PLoS ONE: y-Stråling Fremmer Immunologisk Anerkendelse af kræftceller gennem Øget ekspression af kræft-Testikel Antigener in vitro og in vivo

Abstrakt

Baggrund

γ-stråling er en effektiv behandling for kræft. Der er beviser for, at strålebehandling understøtter tumor-specifik immunitet. Det blev beskrevet, at bestråling inducerer de novo-proteinsyntese og forøger antigenpræsentation, undersøgte vi derfor, om γ-stråling resulterer i øget ekspression af cancer-testis (CT) antigener og MHC-I, således at en effektiv immunologisk kontrol. Dette er relevant, fordi ekspressionen af ​​CT-antigener og MHC-I på tumorceller er ofte heterogene. Vi fandt, at de forandringer som følge af γ-stråling fremme immunologiske genkendelse af tumoren, som er illustreret ved den forøgede infiltration med lymfocytter efter strålebehandling.

Methods /Resultater

Vi sammenlignede ekspressionen af CT-antigener og MHC-i i forskellige cancer cellelinjer og friske biopsier før og efter

in vitro

bestråling (20 Gy). Desuden vi sammenlignede parret biopsier, der blev taget før og efter strålebehandling fra sarkom patienter. For at undersøge om den ændrede ekspression af CT-antigener og MHC-I er specifik for γ-stråling eller er en del af en generel stressrespons, analyserede vi virkningerne af hypoxi, hypertermi og genotoksisk stress på ekspressionen af ​​CT-antigener og MHC- JEG.

In vitro

bestråling af cancercellelinjer og friske tumorbiopsier inducerede en højere eller de novo ekspression af forskellige CT-antigener og en højere ekspression af MHC-I på en tids- og dosisafhængig måde. Vigtigt er det, viser vi, at bestråling af kræftceller forbedrer deres anerkendelse af tumor-specifikke CD8 + T-celler. Analysen af ​​parrede biopsier taget fra en kohorte af patienter med sarkom før og efter strålebehandling bekræftet vores resultater og derudover viste, at bestråling medførte højere infiltration med lymfocytter. Andre former for stress ikke har indflydelse på ekspressionen af ​​CT-antigener eller MHC-I.

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at γ-stråling fremmer den immunologiske genkendelse af tumoren. Vi foreslår derfor, at kombinere strålebehandling med behandlinger, der understøtter tumor specifik immunitet kan resultere i øget terapeutisk effekt

Henvisning:. Sharma A, Bode B, Wenger RH, Lehmann K, Sartori AA, Moch H, et al. (2011) γ-stråling Fremmer Immunologisk Anerkendelse af kræftceller gennem Øget ekspression af kræft-Testikel Antigener

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 6 (11): e28217. doi: 10,1371 /journal.pone.0028217

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: 2. maj 2011; Accepteret: November 3, 2011; Udgivet: November 29, 2011

Copyright: © 2011 Sharma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ludwig Institute for Cancer Research /Cancer Research Institute (Cancer Antigen Discovery Collaborative), Atlantic Filantropi, Cancer Research Institute, Hanne Liebermann Foundation, Hartmann Muller Foundation, Terry Fox Foundation og Ellinger Foundation, med alumini Universitet af Zürich (www.alumuni.uzh.ch). Alessandro A. Sartori er støttet af Vontobel-Fonden og af en Ambizione stipendium fra den schweiziske National Science Foundation (SNSF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

γ-stråling eller strålebehandling er en af ​​de mest udbredte behandlinger for kræft [1]. Bestråling inducerer død af tumorceller [2], [3], men der er akkumulerende beviser for, at adaptiv immunitet bidrager væsentligt til effektiviteten af ​​strålebehandling [4]. For eksempel bestråles tumorer i patienter og hos mus oftere infiltreret af leukocytter end de ubestrålede tumorer [5], [6], [7] og meget nylige studier i prækliniske modeller viste, at effekten af ​​strålebehandling afhænger af tilstedeværelsen af ​​CD8

