PLoS ONE: Kunstigt Introduceret aneuploid kromosomer Antag et konserveret Position i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Kromosomal aneuploidi er et karakteristisk træk ved karcinomer. For eksempel i koloncancer, er ikke kun observeret en ekstra kopi af kromosom 7 i tidlige præmaligne polypper, men er trofast opretholdes gennem progression til metastase. Disse kopi nummer ændringer viser en positiv sammenhæng med gennemsnitlige transcript niveauer af hjemmehørende gener. En uafhængig linje af forskning har også påvist, at specifikke kromosomer indtager en velbevaret 3D position inden interfasen kernen.

Metode /vigtigste resultater

Vi undersøgte, om kræft-specifikke aneuploide kromosomer antager en 3D- stilling svarende til den i dens endogene homologer, hvilket tyder på en mulig korrelation med transkriptionsaktivitet. Brug 3D-FISH og konfokal laser scanning mikroskopi, viser vi, at Kromosomer 7, 18, eller 19 indført via mikrocelle-medieret kromosom overførsel til forældrenes diploid coloncancercellelinie DLD-1 bevare deres bevaret position i mellemfasen kernen.

konklusioner

Vores data er derfor i overensstemmelse med den model, der hvert kromosom har en tilknyttet postnummer (evt gen tæthed), der bestemmer dets nukleare lokalisering. Hvorvidt den nukleare lokalisering bestemmer eller er bestemt af den transkriptionelle aktivitet af hjemmehørende gener er endnu ikke konstateret

Henvisning:. Sengupta K, Upender MB, Barenboim-Stapleton L, Nguyen QT, Wincovitch SM Sr, Garfield SH, et al. (2007) Kunstigt Indført aneuploid kromosomer Antag et konserveret Position i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 2 (2): e199. doi: 10,1371 /journal.pone.0000199

Academic Redaktør: Beth Sullivan, Duke University, USA

Modtaget: December 13, 2006; Accepteret: 12 januar 2007; Publiceret: 7 februar 2007

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Funding:.. Denne forskning blev støttet af murene forskningsprogrammet for NIH, National Cancer Institute

Konkurrerende interesser : forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kromosomer antager en ikke-tilfældig og bevares position i mellemfasen kernen i højere eukaryoter.. Det menes, at denne lokalisering er korreleret med deres gen densiteter. For eksempel genet rige kromosom 19 er overvejende central, mens genet dårlig kromosom 18 er perifert placeret [1]. Et sådant mønster er konserveret under evolutionen, er vævsspecifik [2], [3], og opretholdes også når disse kromosomer er involveret i translokationer [1]. Omfattende undersøgelser i mus viser også celle typespecifikke, ikke-tilfældige kromosom, der er baseret på både gen tæthed og kromosom størrelse [4]. Tilsammen tyder disse data en funktionel betydning af kromosom positionering. Hverken grundlaget for et sådant arrangement eller arten af ​​dens struktur /funktion forholdet, er endnu ikke afsløret. Det er således fortsat at blive bestemt, hvordan den nukleare fordeling af kromosomer korrelerer med deres transkriptionsaktivitet.

Ikke-arvelige former for tyktarmskræft er defineret af en ikke-tilfældig og strengt bevaret mønster af kromosomale ubalancer. For eksempel kan ekstra kopier af kromosom 7 iagttages som eneste genomiske abnormitet i kolon polypper [5]. Yderligere aneuploidier der resulterer i kopital gevinster på kromosomer og kromosom arme 8Q, 13q og 20, og tab af 8p, 17p, og 18q er sekventielt erhvervet til senere stadier af tyktarmskræft progression, og er trofast vedligeholdes i både metastatiske læsioner og cellelinier afledt af de primære tumorer [5] – [7]. Gennem fremkomsten af ​​globale genekspressionsprofilering metoder såsom microarrays, er det blevet muligt at identificere konsekvenserne af disse bemærkelsesværdigt konserverede kromosomale aneuploidier på kræft transkriptomet. Adskillige nyligt offentliggjorte undersøgelser giver klare beviser for, at genomiske ubalancer i tumorer direkte indflydelse transkriptniveauer [8] – [11]

