle data fra fysiologiske relevante modeller antyder, at syre gradient stimulerer tumor spredning, og kan også støtte sit energibehov. Dog er direkte biokemisk beviser, der forbinder ekstracellulær syre gradient til generation af intracellulær ATP mangler. I dette arbejde viser vi, at cancerceller kan syntetisere væsentlige mængder phosphat-bindinger fra phosphat som reaktion på syre gradient over plasmamembranen. Den bemærkede fænomen eksisterer i fravær af glykolyse og mitokondriel ATP syntese, og er unik for kræft. Biokemiske assays under anvendelse af levedygtige cancerceller og oprensede plasma membranvesikler anvender radioaktivt phosphat, bekræftede phosphat-binding syntese ud fra frit phosphat (P

i), og også lokalisering af denne aktivitet til plasmamembranen. Ud over ATP, fremherskende dannelse af pyrophosphat (PP

i) fra P

Jeg blev også observeret, når plasma membran vesikler fra kræftceller blev udsat for trans-membran syre gradient. Cancer cytosol blev fundet stand til at omdanne PP

i at ATP og også stimulere ATP-syntese fra P

i fra vesiklerne. Acid gradient skabt gennem glukose metabolisme ved cancerceller, som observeret i tumorer, også vist sig afgørende for fosfat-bond syntese. Kort sagt, disse observationer afslører en rolle surt tumor miljø som en potentiel energikilde og kan tilbyde en ny terapeutisk target

Henvisning:. Dhar G, Sen S, Chaudhuri G (2015) Acid Gradient tværs plasmamembranen Can Drive Fosfat Bond Syntese i cancerceller: Sur Tumor Milieu som en potentiel energikilde. PLoS ONE 10 (4): e0124070. doi: 10,1371 /journal.pone.0124070

Academic Redaktør: Marie-Joelle Virolle, University Paris Syd, FRANCE

Modtaget: December 1, 2014 Accepteret: 25 februar 2015; Udgivet 15. april, 2015

Copyright: © 2015 Dhar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til GC fra Carl og Roberta Deutsch Foundation og Kelly Day. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Warburg effekt er en metabolisk kendetegnende for mest aggressive cancerceller, hvorved det meste af glucose omdannes til lactat i nærvær af oxygen [1, 2]. Den aerobe glykolyse er ledsaget af forsuring af tumor mikromiljø [3, 4], som giver selektiv vækst fordel for cancerceller ved metabolisk omprogrammering [5-7], øget invasionsevne [8-10] og regulering af cellecyklus [11]. Aggressive cancerceller kræver ATP for at producere tilstrækkelig byggesten lignende proteiner, lipider og DNA til proliferation. Omdannelse af glucose til lactat producerer kun 2 molekyler ATP i modsætning til 38 molekyler, når de kobles til oxidativ phosphorylering [12]. Selv om aerob glykolyse og ekstracellulær forsuring giver selektiv vækst fordel til kræft som diskuteret ovenfor, til, hvordan kræftcellerne opfylde sit energibehov under denne betingelse er stadig et paradoks.

Acid gradient eller proton-drivkraft tværs membraner er en energikilde, der anvendes af mitokondrierne, chloroplast og den mikrobielle verden at syntetisere phosphat obligationer [12-16]. Først foreslået af Peter Mitchell i sin berømte kemo-osmotiske teori [17], syre gradient tværs membran forblev den mest anvendte metode i levende systemer til at lagre energien i metaboliske brændstoffer som elektrokemisk potentiel energi. Den cellulære maskineri efterfølgende udnytter denne energi til at drive syntesen af ​​højenergi-phosphat-bindinger i form af ATP og andre højenergi-molekyler til anvendelse i cellulære processer. [13, 16].

