PLoS ONE: letalitet af PAK3 og SGK2 shRNAs til humant papillomvirus Positiv livmoderhalskræft celler er uafhængig af PAK3 og SGK2 Knockdown

abstrakt

p21-aktiveret kinase 3 (PAK3) og serum og glucocorticoidinduceret kinase 2 (SGK2) er tidligere foreslået som væsentlige kinaser til human papillomavirus positive (HPV +) livmoderhalskræft celleoverlevelse. Dette blev fastslået ved anvendelse af en shRNA knockdown tilgang. For at validere PAK3 og SGK2 som potentielle mål for HPV + livmoderhalskræft terapi, blev forholdet mellem shRNA-inducerede fænotyper i HPV + livmoderhalskræft celler og PAK3 eller SGK2 knockdown nøje undersøgt. Vi observerede, at fænotyper af HPV + livmoderhalskræft celler induceret af forskellige PAK3 og SGK2 shRNAs ikke kunne reddes af komplement ekspression af respektive cDNA-konstruktioner. Knockout-deficient PAK3 shRNA med en enkelt fejlparring var tilstrækkelig til at inhibere HeLa cellevækst i et tilsvarende omfang som vildtype PAK3 shRNA. HPV + cervicale cancerceller var også modtagelige for flere ikke-humane target shRNAs. Forskellen mellem PAK3 og SGK2 shRNA-induceret apoptose og genekspression knockdown, samt celledød stimulation, foreslået, at disse shRNAs dræbt HeLa celler gennem forskellige veje, som måske ikke er målspecifik. Disse data viste, at HPV + livmoderhalskræft celledød ikke var forbundet med RNAi-induceret PAK3 og SGK2 knockdown men sandsynligvis igennem off-target effekter

Henvisning:. Zhou N, Ding B, Agler M, Cockett M, McPhee F (2015) letalitet af PAK3 og SGK2 shRNAs til humant papillomvirus Positiv livmoderhalskræft celler er uafhængig af PAK3 og SGK2 Knockdown. PLoS ONE 10 (1): e0117357. doi: 10,1371 /journal.pone.0117357

Academic Redaktør: Xuefeng Liu, Georgetown University, UNITED STATES

Modtaget: 23. oktober 2014 Accepteret: December 22, 2014; Udgivet: 23 Jan 2015

Copyright: © 2015 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Finansiering af denne undersøgelse var fra Bristol-Myers Squibb. BMS ydet støtte i form af lønninger til forfattere [NZ, BD, MA, MC og FM], men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion. Da Michele Agler blev en medarbejder i Boehringer Ingleheim, har de givet støtte i form af en løn for hende, men havde ikke nogen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser: forfatterne har følgende interesser: Alle forfatterne af denne manuskript er eller var medarbejdere i Bristol-Myers Squibb Company (BMS) på det tidspunkt den beskrevne arbejde blev udført, og en forfatter (Michele Agler) er nu en Boehringer Ingleheim (BI) medarbejder. Finansiering af denne undersøgelse var fra Bristol-Myers Squibb. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Humane papillomavirus (HPV’er) er små DNA tumor virus, der inficerer kutan eller slimhinder epitelceller [1 ]. Til dato har 170 HPV-typer blevet fuldstændigt karakteriseret, og cirka 40 typer inficere kønsorganerne [2]. De genitale HPV-typer er seksuelt overførte og kan yderligere opdeles i lav risiko og høj-risiko grupper efter tilbøjeligheden af ​​deres inducerede læsioner at gå videre til malignitet. Vedvarende højrisiko human papillomavirus (HPV) infektion er den vigtigste årsag til livmoderhalskræft. Når integreres i værtsgenomet, HPV-typer med høj risiko udøver deres onkogene virkninger primært gennem den kontinuerlige ekspression af oncoproteiner E6 og E7 [3]. Mange aktiviteter er blevet beskrevet for begge disse oncoproteiner, blandt hvilke følgende er bedst karakteriseret og kritiske til transformation: E6 binder til E6-associeret protein (E6-AP), hvilket resulterer i ubiquitinering og nedbrydning af tumorsuppressorprotein p53; E7 binder til lommen protein familiemedlemmer, navnlig retinoblastomproteinet (Rb) forårsager inaktivering og nedbrydning af Rb [4]. Interaktioner mellem højrisiko HPV oncoproteiner og endogene cellulære proteiner er blevet vist at udløse cellecyklus deregulering og apoptose, og en efterfølgende stigning i replikationen af ​​transformerede celler, der udvikler sig til cancer [5].