Vi har tidligere beskrevet etableringen af ​​et unikt modelsystem til systematisk at studere konsekvenserne af aneuploidi på. cellulære transkriptom. Denne model er baseret på indførelse af specifikke kromosomer i karyotypiske stabile immortaliserede celler eller cancerceller hjælp mikrocelle-medieret kromosom overførsel. Som i primære tumorer, en stigning i genomisk kopital resulterede i øget gennemsnitlig transkriptniveauer af gener, der er bosiddende på aneuploide kromosomer. Yderligere blev aneuploidi-induceret transkriptionel deregulering hverken fundet kromosom eller celletypespecifik [12]. Således ikke aneuploidi ikke vises kun at målrette én eller nogle få gener på det berørte kromosom, men resulterer i en massiv deregulering af en stor del af de transkriptionelt aktive gener.

I interfasen kerner af normale og tumorceller de to homologe kromosomer antager en konserveret position, i vid udstrækning korreleret med deres gen densiteter [1], [13]. Dele af kromosomer involveret i translokationer blev også observeret at orientere sig i en sådan måde, at lokalisere deres iboende positioner [1]. Vi var derfor gerne, om en kunstigt indført aneuploid kromosom var også i stand til at finde en position i kernen, der ligner dens endogene homologer. Dette spørgsmål, mens spændende af sig selv, var særlig interessant i betragtning af resultaterne af vores tidligere undersøgelse beskrevet ovenfor [12], hvilket indebar, at de indførte kromosomer var transkriptionelt aktive. Evnen af ​​det indførte kromosomet til at indtage en bestemt 3D placering ville indikere nukleare positionering som en forudsætning for aneuploidi-inducerede stigning i genekspression. Alternativt ville manglende lokalisere deres iboende nukleare rum indebærer, at nukleare positionering af aneuploide kromosomer i kræftcellerne ikke spiller nogen rolle i fastlæggelsen af ​​deres transkriptionsaktivitet.

For at identificere placeringen af ​​aneuploide kromosomer i interfase kerner, vi brugte 3D-FISH, konfokal laser scanning mikroskopi, og 3D afstandsmålinger på DLD-1 forældre- og afledte cellelinjer der bærer ekstra kopier af Kromosomer 7, 18 eller 19. fra et teleologisk perspektiv, disse eksperimenter fremme vores forståelse af samspillet mellem vedligeholdelse af nuklear arkitektur og genom funktion. Dette kan påvirke den måde, vi i øjeblikket mener om behandling af sygdomme, især i aneuploide kræftceller, hvor både genomisk indhold og genekspression har været stærkt urolig.

Resultater

Microcell-medieret kromosom overførsel af Kromosomer 7, 18 og 19

Som tidligere rapporteret, var en enkelt kopi af menneskelige kromosom 7 held indført i den diploide cellelinie DLD-1 og dermed skabe det afledte cellelinje DLD-1 + 7 (figur 1A) [12]. Den ekstra kopi af dette kromosom direkte og væsentligt forøget de gennemsnitlige transkriptniveauer af gener, der er bosiddende på kromosom 7 [12]. Denne stigning var ens efter indføring af Kromosomer 3 og 13 i DLD-1, og blev også observeret, når kromosom 3 blev indført i normale mammaepitelceller [12]. Stigningen i transkriptniveauer er derfor uafhængig af den indførte kromosomet og uafhængigt af celletypen. Med henblik på denne undersøgelse genererede vi yderligere to cellelinier ved indføring Kromosomer 18 eller 19 ind DLD-1 derved skabe de afledte cellelinier DLD-1 + 18 og DLD-1 + 19, (figur 1A). Vi valgte disse kromosomer, fordi de er af tilsvarende DNA-indhold (figur 1B), og fordi deres nukleare positioner er distinkte og bevares: genet rige kromosom 19 er placeret mod det indre af den nukleare plads, hvorimod genet dårlig kromosom 18 er placeret mod nukleare periferi [1]