Det er interessant at bemærke, at selv om den ekstracellulære pH af cancerceller er sur, den intracellulære pH er mere basisk sammenlignet med normale celler [3, 18, 19]. Den alkaliske intracellulære pH og sure ekstracellulære pH med plasmamembranen i mellem repræsenterer en betydelig pulje af proton-motiv energi. Tumorer er i stand til at udnytte den lagrede potentielle energi til at drive højenergi-phosphat-binding syntese i cellerne være en mulighed. Der er stærke fysiologiske beviser for vigtigheden af ​​syre gradient i kræft, der er allerede etableret af andre efterforskere. Det blev observeret, at en forøgelse af ekstracellulære pH ved injektion af alkaliske buffere i tumoren miljøet reducerede tumorstørrelsen og også inhiberede metastase [20, 21]. Endvidere kræftceller udvise forøget proliferation og invasivitet i surt eksterne miljø [8-10, 22]. Dette in vivo fysiologiske beviser tyder på, at syre gradient, uafhængig af tilstanden af ​​syresekretion, stimulerer proliferation af cancerceller og er også støtter deres energibehov. Imidlertid har direkte biokemisk beviser, der forbinder ekstracellulær syre gradient til generation af intracellulær ATP har manglet, og dette er fokus for det foreliggende arbejde. Det er udfordrende at bekræfte ATP-syntese som reaktion på syre gradient med sikkerhed og samtidig fjerne bidrag fra glycolyse eller mitokondrier i en in vivo-system. Inhibering af glykolyse eller mitokondrier in vivo ville være dødelig. Dette kan imidlertid undersøges ved anvendelse af dyrkede celler og oprensede plasma membranvesikler. Radioaktivt phosphat kan anvendes til at bekræfte, om de nye phosphat bindinger dannes fra frit phosphat og ikke af phosphatbinding udveksling. Arbejdet præsenteres her bekræfter, at kræftceller kan syntetisere betydelige mængder af fosfat obligationer fra fosfat som reaktion på syre gradient over plasmamembranen.

Materialer og metoder

Materialer

Cell liner blev opnået fra ATCC og blev dyrket som beskrevet. Celler blev høstet, når 80-85% sammenflydende ved ophugning med kold PBS indeholdende 10% FBS, uden behandling med trypsin, at bevare overfladeproteiner.

32P

i blev opnået fra Perkin Elmer og blev behandlet med reje-alkalisk phosphatase efterfulgt af varmeinaktivering at fjerne kontaminerende PP

i. Alle andre kemikalier med mindre andet er nævnt blev købt fra Sigma Chemicals.

Assay for mængden af ​​ATP i celler som reaktion på syre gradient

Cell suspensioner (2-3 millioner celler /ml) i PBS eller bis-tris-puffer, indeholdende 10% FBS, og bragt til steady state ved inkubering ved 37 ° C i 20-30 minutter, blev forsuret enten ved tilsætning af 4 volumener reaktionsbuffer (20 mM bis-tris, 150 mM NaCl, 5 mM KCI, 5 mM MgCl. reaktionen blev standset ved hvirvelbehandling med chloroform. det vandige lag blev anvendt

2 eller ved tilsætning af små portioner af fortyndet HCI for at måle ATP under anvendelse af Luciferase luminescens (Promega).

Bestemmelse af størrelsesordenen reaktion (n)

liniens hældning af log (A /A

o-1) eller log (A-A

o) mod pH giver størrelsesordenen reaktion. A

o og A er de mængder ATP før og efter tilsætning af syre henholdsvis. Nærmere oplysninger om den matematiske model er givet i tillægget S1 fig.

Loading celler med

32P

jeg og reaktion på syre

Ca. 10-12 millioner celler blev høstet fra dyrkningsplader ved ophugning i koldt PBS-20% FBS. De blev derefter vasket med cellesuspensionsbuffer SB, som er 50 mM HEPES-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 2 mM KCI, 2 mM MgCl

2, 0,2 mM CaCI

2, 0,4 mM spermin (relativt frisk), 0,25 mg /ml BSA, og derefter suspenderet i 1 ml af den samme buffer, inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter med lejlighedsvis blanding. Cellepelleten blev udvundet og suspenderet i friske 500 pi buffer SB og inkuberet ved 37 ° C i 5 minutter. Til dette blev der tilsat 5 uM oligomycin og 1 uM atractylosid og holdt på is i 15 minutter. Ouabain (0,2 mM) blev tilsat og inkuberet på is i yderligere 15 minutter. Lokal forsuring skyldes afregning af cellerne blev undgået i alle trin ved forsigtigt at vende rørene lejlighedsvis. Efter inkubation ved 37 ° C i 5 minutter, en blanding af kold natriumphosphat, pH 7,5 og radioaktivt phosphat (