RNA-interferens (RNAi ) er blevet en meget anvendt værktøj til funktionelle genomiske studier i hvirveldyr og hvirvelløse dyr [6]. RNAi fungerer ved silencing et gen gennem homolog lille interfererende dobbeltstrengede RNA’er (siRNA’er), som udløser ødelæggelse af tilsvarende messenger-RNA (mRNA) ved RNA-inducerede silencing kompleks (RISC) [7]. Den lethed, hastighed og omkostningseffektivitet har gjort det den foretrukne metode for tab-af-genfunktion undersøgelser. For nylig blev high-throughput RNAi skærme bruges til at udforske forskellene i kinase krav til spredning og overlevelse blandt forskellige cancerceller [8-10]. Et fælles sæt kinaser blev observeret som værende nødvendig for proliferation /overlevelse tre cervikale carcinoma cellelinier (CaSki, HeLa og SiHa) men undværlig for primære humane forhudskeratinocytter (HFKs). Det blev foreslået, at p21-aktiveret kinase 3 (PAK3) og serum og glukokortikoid-induceret kinase 2 (SGK2) var afgørende for HPV positive (HPV +) livmoderhalskræft celle overlevelse. Letaliteten forårsaget af SGK2 eller PAK3 udtynding i HPV E6 udtrykkende celler var en følge af p53-inaktivering [10].

PAK proteiner er serin /threoninkinaser og opdelt i to grupper. Gruppe I Paks omfatter PAK1 gennem 3; disse kinaser binde til og katalytisk aktiveret af Rac og Cdc42 GTPaser [11, 12]. PAK3 er rigeligt udtrykt i centralnervesystemet (CNS), og er specifikt impliceret i neuronal plasticitet og spinogenesis [13]. PAK3 også regulerer cellecyklusprogression, neuronal migration og apoptose [13-16]. Tab af funktion af PAK3 er ansvarlig for X-bundet ikke-syndromisk mental retardering [17, 18]. Den SGK familie af kinaser omfatter SGK1 gennem 3; SGK2 er den mest dårligt undersøgte medlem af denne familie. I modsætning SGK1 er SGK2 mRNA ikke fremkaldt ved stimulation med serum eller glukokortikoider, og er kun til stede på signifikante niveauer i lever, nyre og bugspytkirtel og på lavere niveauer i hjernen [19]. Imidlertid ligner SGK1 og 3, SGK2 aktiverer, også visse kalium- og natriumkanaler, hvilket antyder en involvering i reguleringen af ​​processer såsom celleoverlevelse, neuronexcitabilitet og renal natrium udskillelse [20, 21].

Specifik udslettelse af livmoderhalskræft celler ville være af væsentlig interesse for anti-cancer forskersamfund. For at bekræfte, at blokering funktion SGK2 eller PAK3 af en p53-afhængige vej er forbundet med HPV + cellereduktion, passende kontroller er vigtige når du bruger en RNAi tilgang. Target specificitet har været en kilde til bekymring, siden den første anvendelse af RNAi til funktionel genomik. Ikke-specifikke virkninger er blevet rapporteret, at der ud over de målrettede gener, ført til ændringer i ekspressionen af ​​andre gener i begge niveauer mRNA og protein [22-24]. Derudover er der observeret induktion af gener involveret i interferon respons maskiner [25-28], yderligere udfordrende pålideligheden af ​​RNAi i tab-af-funktion-studier. I denne undersøgelse viser vi, at de fænotyper af HPV + livmoderhalskræft celler induceret af PAK3 eller SGK2 shRNAs ikke kunne reddes af komplement ekspression af respektive cDNA-konstruktioner. HPV + cervicale cancerceller er også modtagelige for flere ikke-humane target shRNAs. Disse data viser, at tabet af levedygtige HPV + livmoderhalskræft celler ikke korrelerer med RNAi-induceret PAK3 og SGK2 knockdown, som tidligere rapporteret [10].