A:. Skematisk fremstilling af det eksperimentelle design. DLD-1 (parental cellelinie) blev underkastet MMCT til genererede derivat cellelinier DLD-1 + 7, DLD-1 + 18 og DLD-1 + 19. 3D-FISH blev udført på hver af de afledte cellelinjer med sonden kombinationer angivet. B: Tabel viser sammenligninger af DNA-indhold og gen tæthed mellem kromosom 7, 18 og 19.

Den procentdel af celler i en given klon opretholde trisomi for indførte kromosomet, på trods af fortsat udvælgelse, varierede afhængigt af kromosomet overført, og antallet af passager. Således blev kromosom positionering målinger strengt begrænset til DLD-1-afledte celler, som blev trisomic for kunstigt indført kromosom. Mens tidlig passage kloner af DLD-1 + 3, DLD-1 + 7 og DLD-1 + 13 havde en høj procentdel af trisomic celler og var i stand til at opretholde denne frekvens i op til 12 passager, ca. 20% af cellerne i indledende kloner af DLD-1 + 18 og DLD-1 + 19 var trisomic og dette blev yderligere reduceret ved meget tidlige passager.

3D Afstandsmåling af kromosom Territories

Vi uropført tofarvet 3D-FISH på morfologisk bevaret forældrenes DLD-1 kerner som skitseret i figur 1A. Repræsentative maksimale projektioner intensiteten af ​​konfokal billedstakke fra hver af de tre probe kombinationer (18 19, 7 18 og 7 19) er vist i figur 2, panel A-C. For objektivt evaluere kromosom område (CT) positionering og at muliggøre en statistisk sammenligning mellem den parentale cellelinje og dets derivater, blev 3D billed rekonstruktion genereret ved hjælp af softwaren Image-Pro Plus (figur 3). Da vi ønskede at tage i betragtning, at ikke alle kerner er helt sfæriske, vedtog vi en 3D-måling ordning, der svarer til Tanabe et al. ([3] se metoder). Evnen til at opnå disse målinger krævede tilføjelsen af ​​et punkt på periferien af ​​kernen collinear med det geometriske centrum af kernen og det geometriske centrum af kromosomet område (figur 3C).

Repræsentant maksimal intensitet projektion af konfokal billede stakke fra DLD-1 forældre og afledte kerner. A-C: Parental DLD-1 kerner. D: DLD-1 + 7 kerner. E: DLD-1 + 18 kerner. F: DLD-1 + 19 kerner. DAPI: DNA kontrastfarve; CT-7: kromosom 7; CT-18: kromosom 18; CT-19: kromosom 19; Flet: fusioneret billede af DAPI og kromosom territorier

A:. Maksimal projektion af et repræsentativt konfokal billedstak med Kromosom territorier 7 (Rød, Spectrum orange) og 19 (Green, Rhodamin grøn) fra DLD -1 + 19 B: En 3D rekonstruktion af nucleus og kromosom områder fra billedet vist i A (XY orientering). C: En ordning er vedtaget for 3D distance målinger af kromosom områder i Rød (R

1 og R

2) og grøn (G

1, G

2, og G

3) fra det geometriske centrum af kernen (N

c), til den nukleare periferien (N

P). Punkter på nukleare periferi (f.eks. N

pR

1) er udvidelser fra nukleare centrum gennem det geometriske centrum af kromosomet territorium. D:. 3D-rekonstruktion i B vist i X-Z orientering