32P

i) blev tilsat sådan, at den endelige phosphatkoncentration var 1 mM med ca. 0,20 mCi /ml af radioaktivitet . Dette blev derefter inkuberet i koldt i 45 minutter under forsigtig rotation. Cellepelleten blev isoleret ved centrifugering og vasket med 500 pi vaskebuffer (WB), som var puffer SB indeholdende 1 mM natriumphosphat, 0,2 uM bafilomycin foruden oligomycin, atractylosid og ouabain som før. Cellerne blev suspenderet i WB til en densitet på 10 millioner celler /ml, og alikvoter på ca. 175 pi blev foretaget i separate 1,5 ml rør. Efter inkubering i 1 minut ved 37 ° C, blev cellesuspensionerne syrnet til den ønskede pH ved tilsætning af små portioner af fortyndet HCI og inkuberet i 45 sekunder til 1 minut, hvorefter cellerne blev pelleteret ved centrifugering ved lav hastighed, og supernatanten blev fjernet. Til pelleten blev der tilsat 75 pi chloroform og vortexet. Pelleten bør blive suspenderet i chloroform til effektiv lyse af cellen. Fra tilsætning af syre indtil det punkt, hvor chloroform sættes blev betragtet som inkuberingstiden i syre og var typisk ca. 90 sekunder til 2 minutter. 50 pi ekstraktionspuffer (EB), som var 1 mM kaliumphosphat pH 6,5, 0,2 mM EDTA, blev tilsat, vortexblandet og derefter holdt i vibrator i 10-15 minutter. Dette blev derefter centrifugeret, og det vandige lag blev forsigtigt taget ud og holdt ved -80 ° C. Til analyse af prøven, blev ca. 20 pi af den vandige ekstrakt tørres ved speed-vac og analyseret ved TLC. Prøver blev også anvendt til at estimere den absolutte mængde af ATP ved hjælp af luciferase luminescens (Promega).

Enzymatisk karakterisering af produkterne fra

32P

jeg indlæst celler

Den vandige ekstrakt fra syrebehandlingen af ​​celler blev fortyndet med 4 volumener puffer indeholdende 10 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM EDTA, 1 mM MgCl

2. 10 pi af denne reaktionsblanding blev derefter behandlet med forskellige enzymer (1 enhed) alene eller blandet sammen med tilsatte substrater. I alt 8 forskellige reaktioner blev udført. Hver reaktion havde et bestemt mål i identifikationen af ​​arten af ​​de nukleotider som beskrevet nedenfor. Forsvinden af ​​et band under en karakteristisk reaktion angivet sin identitet. 1. Alkalisk phosphatase (P-ase, Promega) -Fjerner terminale phosphatgrupper med monoester binding. Så det kan indikere, om de bands har terminal fosfat obligationer. 2. Uorganisk pyrophosphatase (PP

i-ase, fra New England Biolab) -hydrolyses pyrophosphat (PP

i). GTP migrerer på samme sted som PP

i i TLC, så denne reaktion kan skelne mellem PP

i og GTP. 3. Phosphodiesterase (PDE) -cleaves den α-β phosphodiesterbinding derfor kan generere PP

jeg fra NTP’er og fosfat fra NDPS. Så bands af NDP og NTP forsvandt med fremkomsten af ​​et band for PP

i. 4. PDE efterfulgt af PP

i-ase-PP

Jeg genereret fra reaktionen med PDE blev kløvet af PP

i-ase, som bekræftede, at det er PP

i og ikke GTP. 5. Adenylatkinase (ADK) og 1 mM AMP-det konverterer ATP til ADP, så ATP band mindsket, mens ADP band forøget. GTP kan også fungere som svagt substrat for denne reaktion så GTP band også formindsket. 6. nukleotid diphospho kinase (NDK) og 1 mM ATP-NDK kan overføre terminal fosfat fra ATP til NDPS, så ADP og BNP bands forsvundet. 7. NDK og 1 mM ADP-ADP omdannes til ATP ved phosphat overførsel fra GTP, så GTP band forsvundet.