Materialer og metoder

Celler

HeLa (ATCC CCL-2) og CaSki (ATCC CRL-1550) celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 1% penicillin-streptomycin og 10% foster bovin serum.

plasmider

Glycerol lagre af bakterier eller plasmider indeholdende PAK3, SGK2 og kontrol (Luciferase, EGFP, Turbo-GFP og ikke-mål) Mission shRNA lentivirus vektorer (tabel 1) blev købt fra Sigma (St. Louis, MO). De PAK3and SGK2shRNA ekspressionskassetterne i en lentivirus rygrad blev karakteriseret og tidligere valideret af RNAi Consortium (TRC, Broad Institute, Cambridge, MA). Plasmider blev oprenset ved anvendelse af Endo-free Maxi plasmid kit (Qiagene, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol. Den doxycyclin (dox) -inducerbare pLKO-Tet-On-plasmidet var en gave fra Dr. Susan Wee [29]. ShRNA sekvenser fra Mission shRNA lentivirus vektorer (tabel 1) blev indsat mellem Agel /EcoRI steder i pLKO-Tet-On bruge standard kloning teknologi.

For at konstruere en knockdown-mangelfuld kontrol PAK3 shRNA , et udvalg af shRNA 3245 mutanter med forskellige uoverensstemmende nukleotider til målet mRNA blev designet og klonet til pLKO-Tet-On vektor. Efter kvantificere faldet i PAK3 mRNA kopi nummer af disse misforholdet shRNAs blev en knockdown-mangel PAK3 shRNA (shRNA 3245 m15) med en enkelt misforhold ved position 15 (CCAAACTTCCAACAgAACA) identificeret.

Ultimate ORF menneskelige kloner til PAK3 (NCBI referencesekvens: NM_002578.3), og SGK2 varianter 1 og 2 (NM_170693.1 og NM_016276.3) blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA). ORF sekvenser af PAK3 og SGK2 blev indført i ekspressionsvektoren pcDNA3.2-Dest hjælp Gateway teknologi (Invitrogen). For MOB eksperimenter blev PAK3 og SGK2 mutant-udtrykkende plasmider konstrueret huser 4 til 5 tavse mutationer i shRNA komplementære sekvenser. Mutationer blev indført i pcDNA-PAK3 hjælp af QuikChange site-directed mutagenese kittet (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og de følgende primerpar: pPAK-3244mut 5′-GATAGCTACTTGGTGGGTGACGAGTTGTGGGTAGTCATGGA ATACTT-3 ‘og 5′-AAGTATTCCATGACTACCCACAACTCGTCACCCACCAAGT AGCTATC-3; pPAK3-3245mut 5’-GGCACGATTACTCCA AACCAGCAATATAACA AAATTGGAACAG-3 ‘og 5′-CTGTTCCAATTTTGTTAT ATTGCTGGTTTGGAGT AATCGTGCC-3; pPAK3-5142mut 5’-GTTGATATCTGGTCTCTTGGCATCATGGCC ATCGAAATGGTGGAAGGTGAACC-3 ‘og 5′-GGTTCACCTTCCACCATTTCGAT GGCCATGATGCCAAGAGACCAGATATCAAC-3’. Mutationer blev indført i pcDNA-SGK2 anvendelse af følgende primerpar: pSGK2-2111mut 5′-GTAGAGCCTGA AGACACCACCAGCACCTTCTGTGGTACCCCTGA GT-3 ‘og 5′-ACTCAGGGGTA CCACAGAAGGTGCTGGTGGTGTCTTCAGGCTCT AC-3′; pSGK2-2112mut 5’-CA TTGGCTACCTGCACT CCTTGAATATTATTTACAG GGATCTGAAACC-3 ‘og 5′-GGTTTCAGATCCCTGTAAATAATGTTAAGTGAGTGCAGGTAGCCAATGGCG-3’. Disse plasmider blev bekræftet som værende refraktære over for PAK3 eller SGK2 shRNA knockdown hjælp qPCR for mRNA kvantificering og vestlige immunoblot for protein kvantificering.

lentivirus produktion

Rekombinante lentivirus blev produceret ved cotransfektion Lenti-X 293T-celler (Clontech, Mountain View, CA) med shRNA lentivirus vektor, emballering plasmid og VSV-G udtrykker plasmid. Kort fortalt, 3 × 10

6 Lenti-X-celler blev podet i en 10 cm skål forud for transfektion. For hver 10 cm skål, 3 ug shRNA-lentivirus plasmid, 2,7 ug pCMVΔ8.9 (pakning plasmid) og 0,3 ug pVSV-G blev blandet med transit-293 reagens (Mirus Bio, Madison, WI) i Opti-MEM og inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter. Transfektionsblandingen blev tilsat til cellerne og inkuberet natten over. Mediet blev aspireret, og frisk medium tilsat for at støtte virusvækst. Kulturmediet indeholdende infektiøs lentivirus blev opsamlet 48 timer efter transfektion centrifugeret for at fjerne cellerester, og filtreret gennem et 0,45 um filtrering enhed. Virus blev titreret med en p24-assay kit (Perkin Elmer, Waltham, MA) og puromycinselektion metode anbefales af Sigma (www.sigmaaldrich.com). Virale titere af ~ 3 × 10

7 CFU /ml blev opnået ved anvendelse af denne fremgangsmåde; virusudbytte var ens, uanset input shRNA ekspressionsvektorer.