De resulterende radiale afstandsmålinger blev plottet for hvert kromosom territorium. Som sådan oprindelsen til 0% repræsenterer det geometriske centrum af kernen, mens den nukleare grænse anses 100%. Målinger af CT-18 og CT-19 i DLD-1 kerner viser, at de befinder sig overvejende i en radial afstand på 70-80% (perifer) og 40-50% (central), henholdsvis (figur 4A). Dette bekræftede tidligere bemærkninger om placeringen af ​​kromosomer 18 og 19 i DLD-1 [13], og derved valideret vores eksperimentelle system og analytiske procedurer. Vi efterfølgende udført 3D afstand målinger af mellemliggende størrelse, gen dårlig Kromosom 7 områder. Vores resultater viser, at CT-7 er radialt placeret i en perifer position 70-80% fra midten af ​​kernen (figur 4A). Lignende resultater blev opnået under anvendelse uafhængigt enten MIPAV eller Imaris software (data ikke vist)

radiale afstand måling profiler af kromosom territorier i A:. DLD-1 B: DLD-1 + 7, C: DLD-1 + 18 og D: DLD-1 + 19. X-akse: Radial Distance (%); Y-akse: Frekvens (%); 0 eller oprindelse: midten af ​​kernen; 100%: nukleare periferi; Rød: Kromosom 7; Grøn: kromosom 19; Blå: kromosom 18.

Efter at have fastslået holdninger Kromosomer 7, 18 og 19 territorier i DLD-1, analyserede vi positionen af ​​disse kromosom territorier i kerner af de tre afledte cellelinier (figur 2D -F). I alle tilfælde tofarvet 3D-FISH blev udført i forskellige kombinationer mærkning. Vores analyse af 3D afstandsmålinger for de tre Kromosom 7 territorier i DLD-1 + 7 viste, at de antog en perifer position i kernen i en radial afstand på 70-80%, ligesom i de parentale celler (figur 4B). En sammenligning af de medianværdier af den radiale afstand profiler mellem DLD-1 og DLD-1 + 7 (73,9 og 73,35 henholdsvis) viser, at de er næsten identisk med en afvigelse (Δ

M = -0,55), som ikke var statistisk signifikant som vist ved Mann-Whitney-Wilcoxon test (P = 0,6811) (tabel 1, figur 5)

Rå fordelinger af 3D-afstandsmålinger.. CT-7 i DLD-1 DLD-1 + 7, CT-18 i DLD-1 DLD-1 + 18, CT-19 i DLD-1 DLD-1 + 19. X-akse: cellelinie, Y-akse:. Normaliseret radial afstand (%) af kromosom områder fra det geometriske centrum af kernen

3D afstandsmålinger blev også udført for kromosom 18 i DLD-1 + 18, afslører, at de tre kromosom 18 territorier er anbragt i en radial afstand på 80-90% (figur 2E og 4C). De mediane radiale afstand værdier var sammenlignelige i de forældre og afledte kerner (72,69 og 74,07, henholdsvis; Δ

M = 1,38) og blev bestemt ikke at være signifikant forskellig fra Mann-Whitney-Wilcoxon test (P = 0,7820) (tabel 1, figur 5)

Endelig bestemmes vi den nukleare situation kromosom 19, som var centralt placeret i forældrenes DLD-1 celler.. 3D rekonstruktioner og distance målinger viser, at de tre Kromosom 19 territorier i DLD-1 + 19 blev centralt placeret i kernen i en radial afstand på 50-60%, svarende til deres position i den parentale cellelinje (51,73 og 55,02, henholdsvis) (figurerne 2F og 4D). Igen var forskellen i medianværdier var ikke statistisk signifikant (Δ

M = 3,29, P = 0,2677) (tabel 1, figur 5). Vores undersøgelser viser derfor, at aneuploide kromosomer indføres via mikrocelle-medieret kromosom overførsel antager en konserveret 3D position i kernen ikke skelnes fra deres endogene homologer.