Fremstilling af plasmamembranen

plasmamembran blev fremstillet ved den sædvanlige fremgangsmåde til ekspandering af celler i lavsaltbuffer og brud ved passage gennem en smal 25 gauge nål. De buffere og timing blev valgt til at tilfredsstille bevare aktiviteten. EDTA blev ikke tilføjet under oprensningen. 200 millioner celler blev typisk skrottet og høstes i dyrkningsplader med PBS-20% FBS og vasket med 5 ml 2,5 mM kaliumphosphatbuffer, pH 7,5, og suspenderet i 10 ml buffer A, som var 10 mM HEPES-MES (1: 1), 100 mM NaCl, 2 mM KCI ved pH 7,0. Til dette blev der tilsat 0,1 mM PMSF og 2% FBS og holdt på is i 20 minutter, hvorefter natriumphosphat, pH 7,5 blev tilsat til 1 mM. Cellesuspensionen blev lyseret ved 20 fulde slag med 10 ml sprøjte forsynet med en 25 gauge nål mens stadig på is. Den lyserede suspension blev centrifugeret ved 1000 x g i 5 minutter for at fjerne intakte celler og kernen og derefter ved 5000 x g i 15 minutter til fjernelse mitokondrier. Den relativt klare supernatant fra dette trin blev derefter centrifugeret ved 75000xg i 40 minutter i en ultracentrifuge. Supernatanten blev drænet fuldstændigt, og pellets blev samlet sammen og vasket med puffer B, som var puffer A indeholdende 1 mM natriumphosphat og 0,5 mg /ml ultrarent BSA (Invitrogen). Pellets blev derefter suspenderet i 300 pi puffer A indeholdende 0,5 mg /ml ultrarent BSA og opbevares som 75 pi alikvoter ved -80 ° C. Flere freeze-optør stærkt påvirket aktiviteten af ​​enzymerne. For at bevare aktiviteten af ​​enzymet blev de dannet under centrifugering pellets altid suspenderet ved forsigtig pipettering og stærk hvirvelbehandling blev undgået ved alle trin. Alle operationer blev udført i koldt eller på is.

koncentration Protein i udarbejdelsen membran.

For at bestemme de proteinkoncentrationer blev membranpræparationerne gjort i fravær af BSA. De blev opløst i 0,5% SDS og mængden af ​​protein blev estimeret ved anvendelse af BCA protein assay kit (fra Pierce). Typisk Proteinkoncentrationer blev i området fra ca. 0,5 mg /ml. Membraner svarende til ca. 12-15 ug protein pr reaktion blev anvendt som udgangsmateriale koncentration membran under vesikel forberedelse.

Membran renhed og western blot.

blev udført Immunblotanalyse brug af standard teknikker for at bestemme renheden af plasmamembranen fraktioner. Membranenhederne pellets blev opløst ved opvarmning i 1% SDS ved 65 ° C i 10 minutter. Helcelleekstrakter opvarmes i 1% SDS ved 65 ° C i 10 minutter blev anvendt som kontrol. Antistoffer mod Na-K ATPase (ab7671, Abcam Cambridge) og E Cadherin (ab15148, Abcam, Cambridge), blev anvendt til at bestemme berigelsen af ​​plasma membranproteiner. Antistoffer mod VDAC (ab34726, Cambridge, MA) og COXIV (ab124538, Abcam, Cambridge) blev anvendt til at udelukke forureninger fra mitokondriemembranen fraktioner. Antistoffer mod GAPDH (ab8245, ABCAM, Cambridge) blev anvendt til at udelukke cytoplasmatisk forurening.

Udarbejdelse af rightside-out plasma membran vesikler og syre reaktion

Den her angivne metode er en prototype, og de fleste af den tid, det blev skaleret ifølge behovet af eksperimentet. Typisk 150 pi forberedelse plasmamembran blev fortyndet til 300 pi (afhænger densitet af præparatet membran) med puffer A indeholdende 0,5 mg /ml BSA og derefter suspenderet godt ved at anvende 10 slag med 1 ml sprøjte forsynet med 25 gauge nål. Slutvolumenet blev kontrolleret og om nødvendigt blev justeret til 300 pi med den samme buffer. I de følgende trin blev bestanddelene strengt tilsat i nævnte overvejer et endeligt volumen på 400 pi orden. Bestanddelene blev tilsat sekventielt til en slutkoncentration som anført: Hepes-MES (1: 1) pH 7,0 til 50 mM, KCI til 20 mM, natriumphosphat til 1 mM, ouabain til 0,2 mM, oligomycin 10 uM, bafilomycin til 200 nM , atractylosid til 1 uM og BSA til 1 mg /ml. ADP eller andre ingredienser, der er nødvendige for at blive pakket ind i vesikel blev også tilsat som nødvendigt. PH blev derefter indstillet til 7,6 med 1 N natriumhydroxid og bekræftet ved pH-elektrode. Volumenet blev kontrolleret og om nødvendigt blev justeret med vand for at få et endeligt volumen på 400 pi efter tilsætning af radioaktivitet. Dette blev derefter underkastet 10 slag med 1 ml sprøjte forsynet med 25 gauge nål før tilsætning radioaktivitet. 0,4 mCi /ml