+ T-celler [8]. Det forhold, at tumorer målrettes og kontrolleres af CD8

+ T-celler antydes af den øgede tumorincidens hos immunsupprimerede patienter [9], [10], og ved, at tumor-specifik immunitet kan påvises [11] i kræftpatienter [12], [13], [14], [15]. Som anerkendelse af tumorceller ved CD8

+ T-celler afhænger af præsentationen af ​​tumor-associerede antigener (TAA’er) i forbindelse med MHC-I-molekyler, den ofte heterogene udtryk for TAA og /eller MHC-I inden for en tumor negativ indvirkning på effektiviteten af ​​tumor-specifik immunitet. I den foreliggende undersøgelse spurgte vi det specifikke spørgsmål, om bestråling inducerer eller op-regulerer ekspressionen af ​​en fremtrædende gruppe af TAA’er, de såkaldte CT-antigener. CT-antigener danner en udvidet familie af antigener, som udtrykkes i en lang række forskellige maligniteter, men er fraværende fra sundt væv undtagen testis og placenta [16], [17]. Cancerpatienter udvikler ofte spontane immunresponser mod CT-antigener, hvilket illustrerer deres immunogenicitet [18]. På grund af deres immunogenicitet og begrænset mønster af udtryk, er CT-antigener betragtes lovende mål for immunterapi i kræftpatienter [19], [20]. Vi observerede, at bestråling inducerede en højere eller en

de novo

ekspression af forskellige CT-antigener samt en opregulering af MHC-I-ekspression i flere cancercellelinier og i friske,

ex vivo

bestrålet tumorbiopsier. Vigtigere, sammenligning af parrede tumor sektioner opnået fra sarkom patienter før og efter bestråling viste opreguleret eller

de novo

af MHC-I og CT-antigener og den samtidige stigning i infiltrerende CD8

+ T-celler , hvilket antyder, at bestråling mobiliserer lokale, tumorspecifikke immunresponser. Desuden er vores resultater viser, at en kombination af strålebehandling og aktiv immunisering med relevante CT-antigener kan være en behandlingsmodalitet med højere effektivitet sammenlignet med enten alene terapi.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

den etiske komité “etisk udvalg i kantonen Zürich” specifikt godkendt denne undersøgelse (undersøgelse No: EK-1017)..

Cells

Cellelinjer

MDA-MB-469, MDA-MB-231 og MCF 7 (brystkræft cellelinier), MCF 10A (normalt bryst-cellelinie, der er udødeliggjort, ikke-transformerede), Saos, LM5, 143B, HOS, HU09, og M132 (osteosarcom cellelinier), A549, H460, Calu1 og Calu3 (lungecancer-cellelinjer), SK-MEL-37 (melanom cellelinie) og PC3 og DU145 (prostata cancercellelinjer) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). De osteosarcom cellelinjer var en gave fra Dr. Bruno Fuchs (Institut for ortopædi, Universitetsklinikken Balgrist, Zürich). Alle cellelinier og biopsier blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO), L-glutamin og antibiotika. PC3 og DU145 blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen) indeholdende 10% FBS, L-glutamin og antibiotika.

Primære humane celler.

Menneskelig forhudskeratinocytter blev opnået som en gave fra Dr. Onur Boyman (Department of Dermatology, University Hospital Zurich) og blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium (K-SFM, Invitrogen), supplementer (EGF human rekombinant og oksehypofyseekstrakt; Invitrogen), L-glutamin og antibiotika som beskrevet [21] . Normale humane dermale fibroblaster (NHDF) blev opnået fra Promocell GmbH (Heidelberg, Tyskland). Humane mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) blev opnået som en gave fra Dr. Therese Resink (Institut for Biomedicin, University Hospital Basel) og blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen) suppleret med 5% FBS (Sigma-Aldrich ) og antibiotika. Human lungefibroblaster (MRC-5) blev opnået som en gave fra Dr. Giancarlo Marra (IMCR, Zurich) og blev oprindeligt opnået fra Coriell Cell Repositories (Camden, NJ) og dyrkes i MEM-medium (Invitrogen) indeholdende 15% FBS, L-glutamin og antibiotika. ZT-821-celler (primære nyreceller) blev etableret i vores laboratorium fra en enkelt cellesuspension af sunde nyrevæv. De NHDF og ZT-821-celler blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) indeholdende 10% FBS (Sigma-Aldrich), L-glutamin og antibiotika.