Cellelevedygtighed /proliferationsassay

Celler blev podet i plader med 96 brønde ved 2000 celler /brønd i 100 pi medium før virusinfektion. Den infektiøse shRNA lentivirus blev fortyndet i medium indeholdende 10 ug /ml polybren. Medium blev fjernet fra cellerne, og serielle fortyndinger af 100 pi lentivirus blev tilsat til hver brønd. Efter 24 timer blev virus fjernet og erstattet med 100 pi frisk medium. Til forsøg under anvendelse af inducerbare shRNAs, frisk medium indeholdende 20 ng /ml doxycyclin blev tilsat. Cellelevedygtighed blev målt 5 dage efter infektion under anvendelse af CellTiter-Blå reagens (Promega, Madison, WI). Den CellTiter-Blå reagens blev fortyndet i et forhold på 1: 4 i medium, og 20 pi af den fortyndede reagens blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 2 timer før optagelse fluorescens (531

Ex /595

Em) på en Envision 2104 multilabel reader (Perkin Elmer, Waltham, MA). Levende celler blev talt under anvendelse af et Guava ViaCount assay som beskrevet i producentens protokol (EMD Millipore, Billerica, MA).

Cell apoptose assay

Seeding og infektion af celler blev udført som beskrevet for celleproliferationsassay bortset fra, at 80 pi medium /brønd blev tilsat efter virus blev kasseret. En apoptose blev udført 72 timer efter infektion under anvendelse af en caspase 3/7 glo (Promega, Madison, WI). Kort fortalt blev substratet af caspase 3/7 fortyndet i lysisbuffer og 20 pi af den fortyndede substrat blev tilsat til hver brønd. Pladen blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time, og luminescens signal aflæst på en Envision multi-etiketlæser.

Cell autofagi assay

HeLa-celler blev inficeret med seriefortyndet lentiviral SGK2 shRNA samt som med en kontrol ikke-mål (NT) shRNA (tabel 1). Virus blev fjernet efter 24 timers infektion og celler blev dyrket i yderligere 48 timer. Rapamycin (1 uM, EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) blev inkluderet som en kontrol på hver plade og tilføjet 24 timer før pladerne blev behandlet for billeddannelse. Celleplader blev fikseret ved tilsætning af 20 pi fiksering puffer [(4% volumen /volumen formaldehyd i Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS)] direkte til assayet medium og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af 2 vaske med DPBS. cellerne blev immunfarvet for induktion af autophagy ved permeabilisering i 10 minutter med 0,1% Triton X-100 i en 1% bovint serumalbumin (BSA) /DPBS buffer. en blokering buffer på 5% føtalt bovint serum (FBS) i DPBS blev anvendt under antistofinkubationer som bestod af en LC3B primært antistof (cellesignalering Technologies, Danvers, MA) efterfulgt af en Alexa 488-konjugeret sekundært antistof (Invitrogen, Carlsbad, CA). kernen blev farvet med Hoescht dye (Invitrogen, Carlsbad , CA) og actin blev farvet med Alexa 647-phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) for at identificere cellen.

Billeder blev erhvervet på konfokal Opera High Content Imager (Perkin Elmer, Watham, MA). En 20x vand nedsænkning objektiv (20x water_Lucplfln NA = 0,7), blev anvendt med en 488 diodelaser (excitation filter: λ = 520 nm, 75 nm bandpass), et ikke-konfokalt UV-lyskilde (excitationsfilter λ = 450 nm, 50 nm bandpass) og en 640 diode laser (excitation filter: λ = 690, 50 nm bandpass). For hver eksperimentel betingelse, 12 felter /brønd (~ 1200 celler) blev erhvervet og analyseret ved anvendelse af en modificeret Acapella (Perkin Elmer) algoritmen måle intensiteten af ​​LC3B farvning i cytoplasmaet område normaliseret på en per celle basis.