32P

Jeg blev derefter tilsat og holdt på is i 20 minutter, hvorefter 10 slag blev anvendt med sprøjte. Vesiklerne blev nu tætnet ved den følgende sekvens af trin. Relativt frisk spermin opløsning blev tilsat til 1,6 mM, anvendes 10 slag med sprøjte, derefter MgCl

2 blev tilsat til 4 mM, anvendes en anden 10 slag med sprøjte og holdt på is i 20 minutter. Hertil sattes valinomycin til 10 uM, holdt på is i 10 minutter efterfulgt af CaCl

2 til 0,4mM og inkuberet på is i yderligere 10 minutter. Magnesium over 6 mM, spermin over 1 mM (endelig efter fortynding) og calcium over 1 mM hæmmede aktivitet så overskydende tilføjelse var altid undgås.

Binding til ConA perler.

300 ul ConA perler ( rad /GE Healthcare) blev vasket to gange i 1 ml buffer indeholdende 10 mM HEPES-MES (1: 1) pH 7,0, 100 mM NaCI, 1 mM CaCI

2, 0,25 mM BSA (ingen MnCl

2 blev tilsat). Efter den sidste vask al væsken blev aspireret ved pipettering med fine gel loading spidser (som ikke tillader perler at få) ved at dyppe den dybt ind i perlerne. Dette blev suspenderet i 2 ml rør med 3 volumener fortyndingspuffer (DB) i forhold til vesikelpræparat, hvilket i dette tilfælde ville være 1,2 ml. Sammensætningen af ​​BF var 50 mM HEPES-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM natriumphosphat, 4 mM MgCl

2, 0,4 mM CaCI

2. Til perlen suspension blev der tilsat 400 pi forseglet vesikelpræparat (fra ovenfor). Fortynding af kalium på dette trin hjælper i binding til ConA perler, der normalt inhiberes ved høj kalium. Røret blev forseglet sikkert og roteres meget forsigtigt i koldt i 50 minutter for at tillade binding uden at skade membranen. Perlerne blev vasket 3 gange med 3 volumener iskold vaskebuffer (WB) ved centrifugering ved 1500 rpm i 30 sekunder. Vaskebufferen indeholdt 50 mM HEPES-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM natriumphosphat, 2 mM KCI, 4 mM MgCl

2, 0,4 mM CaCI

2, 0,4 mM spermin, 0,25 mg /ml ultrarent BSA, 0,1 mM ouabain, 2,5 uM oligomycin, 100 nM bafilomycin, 1 uM atractylosid. Hver gang alle væsker blev aspireret ud fra sengen med fine gel Tip til ilægning ved at dyppe den dybt ned i perlerne. Effektivitet af vask blev kontrolleret ved reduktion af radioaktivitet af perlerne mellem successive vask ved hjælp geigertæller. Perlerne blev derefter suspenderet i ca. 1 ml vaskebuffer, alikvoteres jævnt til ca. 6 rør (195 pi suspension), og straks anvendt til vesikel-assay som beskrevet nedenfor.

Bead bundet vesikel assay.

perlen suspension blev inkuberet ved 37 ° C i 1 minut og til den føjet målte mængder af 1 N HCI for at forskyde pH til ønskede værdier. Efter ønskede tidsinterval (5 sekunder til 2 minutter), blev den centrifugeret i 15 sekunder ved 1000 rpm, og supernatanten blev hurtigt fjernet med fine gel Tip til ilægning ved at dyppe den i perlerne. 75 pi methanol-blanding af chloroform-2,5% blev derefter tilsat til perlerne og hvirvelbehandlet. Til dette blev der tilsat 50 pi ekstraktionspuffer EB (1 mM kaliumphosphat pH 6,5, 0,2 mM EDTA). Blandingen blev derefter holdt i vibrator i 30 minutter, centrifugeret ved 8000 rpm i 10 minutter, og den øverste vandige fase blev omhyggeligt udtaget undgå chloroform under anvendelse fine gel loading tips. Perlerne blev genekstraheret med yderligere 25 pi EB, ved hvirvelbehandling i 5 minutter og centrifugering som før. De vandige lag fra denne to trin blev samlet sammen og centrifugeret ved 10000 rpm i 1 minut for at udfaelde perler og den klare vandige lag blev udtaget. Dette blev derefter holdt ved -80 ° C. Til analyse af prøven, blev ca. 25-30 pi af den vandige ekstrakt tørres ved speed-vac og analyseret i TLC.