Som nævnt ovenfor, udførte vi tofarvet hybridiseringer med to forskellige kromosom maleri prober i kombinationerne beskrevet i figur 1A. Vi var derfor ikke kun i stand til at vurdere placeringen af ​​de indførte, aneuploide kromosomer, men også for at forespørge, om denne aneuploidi havde nogen indflydelse på den nukleare situationen for andre kromosompar. Efter indførelsen af ​​en ekstra kopi af kromosom 7, observerede vi en tendens til CT-18 og CT-19 at blive flyttet til en mere indvendig position (Δ

M = -5,59 og Δ

M = -3,02, henholdsvis ). Disse skift, men trods meget større end dem, der ses i de andre afledte cellelinjer, nåede ikke en statistisk signifikant niveau (P = 0,0523 og P = 0,0688, henholdsvis) (tabel 1). En mulig forklaring kunne være, at procent distance målinger for CT-18 og CT-19 i DLD-1 + 7 havde en bimodal fordeling og en lempelse af kromosom positionering. Graden af ​​spredning som beregnet ved hjælp af den vejede gennemsnit-Inter kvartil Range (IQR) var 23,84 og 21,08 (for CT-18 og CT-19, henholdsvis) i forhold til 11,90 for kromosom 7 (figur 4B). Indførelsen af ​​kromosom 18 havde ingen effekt på placeringen af ​​de to kromosom 7 områder, som de fortsat på et perifert position på 70-80%, og som sådan median radiale afstand værdier ikke viser et markant skift i position (P = 0,4216) . Imidlertid blev de to kromosom 19 territorier igen forskudt mere centralt med en radial afstand på ca. 40% i forhold til ~55% i DLD-1 kerner (figur 4C). Mann-Whitney-Wilcoxon-testen viste, at Δ

M = -8,19 var statistisk signifikant (P = 0,0307). Sammenligningen af ​​median radial afstand værdier af CT-7 i DLD-1 + 19, men foreslog, at placeringen af ​​dette kromosom blev væsentligt ændret (P = 0,0299) mod periferien (73,90 og 77,52; Δ

M = + 3,62). Desuden blev Kromosom 18 områder betydeligt flyttet til en mere intern position (72,69 og 66,65; Δ

M = -6,04, P = 0,0257)

Diskussion

Den systematiske udforskning af. konsekvenserne af kromosomale aneuploidier på genekspression profiler har vist, at der er en direkte sammenhæng mellem genomiske kopi nummer og transkriptniveauer [8], [10], [14], [15]. For at skabe et modelsystem af kromosomal aneuploidi, anvendte vi mikrocelle-medieret kromosom overførsel til at indføre specifikke kromosomer i karyotypiske stabile celler [12]. Resultaterne bekræftede tidligere observationer i primære tumorer og kræft cellelinjer, der viser en direkte effekt af kromosomal aneuploidi på hjemmehørende genekspression niveauer. Dette tillod os at undersøge forholdet mellem aneuploidi og genekspression uafhængige af andre cytogenetiske abnormaliteter normalt observeret i cancerpatienter genomer. Efter at have konstateret, at den generation af kunstige trisomier resulterede i en betydelig stigning i de gennemsnitlige transcript niveauer af gener på disse aneuploide kromosomer, var vi nu spændt på, om de antager en konserveret position i mellemfasen kernen. Dette er et vigtigt spørgsmål, fordi der er klare beviser at indfødte, endogene pattedyr kromosomer besætte specifikke, konserverede 3D positioner [3]. For eksempel er det gen rige kromosom 19 lokaliseret mere centralt, mens det gen dårlig kromosom 18 territorier er placeret mere hen imod periferien af ​​den [1] kerne. Det er derfor rimeligt at formode en funktionel relevans af denne strukturelle bevaring og, som en forlængelse af det, et forhold mellem 3D arkitektur og transkriptionel aktivitet. Med det formål at afgøre, om den forøgede genekspression korrelerer med placeringen af ​​den indførte kromosomet i dens konserverede nukleare plads (f.eks, indvendig for kromosom 19, og perifer for kromosom 18), udførte vi 3D-FISH på tre afledte cellelinier trisomic for kromosomer 7, 18 eller 19. DNA mismatch reparation deficient coloncancercellelinie DLD-1 blev anvendt som modtager cellelinie. Denne cellelinie, som er andre med mikrosatellit ustabilitet, er karyotypiske stabil og diploide. Dette er fordelagtigt, fordi placeringen af ​​indførte kromosomer kan vurderes uden potentielle forstyrrende effekter fra andre kromosomale afvigelser. Her rapporterer vi, at en kunstigt indført aneuploid kromosom antager en ikke-tilfældig og bevares 3D position i interfase kerne, som svarer til lokaliseringen af ​​sine andre to endogene homologer.