fænotype redning

celler blev podet ved 2 × 10

5 celler /brønd i 6-brønds plader dagen før transfektion. Disse celler blev transficeret med seriefortyndet PAK3 eller SGK2 mutant eller vildtype-udtrykkende plasmider ved anvendelse Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) som et transfektionsreagens. Efter 6 timer blev transfektionsmediet fjernet. Celler blev inficeret med shRNA-udtrykkende lentivirus (1 ml), der var blevet fortyndet 1:10 eller 1:15 i medium indeholdende 10 ug /ml polybren og derefter inkuberet ved 37 ° C natten over. Celler blev trypsinbehandlet og talt og podet ved 2000 celler /brønd i plader med 96 brønde. Til assays overvågning apoptose og cellelevedygtighed blev celler høstet ved 72 timer og 5 dage efter infektion, henholdsvis ved hjælp af de ovennævnte fremgangsmåder.

Kvantificering af PAK3 og SGK2 mRNA’er

Celler blev podet ved 2 × 10

5 celler /brønd i 6-brønds plader dagen før infektion med shRNA-udtrykkende lentivirus. Infektionen eller transfektion /infektion blev udført som tidligere beskrevet. Totalt RNA blev ekstraheret fra celler 72 timer efter infektion under anvendelse af RNeasy Plus Mini Kit plus DNase I-fordøjelse (Qiagen, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol. Ekstraheret total RNA (2-5 ug) blev revers-transcriberet i et totalt volumen på 20 pi ved anvendelse SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA). Resulterende cDNA blev lagret ved -20 ° C indtil anvendelse. PAK3 (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay ID: Hs00176828_m1) og SGK2 (ID: Hs00367636_m1) assays blev udført for at kvantificere mRNA under anvendelse af en 9700HT Real-time PCR-system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). GAPDH mRNA blev også målt på samme brønd at standardisere prøvepåsætning.

Kvantificering af PAK3 og SGK2 proteiner

Protein niveauer blev bestemt ud fra de samme transfektions- og infektionsforsøg bruges til at kvantificere mRNA knockdown. Celler blev høstet 72 timer efter infektion, vasket en gang med phosphatbufret saltvand (PBS), og lyseret i lysisbuffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Igegel CA-630, 0,25% natriumdeoxycholat 10% glycerol, 25 mM NaF, 10 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM natriumvanadat, 1 tablet /50 ml proteaseinhibitor) på is i 30 minutter. Lysater blev klaret ved centrifugering (15.000 rpm) ved 4 ° C i 10 minutter. Totalt protein, 80 ug, blev blandet med en påsætningsbuffer og koges ved 100 ° C i 10 minutter. Prøverne blev udsat for en 4-15% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter elektroforetisk overført til PVDF-membraner. Efter ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret med 5% fedtfri mælk blev membranen inkuberet med primære antistoffer (1: 1000 fortynding; anti-humant PAK3 monoklonalt antistof N-19 og anti-humant SGK2 monoklonalt antistof 3Q-2, Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA) ved 4 ° C natten over. Membranen blev vasket tre gange og inkuberet med det respektive sekundære antistof i 1 time ved stuetemperatur. De immunreaktive bånd blev visualiseret med den forøget kemiluminescens (ECL) reagens ifølge producentens anvisninger. Protein lastning blev standardiseret ved at inkludere GAPDH protein som en kontrol.

Resultater

RNAi reducerer PAK3 og SGK2 udtryk

For at validere effekten af ​​PAK3 shRNA på PAK3 udtryk, fire uafhængige PAK3 shRNAs blev anvendt til målretning forskellige regioner i PAK3 mRNA. HeLa-celler blev inficeret med lentivirus huser de respektive PAK3 shRNAs. Som et særligt kontrol- blev lentivirus huser en NT shRNA ansat. Effektiviteten af ​​lentivirus-infektion blev optimeret ved hjælp af en Turbo-GFP udtryk lentivirus vektor; en infektion på 90% blev opnået. En væsentlig knockdown af PAK3 mRNA blev observeret i HeLa-celler efter infektion med hver af de testede shRNAs (fig. 1A) fire. Lignende resultater blev også observeret, når der anvendes inducerbare lentivirus udtrykker PAK3 shRNAs i CaSki-celler (data ikke vist). Da PAK3 proteinet udtrykkes i meget lave niveauer i HeLa og CaSki-celler, og vandrer med Pak2, som også kan detekteres af N-19 PAK3 antistof (se Materialer og fremgangsmåder), blev PAK3 protein knockdown undersøgt i en PAK3 høj ekspression lille lungecellecarcinoma celle, DMS-79. Alle de testede PAK3 shRNAs faldt betydeligt både PAK3 mRNA og protein niveauer i DMS-79-celler (fig. 1B og C).