Inside-out vesikel (IOV) assay

Membran vesikel blev taget i puffer indeholdende 10 mM Hepes-MES-acetat (1,5: 1: 1) pH 6,34, 2 mM KCI, 150 mM NaCl, 10 uM oligomycin og forseglet med 6 mM MgCl

2. Tilsat 10 pM valinomycin efterfulgt af en fjerdedel volumen af ​​den ovennævnte puffer, men indeholdende 150 mM KCI i stedet for NaCl.

32P

I (0,2-0,5 mM, 0,3 mCi /ml) og ADP (25 uM, når det er nødvendigt) blev derefter tilsat. Efter kortvarig alkalisering i 90 sekunder ved tilsætning af alkali, 20 uM pyrophosphat, og /eller 20 uM ATP blev tilsat for at fortynde (beskytte) de radioaktive produkter og vortexet med chloroform (indeholdende 2% methanol). Det vandige lag blev analyseret ved TLC.

Fremstilling af cytosolisk ekstrakt

Celler (100 millioner /ml) fik lov til at kvælde i 2 mM K

2HPO

4, pH 7,4 til 5 minutter, hvorefter bufferen blev justeret til 10 mM og NaCI til 100 mM. Til dette blev der tilsat 1 mM diethylpyrocarbonat, 50 pM vanadat, 50 uM pyrophosphat og lyseret ved passage gennem 25 gauge nål. Dette blev centrifugeret to gange ved 13,000xg i 15 minutter og derefter enten centrifugeret ved 74000xg i 40 minutter eller sekventielt passeres gennem 0,65 um, 0,22 um og 0,11 um membran kolonne for at fjerne membraner. Proteinindholdet var ca. 3 mg /ml.

IOV og cytosoliske ekstrakt kombination assay

Cytosol (5 ug protein) blev tilsat til IOV blanding indeholdende

32P

I (0,2 mM , 0,3 mCi /ml) og ADP (100 uM) og hurtigt basisk i 10 sekunder. Reaktionen blev standset med 2 mM diethylpyrocarbonat og 1/1000

th phosphatase inhibitor cocktail B (Santa Cruz Biotech) og vortexbehandling med chloroform (indeholdende 2% methanol). Det vandige lag blev analyseret ved TLC.

Assay for omdannelse af

32PP

I til ATP ved cytosolisk ekstrakt

cytosoliske ekstrakter (2 ug protein) blev anvendt pr 50 pi reaktion som indeholdt 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM NaH

2PO

4, 100 mM NaCl,

32PP

i (200 uM, 30 uCi /ml), 1 mM MgCl

2 og 250 pM ADP. Reaktionerne blev standset med 1 mM NHS-biotin (Pierce) og derefter analyseret på TLC.

tyndtlagskromatografi (TLC)

PEI-cellulose- TLC-plader på 250 um tykkelse (fra JT Baker Inc.) blev anvendt. Pletterne blev udviklet med 0,75 M KH

2PO

4, pH 3,5

Statistik

Alle viste som gennemsnit resultaterne præsenteres som gennemsnit ± 2.SD (SD:. Standard afvigelse) fra tre eller flere uafhængige forsøg. Medmindre andet er angivet, blev p-værdier beregnet ved hjælp af Student to-halet test:. (P 0,05 blev betragtet som signifikant)

Resultater

Ekstracellulær syre gradient er kritisk for høje ATP niveauer under aerob glycolyse