Positionering af kromosom 7, 18 og 19 territorier

Vores analyse af kromosom områder i DLD-1 viste, at CT-18 og CT-19 var overvejende perifer og central henholdsvis dermed bestyrke tidligere observationer i denne cellelinje [13]. Notatet Cremer et al. rapporterede en mindre forskel i den gennemsnitlige radiale afstand mellem CT-18 og CT-19 i DLD-1 kerner (~7.9%) og andre tumor kerner, mens vores analyse viste ~18.4% forskel mellem middelværdierne af den radiale afstand målinger af CT -18 og CT-19. Men begge undersøgelser klart fastslå, at kromosom 19 er placeret mere mod det indre af kernen i forhold til kromosom 18. Vi viser også, at genet dårlig Kromosom 7 er overvejende perifer i DLD-1, yderligere støtte et gen densitet baseret kromosom positionering mønster i både normale og tumor kerner (figur 4A) [13], [16].

det primære formål med denne undersøgelse var at vurdere den relative placering af den kunstigt indført trisomic kromosom i forhold til sine endogene homologer i alle tre de afledte cellelinjer. Vi var imidlertid ikke i stand til at give et robust signal med en neomycin FISH probe, som ville utvetydigt betegne den indførte kromosomet, som er tagget med denne selekterbar markør (data ikke vist). Det var dog ikke en væsentlig hindring, da vores statistiske analyse ikke afslørede væsentlige forskelle mellem lokalisering af nogen af ​​de tre kromosom kopier. For eksempel alle af kromosomet 7 territorier i DLD-1 + 7 antager en relativt perifer position i kernen (figur 4B). Et lignende resultat blev opnået for de 18 (perifere) og 19 (central) kromosom territorier i kerner af deres respektive trisomic cellelinjer (figur 4, paneler C og D). Således synes der at være en vis mekanisme, hvorved de kunstigt indførte trisomic kromosomer lokalisere til deres medfødte konserveret 3D nuklear position.

Endnu uforklarlig opdagelse var den statistisk signifikante, men subtile skift i medianposition af kromosom 19 i DLD-1 + 18 celler (tabel 1). Desuden var den gennemsnitlige radiale afstand mellem CT-18 og CT-19 steg fra 18,4% til 22,69% i disse kerner. Man kunne forestille sig, at ekstra kromosomer besætter perifere stillinger som Kromosomer 7 eller 18 kan forårsage kromosom 19 at antage en endnu mere central placering. Argumenterer imod dette ræsonnement er den kendsgerning, at CT-19 skift i DLD-1 + 7 celler ikke var signifikant (tabel 1). Derudover er der i DLD-1 + 19, CT-7 er forskudt til en mere perifer position, mens CT-18 er forskudt til en betydeligt mere intern position, hvilket resulterer i en mindre forskel i de gennemsnitlige afstande mellem CT-18 og CT-19 ( ~11.37%). , Mens det er forholdsvis let at forstå, at tilsætningen af ​​ekstra kromosom områder i et fysisk begrænset rum såsom cellekernen ville have potentiale til at inducere skift i positioneringen af ​​de andre kromosomer, hvad bestemmer således retningen af ​​dette skift er ikke selv -evident. Det vil være interessant at undersøge, hvordan disse effekter forstærkes i aneuploide kræftceller, der ofte indeholder langt mere end blot den ene numeriske aberration som i vores model-system. Dette kan muligvis være en yderligere faktor i at forklare den enorme kompleksitet af gen deregulering i kræft transkriptomet.