mRNA-niveauer blev bestemt ved kvantitativ omvendt transkription PCR-analyse efter 72 timer efter infektion med respektive shRNA vektorer; kontrol betegner infektion med en vektor, der koder ikke-mål shRNA. Hver søjle på søjlediagrammet repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse af 4 replikater fra en af ​​tre uafhængige forsøg med lignende resultater. mRNA niveauer blev normaliseret med GAPDH udtryk; PAK3 og SGK2 proteinekspression blev bestemt 72 timer efter infektion under anvendelse af et Western immunoblot. GAPDH protein fungerede som et protein loading kontrol for hver prøve. (A) PAK3 shRNA faldt PAK3 mRNA-niveauer i HeLa-celler; (B) PAK3 shRNAs reducerede PAK3 mRNA-ekspression i DMS-79 celler; (C) PAK3 shRNAs reduceret PAK3 proteinekspression i DMS-79-celler. DMS-79 cellelysater blev analyseret med PAK3 monoklonalt antistof N-19; (D) SGK2 shRNAs reduceret SGK2 mRNA-niveauer i HeLa-celler; (E) SGK2 shRNAs reducerede SGK2 mRNA-niveauer i GTL16 celler; (F) SGK2 shRNAs reducerede SGK2 protein niveauer i GTL16 celler. GTL16 cellelysater blev analyseret med SGK2 monoklonalt antistof 3K-2.

Lignende eksperimenter blev udført for at validere SGK2 shRNAs. SGK2 mRNA-ekspression i HeLa-celler blev dramatisk reduceret med de fire SGK2 shRNAs (fig. 1D) som var SGK2 mRNA-ekspression i CaSki-celler ved inducerbar SGK2 shRNAs (data ikke vist). Som med PAK3, SGK2 proteinekspression er for lav til at blive detekteret i HeLa og CaSki-celler. Knockdown af SGK2 protein blev derfor evalueret i GTL16, en SGK2 høj ekspression gastrisk carcinom cellelinie. SGK2 shRNAs signifikant reduceret SGK2 mRNA samt proteinekspression i GTL16 celler (fig. 1E og 1F). Således blev knockdown af PAK3 og SGK2 ved deres tilsvarende shRNAs verificeret.

fænotyper induceret af PAK3 og SGK2 lentiviral shRNAs

HeLa celler blev inficeret med PAK3 og SGK2 shRNA udtrykkende lentivira til at bestemme shRNA-induceret fænotyper. CaSki celler blev inficeret med inducerbare PAK3 og SGK2 shRNA udtrykker lentivirus. NT shRNA og et lentivirus vektor indeholdende ingen shRNA ekspressionskassette blev anvendt som kontroller. For fænotypen undersøgelse blev lentivirus infektion med og uden centrifugering sammenlignet. Selv bedre infektionseffektivitet kan opnås ved spin-inokulering med den samme mængde virus, toksiciteten forbundet med NT shRNA og endda ingen shRNA virus kontrol steg proportionalt (data ikke vist). Derfor celler blev inficeret uden centrifugering. Celler blev delt i forskellige plader 24 timer efter infektion for caspase 3/7 og celleproliferation /levedygtighed assays. Et tidsforløb for caspase 3/7 ekspression induceret af de forskellige PAK3 shRNAs angivet topekspression 72 timer efter infektion (figur 2A;. Tidsforløb data ikke vist). Både PAK3 og SGK2 shRNAs reduceret HeLa og CaSki cellelevedygtighed (fig. 2B og 2D, data ikke vist for CaSki-celler) som tidligere beskrevet [10]. De fire PAK3 shRNAs varierede i deres evne til at inducere HeLa celle apoptose (fig. 2A). The shRNA, 3244, var den mest potente at udløse apoptose, hvorimod shRNA 3245 viste marginal induktion af apoptose, trods dets evne til kraftigt at undertrykke PAK3 mRNA i HeLa-celler (fig. 1A). Desuden shRNA 3245 inhiberede celleproliferation /levedygtighed i lighed med den stærkeste apoptoseinducer, shRNA 3244 (fig. 2A og 2B), hvilket indikerer, at de forskellige PAK3 shRNAs inducerede forskellige veje, der fører til celledød. Forskellen mellem apoptose induktion og genekspression knockdown, samt celledød stimulering, blev også observeret med SGK2 shRNA 2112 (fig. 2C og 2D).