Under aerobe glycolyse cancerceller forbruge glucose til dannelse lactat med samtidig ekstrudering af syre, som afspejles ved sænkning af pH af den ydre medium [23]. Oprindeligt ønskede vi at undersøge den kritiske rolle syre gradient i at opretholde ATP niveauer under aerob glykolyse. Vi har designet et eksperiment til samtidigt måle indholdet af ATP, lactat, glucose og pH af det ydre medium i realtid under aerobe glycolyse af højt glycolytiske brystcancerceller, MDA-MB-231 [24]. Vi tilføjede også 10 uM oligomycin, et respektabelt mitokondrie ATP syntese inhibitor, at fjerne enhver bidrag mitokondrie ATP-syntese. Glycolyse blev initieret ved tilsætning af 0,1% glucose. Alikvoter fra cellesuspensionerne blev taget ud hver 5 minutter, tilsat til chloroform og straks hvirvlet i effektiv lyse af cellerne og inaktivering af enzymerne. Den vandige fase blev anvendt til estimering af vandopløselige metabolitter som ATP, glucose og laktat. Vi observerede, som glucose var forbrugt til dannelse lactat, var der en støt fald i pH med tiden ledsaget af en samtidig stigning i steady state niveauerne af ATP i cellerne i forhold til startværdien (Fig 1A). Cellerne forbrugt glucose ved en hastighed på 3,08 nmol /min /million-celler (sd = ± 0,24, 7 datasæt) og produceret lactat ved en hastighed på 4,95 nmol /min /million-celler (SD = ± 0,46, 7 datasæt ) (fig 1B). Dette svarer til næsten 80,7% (s.d. = ± 8,78, 7 datasæt) omdannelse af glucose til lactat under denne tilstand, som ligner den, der ses af andre forskere [25, 26]. På den anden side, når den ekstruderede syre blev konstant neutraliseret ved tilsætning af små portioner af alkali, således at den ekstracellulære pH forblev konstant på omkring 7,4, havde niveauer af ATP ikke øges med tiden i forhold til startværdien (Fig 1C). Men satserne for glukose forbrug (3,46 nmol /min /million-celler, sd = ± 0,17, 3 datasæt), og laktat produktion (5,95 nmol /min /million-celler, sd = ± 0,50, 3 datasæt) udviste ingen signifikant ændring (fig 1D). Dette eksperiment viste, at den ekstracellulære syre gradient spiller en afgørende rolle, selv under aerob glykolyse i at opretholde et højt niveau af ATP i kræftceller. Det opfordrede os til at undersøge, om ekstracellulær syre gradient alene kan køre ATP syntese i kræftceller i mangel af tilsat glukose.

Til MDA-MB-231 cellesuspensioner i PBS-10% FBS indeholdende 10 uM oligomycin blev tilføjet 0,1% glucose under forsigtig mekanisk omrøring. PH af mediet (ekstracellulære pH) blev overvåget i realtid, mens ATP, glucose og lactat blev målt (per million celler) fra alikvoter udtaget ved angivne tidspunkter (fejlmargener = 2.s.d., n = 3). (A) Steady state ATP og syre ekstrudering (pH) under glycolyse. ATP-værdierne øgedes kontinuerligt i forhold til startværdien med gradvist fald i pH i det ydre medium. (B) Glucose forbrugt (åben cirkel) og laktat produceret (fast cirkel) med tiden for eksperimentet i panelet A. (C) Steady state ATP ved kontinuerlig neutralisering af syre. Det udskilte syre blev kontinuerligt neutraliseret ved tilsætning af små portioner af alkali. ATP-værdier forblev næsten uændret i forhold til startværdien under denne betingelse. (D) Glucose forbrugt (åben cirkel) og laktat produceret (fast cirkel) for eksperimentet i panelet C. Disse forsøg blev gentaget tre gange.

Ekstracellulær syre gradient alene er tilstrækkeligt til at drive ATP syntese i kræftceller