Vi observerede også en bimodal fordeling af kromosom områder, især i de afledte cellelinier (Fig. 4A). For eksempel i en population af DLD-1 kerner (~6-8%), CT-18 indtog en mere intern position som afspejlet i en top ved en radial afstand på -50% fra midten af ​​kernen. Omhyggelig analyse af de rå data indikerer ikke, at dette bimodalitet var en afspejling af et kromosom territorium i hvert kerne opfører forskelligt (fx den indførte kromosomet), men snarere, at i nogle celler alle tre områder var mere central eller perifer i forhold til den gennemsnitlige . Mens den relative position af kromosom 18 og 19 områder er konserveret i en lang række celletyper, kan graden af ​​denne bevarelse variere. For eksempel nogle tumor kerner viste også et fald i den normale radiale fordeling mønster af CT-18 og CT-19 sammenlignet med normale celler. Dette er særligt tydeligt for kerner af den aneuploide coloncancercellelinie SW480, hvor CT-18 og 19 temmelig tæt placeret [13], hvilket antyder, at aneuploidi eller yderligere kromosomale gevinster kan påvirke genet densitet baseret radiale fordeling af kromosomer.

En spekulativ mekanisme af kromosom positionering

det er nu klart fastslået, at placeringen af ​​kromosom områder inden for 3D-rum af interfase kerne er ikke tilfældig. Denne fordeling er konserveret på tværs af forskellige væv, både normale og maligne, samt evolutionært tværs divergerende arter [2], [3]. Eksperimenterne udført i denne undersøgelse nu viser, at denne ikke-tilfældige og konserveret kernelokalisering omfatter også kunstigt indført, aneuploide kromosomer. Således en så høj grad af konservering egner sig til tanken om, at der skal være en vis biologisk konsekvenser for placering af kromosom territorier. Men hvordan er den funktionelle reorganisering af kernen etableret efter reformation af kernen efter mitose? Kan et sådant fænomen forklares mekanistisk

For at gentage fakta:? Kromosomer med en relativt høj gen tæthed indtage en mere central position, mens gen fattige kromosomer tendens til at blive lokaliseret tættere på den nukleare periferien [1]. Det er også sandt, at gen-rige kromosomer har en højere G-C-indhold. Dette kan delvist afspejle tilstedeværelsen af ​​CpG-øer i genpromotorer samt overvægten af ​​G-C-rige repetitive elementer såsom Alu sekvenser, der er sammenfaldende med kodende regioner af genomet. I fibroblaster, for eksempel en forøget farvning af Alu-sekvenser blev fundet i den nukleare indre [17]. Omvendt er den nukleare periferi beriget for heterochromatin, som har en tendens til at være mere A-T rig. Det er velkendt, at nukleare laminer er kritiske for reformation af kernen efter mitose. Laminer har også vist sig at interagere gennem specifikke sekvenser i deres hale domæne med kromatin og især med to af kernehistoner H2A og H2B [18], [19]. En øget forekomst af methylerede histoner, såsom tri-H3K27, er blevet observeret nær den nukleare periferi [20]. Således kan laminer og variationer i nukleosom sammensætning og /eller modifikationer spille en rolle i den ikke-tilfældige placering af visse kromosom områder nær kernemembranen.

Hvilke mulige faktorer kunne være ansvarlig for at etablere de ovennævnte træk ved den nukleare arkitektur, især med hensyn til placeringen af ​​individuelle kromosom områder? Måske den mest intuitive model er en, hvor hvert kromosom er identificeret ved et unikt “zip-kode”, som bestemmer, hvor det vil opholde sig i kernen. Et sådant kendetegn kunne være de unikke sekvenser findes i centromerregionen eller pericentromeric region for hver homolog. Denne hypotese kunne afprøves eksperimentelt ved at flytte disse sekvenser fra et kromosom til et andet. Heldigvis forekommer sådanne begivenheder naturligt via kromosomale translokationer. For eksempel cancercellelinie SW620 indeholder en der (18) t (17; 18), hvor materialet fra genet-rige kromosom 17 er blevet omplantet til centromeren indeholdende genet fattige kromosom 18. Trods indeholdende kromosom 18 centromer, dette derivat kromosom indtager en radial lokalisering svarende til den normale kromosom 17 [13]. Dette studie foreslår derfor, at kromosom specifikke centromerer er ikke den vigtigste faktor for kromosom positionering og peger mere i retning af materialet indeholdt i kromosomet arme.