(A) HeLa-celler blev inficeret med PAK3 shRNA ved en 1:10 fortynding. Celle apoptose blev bestemt ved anvendelse af en caspase 3/7 glo luciferaseanalyse 72 timer efter infektion. Søjlediagrammet viser fold ændringer af caspase 3/7 aktivitet (luminescens) induceret af forskellige shRNAs sammenlignet med en no-shRNA kontrol. Dataene repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse af 4 replikater fra et af to separate forsøg med lignende resultater; (B) Inhibition af proliferation /levedygtighed HeLa-celler ved PAK3 shRNAs blev vurderet ved anvendelse af et CellTiter blue assay 5 dage efter infektion. Søjlediagrammet viser levedygtigheden procent (fluorescens) af lentivirale shRNA-inficerede celler sammenlignet med en kontrolgruppe lentivirus uden shRNA ekspression. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg; (C) SGK2 lentivirale shRNAs induceret HeLa celle apoptose. Data repræsenterer 4 replikater fra et af to separate forsøg med lignende resultater; (D) SGK2 shRNAs hæmmede proliferation /levedygtighed HeLa-celler. Dataene repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse for to uafhængige forsøg; (E) SGK2 lentiviral shRNAs induceret autofagi af HeLa-celler. Celler blev inficeret med SGK2 lentiviral shRNAs på 1:16 og 1:32 fortynding hhv. 1 pM Rapamycin blev inkluderet som en autophagy kontrol på hver plade. Celleplader blev fikseret 72 timer efter infektion og immunfarvet for induktion af autophagy med en LC3B primært antistof, efterfulgt med en Alexa 488-konjugeret sekundært antistof. Billeder blev taget med den konfokale Opera High Content Imager. Billeder af SGK2 lentiviral shRNA-inficerede HeLa-celler (~ 1200 celler /brønd) blev taget til fange og celletal talt. Den gennemsnitlige intensitet LC3B farvning per celle blev målt og beregnet ved anvendelse af en modificeret Capella (Perkin Elmer) algoritmen. Søjlediagrammet viser den gennemsnitlige ± standardafvigelse af LC3B farvningsintensitet stammer fra to brønde.

Autophagy er en af ​​de vigtigste mekanismer til at opretholde cellulær homeostase og er ikke direkte forbundet med celledød, snarere en selvstændig -cannibalisation vej [30]; Patel et al., 2012). Alle testede i vores eksperimenter shRNAs, herunder fire SGK2 shRNAs og kontrollen shRNA (NT shRNA), inducerede autophagic markør LC3B konvertering sammenlignet med ingen infektionskontrol (fig. 2E). De tre SGK2 shRNAs hver vist en stærkere evne til at inducere autofagi i HeLa-celler end NT shRNA mens en (shRNA2112) opførte sig på lignende måde som NT shRNA. SGK2 shRNA-induceret autophagy markør (udtryk for LC3B) korrelerede ikke med nedgangen i celle nummer (sammenlign fig. 2E med 2D), også tyder på, at de forskellige SGK2 shRNAs medieret forskellige veje, der fører til celledød.

PAK3 knockdown-mangelfuld shRNA hæmning af HeLa cellevækst

for yderligere at afklare, om PAK3 shRNA-induceret HPV + celledød var forbundet med PAK3 knockdown, en PAK3 knockdown-mangelfuld shRNA med en enkelt misforhold til PAK3 mRNA blev testet for dens evne til at inducere celledød i HeLa og CaSki-celler. Tilsætning af doxycyclin til NT shRNA-inficerede HeLa-celler ikke faldt PAK3 mRNA-ekspression eller påvirker cellevækst (fig. 3). Et signifikant fald i PAK3 mRNA niveauer ved doxycyclin-induceret ekspression af shRNA 3245 blev observeret, mens PAK3 mRNA ikke var påvirket af doxycyclin-induceret ekspression af shRNA 3245 M15 (fig. 3A). Både vildtype og mutant PAK3 shRNAs inhiberede dramatisk HeLa-celleproliferation /levedygtighed tilsvarende (fig. 3B), hvilket antyder, at HeLa celledød induceret af PAK3 shRNA ikke er forbundet med PAK3 knockdown. Et lignende resultat blev også observeret med CaSki-cellelinien (data ikke vist).