Vi ønskede at vurdere, om ekstracellulær syre gradient alene er tilstrækkeligt til at drive ATP syntese i kræft. Brystkræft cellelinien MDA-MB-231 i glucose-fri buffer anvendtes til at standardisere assayet og til at forstå de grundlæggende karakteristika for reaktionen. Cellerne blev taget i glucose-fri suspension buffer og opbevares ved 37 ° C i 20 minutter. Dette var nødvendigt for at tillade cellerne at forbruge cytosolisk glucose og at bringe de basale niveauer af ATP til en stabil tilstand for varigheden af ​​forsøgene. De blev forsuret og derefter lyseres med chloroform efter det anførte tidspunkt (5 sekunder til 2 minutter). ATP produceres blev estimeret ud fra det vandige lag ved luciferase assay. Vi bemærkede, at ATP-produktion som reaktion på ekstracellulær syre var hurtig og robust. ATP-koncentration i cellerne steg hurtigt inden for 20 sekunder og nåede en stabil tilstand med 1 minut ved at forskyde pH fra 7,5 til 7,0 (fig 2A). Hastigheden af ​​ATP-syntese beregnet ud fra de første 20 sekunder var ca. 1,5 nmol /min /million-celler. Nettostigningen af ​​ATP-niveauer ved steady state var omkring 0,7 nmol per million celler for dette eksempel. Det svarer til en stigning på 0,35 mM af ATP i cellerne [27]. Dette indikerer væsentlige robust syntese af ATP i betragtning af at steady state koncentrationen af ​​ATP i celler er omkring 1 mM. Ved pH 6,7, hastigheden af ​​ATP-syntese var for hurtig til at præcist at overvåge, før det opnår steady state. Vi overvågede mængden af ​​ATP stigning efter 5 sekunder af forsuring og estimeret en omtrentlig hastighed på ca. 5,5 nmol /min /million-celler (S.D. = ± 1,3, 3 datasæt). Cellerne beholdt deres levedygtighed og integritet under disse betingelser som bestemt ved trypanblåteksklusion. Næsten alt det producerede ATP ( 98%) blev fundet i cellepelleten indikerer eksklusiv intracellulær produktion af ATP. Disse eksperimenter bekræftede, at ekstracellulær syre gradient i sig selv er tilstrækkeligt til at drive ATP-syntese i cancerceller. Membran brud ved frysning-optøning, mekanisk homogenisering eller lydbehandling afskaffet også denne aktivitet indikerer, at intakt membran var afgørende for dette fænomen.

(A) Tid kinetik ATP-produktion ved pH 7,0. MDA-MB-231 (steady state), ved pH 7,5 i glucose-fri buffer, blev forsuret til pH 7,0 ved 37 ° C i den angivne tid, standset med chloroform og mængderne af ATP blev bestemt ud fra den vandige fraktion. ATP værdier er per million celler (fejlmargener = 2.s.d., n = 3). (B) Forhøjelse af steady state niveauer af ATP med fald i ekstracellulær pH. Cellesuspensioner (steady state) ved pH 7,5 i glucose-fri buffer blev syrnet til den angivne pH i 2 minutter ved 37 ° C og standset med chloroform. Mængderne af ATP i cellerne blev bestemt ud fra den vandige fraktion. Stigning i ATP per million celler er vist (fejlmargener = 2.s.d., n = 3). Vægten blev holdt ens for bryst celler MDA-MB-231 og MCF-10A, og for lungeceller A549 og Beas2 til sammenligning. Rækkefølgen af ​​reaktionen (n) til dette forsøg ved anvendelse af steady state ligning (se metoder) er vist i tillægget (S2 Fig). De gennemsnitlige værdier af n (hældning) fra flere sådanne eksperimenter er: MDA-MB 231, 0,89 (s.d. = ± 0,07, 7 datasæt); A549, 0,79 (s.d. = ± 0,06, 4 datasæt) og PaCa-2, 2,12 (s.d. = ± 0,23, 6 datasæt). (C) reversible natur af syre gradient afhængig ATP-dannelse. MDA-MB-231 cellesuspension (steady state) ved pH 7,5 i glucose-fri puffer blev forsuret i trinvis måde fra pH 7,5 til 6,2 på tilsætning af små portioner af syre under forsigtig omrøring tilstand ved 37 ° C. Ved hvert trin pH af cellesuspensionen blev bemærket og alikvoter blev udtaget efter 2 minutter for bestemmelse af ATP (udfyldt cirkel med optrukket linje). Efter at have nået pH 6,2 blev portioner af alkali tilsat på en trinvis måde for at bringe pH tilbage til 7,5 (åben cirkel og stiplet linje). Stigningen i ATP niveauer er per million celler (fejlmargener = 2.sd, n = 3).

Efter disse indledende forsøg, effekten af ​​ekstracellulær pH ​​på steady state niveauer af ATP blev vurderet ved pH-værdier ‘i området fra 6,0 til 7,5. Vi anvendte et panel af aggressive cancercellelinjer opnået fra forskellige vævstyper, MDA-MB-231 (brystkræft), A549 (lungecancer) og MIA-PaCa-2 (pancreascancer, herefter kaldet PaCa-2), med henblik på at bestemme universalitet af fænomenet.