Et alternativ til en centromer-specifik “zip-kode” sekvens ville være en hvor en temmelig generelt træk af hvert kromosom er ansvarlig for at placere det i, eller udelukke det fra visse nukleare regioner. I en sådan model bliver det bydende nødvendigt at forklare, hvordan funktioner såsom gen densitet, nukleotidsammensætning (G-C versus A-T-indhold), DNA og histon modifikationer eller transkriptionsaktivitet afføles af re-dannende kerne og anvendes til at etablere positionering. Da hver af disse funktioner er til stede i forskellig grad på hver kromosom, placering af områder bliver mere probabilistiske end definitiv. Dette er i overensstemmelse med vores eksperimentelle observationer (figur 4).

Som et eksempel, vi foreslår følgende scenario som en mulig mekanisme for oprettelse interfasen nukleare arkitektur. Ikke-transkriberede, gen-fattige områder af genomet tendens til at være mere heterochromatic, som er overvejende A-T rig. Heterochromatin etableres ved en kombination af DNA og histon modifikationer, der vides at korrelere med transkriptionel inaktivitet. Således er en højere absolut antal eller koncentration af modificerede nukleosomer, fx tri-H3K27, kan gøre det mere sandsynligt for en gen-fattig kromosom, der skal snared af laminer fastgjort til indersiden af ​​den reformerende kernemembranen. Man kunne så postulere, at som standard, unsnared G-C rig, gen rig, transkriptionelt aktive kromosomer ville have en tendens til at blive udelukket fra det nukleare periferien og dermed er løst til at indtage en mere central nuklear position. I denne selvorganiserende system lokaliseringen af ​​gen-rige sekvenser i midten af ​​kernen er ikke så meget drivkraften, men snarere det endelige resultat af nuklear reformation efter mitose. Andre har lagt frem en selvorganiserende model, hvor den kollektive transkriptionsaktivitet af genomet er blevet foreslået at diktere nukleare arkitektur baseret på de fysiske egenskaber af kromatin og interagerende polymeraser [21]. Da det er sandsynligt, at der er meget lidt løbende transkription i mitotisk kondenserede kromosomer, ville vi postulere, at det ikke er aktiv transkription i sig selv, der bestemmer arkitekturen ved nuklear reformation, men snarere markeringerne af tidligere transkriptionelt aktive eller inaktive regioner såsom DNA og histon modifikationer.

Gene rige kromosomer også transskriberet mere aktivt. Genom-dækkende analyse af mRNA-ekspression profiler af det humane genom viser, at gen tætte områder kraftigt korrelere med områder med forøget genekspression (forhøjninger) [22], [23]. Dette ville kræve berigelse eller en gradient af stigende koncentration af transkriptionsfaktorer eller fabrikker mod nukleare centrum, hvor der er mere transkriptionsaktivitet. Det ville være interessant at bestemme, om sådanne gradienter faktisk eksisterer i kernen. Hvis der er en gradient, er det grunden til den ikke-tilfældig fordeling af kromosomer eller er det etableret som reaktion på sådan en nuklear arkitektur? Hvis en gradient ikke findes, er den ensartet koncentration af transkriptionsfaktorer begrænsende i gen-tætte områder af kernen med høj transkriptionsaktivitet? Er de faktorer i den nukleare interiør mere transkriptionelt engageret end mod periferien? Er den højere koncentration af heterochromatin på det nukleare periferien begrænser ikke blot tilgængeligheden af ​​transkriptionsfaktorer til kromatin, men også hæmme deres evne til at krydse det indre af kromosom områder?