PAK3 mRNA-niveauer blev bestemt ved kvantitativ omvendt transkription PCR-analyse efter 72 timer efter infektion med de respektive shRNA virus. Levende celletal blev talt 5 dage efter tilsætningen af ​​20 ng /ml doxycyclin. Søjlediagrammet viser den gennemsnitlige ± standardafvigelse for 3 replikater fra en af ​​to uafhængige forsøg med lignende resultater. PAK3 mRNA niveauer blev normaliseret med GAPDH udtryk; (A) Effekt af vildtype (3245) og mutant PAK3 shRNA 3245 (3245 m15) på PAK3 mRNA-niveauer i HeLa-celler; (B) Effekt af vildtype (3245) og mutant PAK3 shRNA 3245 (3245 m15) på HeLa cellevækst.

shRNAs der ikke er målrettet menneskelige gener også hæmme proliferation /levedygtighed HPV + livmoderhalskræft celler

for at afgøre, om HPV + livmoderhalskræft celler er specielt sårbare over for PAK3 og SGK2 shRNAs, undersøgte vi fire kontrol lentivirus shRNA vektorer, der ikke er målrettet de menneskelige gener (Luc, EGFP, T-GFP og NT shRNAs, se tabel 1) for deres effekt på celledelingen /levedygtighed HeLa og CaSki celler. Nr knockdown af PAK3 og SGK2 mRNA-ekspression ved kontrol shRNAs blev observeret (data ikke vist). Hvert virus blev titreret at kvantificere dens evne til at inducere inhibering af HeLa og CaSki-celleproliferation /levedygtighed. PAK3 og SGK2 shRNAs blev også inkluderet i undersøgelsen til sammenligning. Tre af kontrol shRNAs, undtagen NT shRNA, undertrykte HeLa cellevækst med potenser sammenlignes med PAK3 og SGK2 shRNAs (fig. 4A). To kontrol shRNAs (Luc og EGFP shRNAs) induceret vækst hæmning af CaSki (fig. 4B). Endvidere blev HeLa og CaSki levedygtighed celletab observeret ved anvendelse af Luc og EGFP shRNAs i en dox-inducerbar shRNA ekspressionsvektor (data ikke vist). Således blev HeLa og CaSki-celler vist at være modtagelige for shRNAs der ikke er målrettet menneskelige gener, hvilket antyder, at vækstinhibering af disse celler kan induceres ved shRNAs gennem ikke-specifikt gen pathways.

Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse en CellTiter Blå assay 5 dage efter infektion. Hver af vira blev titreret for infektion til at bestemme dens styrke til at inducere HeLa-celleproliferation /levedygtighed inhibering. levedygtighed procent celle (fluorescens) i nærvær af lentiviral shRNAs blev beregnet ved at sammenligne med en kontrolgruppe lentivirus uden shRNA ekspression. Dataene repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse af 4 replikater fra en af ​​tre uafhængige forsøg med lignende resultater; (A) Inhibering af HeLa-celleproliferation /levedygtighed; (B) Hæmning af proliferation /levedygtighed CaSki celler.

fænotyper induceret af PAK3 og SGK2 shRNAs kunne ikke reddes med de tilsvarende transgene udtryk

Der er iboende grænser for specificitet af RNAi, såsom dobbelt-strenget RNA-induceret interferon respons og off-target effekter som følge af ufuldkommen hybridisering, når en shRNA fungerer som en miRNA. En ideel eksperiment skal vise, at udtryk for en muteret version af den målrettede gen ikke er anerkendt af shRNA vender eller redder fænotype. Som et første skridt blev PAK3 udtryk karakteriseret i HeLa-celler. Fire PAK3 splejsningsvarianter findes i pattedyr [31]. Alle varianterne er udtrykt i hjernen henviser i visse væv, såsom nyre og lever, er kun PAK3 variant A udtrykt [31]. Ved anvendelse af variant-specifikke RT-PCR-fremgangsmåden beskrevet tidligere [31], bekræftede vi, at kun variant A udtrykkes i HeLa-celler (fig. 5A). CDNA kodende region af PAK3 fra HeLa-celler er identisk med GenBank-sekvensen NM_002578. Med hensyn til SGK2, dens udtryk i HeLa-celler var for lav til at være præget; derfor blev ekspressionsplasmider for de to indberettede SGK2 varianter anvendes til redning undersøgelse [19].