Behandling af celler

ioniserende stråling.

Celler og friske tumor biopsier blev udsat for y-stråling fra en

60Co kilde. Doserne af bestråling anvendes, er beskrevet i hvert eksperiment.

hypertermi. Salg

Celler blev inkuberet ved 42 ° C i 1 time eller 5 timer og dyrkes derefter i 72 timer ved 37 ° C. De behandlede og ikke-behandlede celler blev derefter bearbejdet til analyse ved RT-qPCR.

Hypoxi.

Celler blev inkuberet under hypoxiske betingelser (1% O

2 vol /vol) i en hypoxisk arbejdsstation (InVivoO

2-400, Ruskinn Technology, Leeds, UK) til forskellige tidspunkter (8 h, 48 h eller 72 timer). De behandlede og ikke-behandlede celler blev derefter bearbejdet til analyse ved RT-qPCR.

Genotoksisk stress.

Celler blev behandlet ved 37 ° C med 1 ug /ml cisplatin (Sigma-Aldrich Corp . St. Louis, MO) i 24 timer eller med 15 pM etoposid (Sigma-Aldrich) i 1 time eller med 150 pM bleomycin (Sigma-Aldrich) i 1 time. Dette tidspunkt blev betragtet som T

0. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev mediet erstattet med frisk dyrkningsmedium uden lægemidlet. Cellerne blev derefter dyrket i yderligere 72 timer ved 37 ° C. Kontrolkulturer blev behandlet under lignende forsøgsbetingelser i fravær af medikamentet.

Små-molekyle proteinkinaseinhibitorer.

En bestand koncentration på 10 mM i 100% dimethylsulfoxid (DMSO) af specifik inhibitorer til ataksi telangiectasia muteret (ATM), KU 55.933 (Tocris Bioscience, Ellisville, MO) og DNA-afhængig proteinkinase katalytiske subunit (DNA-PKcs), NU7441 (Tocris Bioscience) blev fortyndet til en arbejdskoncentration på 10 pM i 1% DMSO. Inhibitorerne blev tilsat 1 time før bestråling, og blev efterladt i kulturen under hele forsøget. Kontrol kulturer blev behandlet under lignende eksperimentelle betingelser i fravær af lægemidlet med 1% DMSO.

Tumor biopsier

Biopsier blev opnået fra University Hospital Zürich. Alle patienter blev opereret som en del af deres standard behandling og underskrevet informeret samtykke. Den etiske komité “Etisk udvalg i kantonen Zürich” specifikt godkendt denne undersøgelse (Undersøgelse No: EK-1017). Straks efter resektion blev biopsier skåret i flere stykker på 2-4 mm

3. Stykkerne blev randomiseret i to portioner og sat i dyrkningsmediet. En batch blev bestrålet med en enkelt dosis på 20 Gy, mens det andet parti tjente som kontrol. Tumor stykker blev dyrket i 72 timer efter

ex vivo

stråling og genekspressionen blev bestemt ved RT-qPCR analyse. Forbundne biopsier fra sarkom før og efter bestråling blev indsamlet til et andet formål, og derfor tidspunkter for indsamling efter strålebehandling varierede mellem 2-6 uger. Tumorerne blev bestrålet

in vivo

med en lineær accelerator og fik en dosis på 50-64 Gy.

RNA-ekstraktion og fremstilling af cDNA

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og blev efterfølgende fordøjet med DNase I (Invitrogen). Koncentrationen og renheden blev vurderet ved anvendelse af NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). 150 ng RNA revers transkriberet under anvendelse af høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosciences, Foster City, CA). CDNA’et blev enten straks anvendes til RT-qPCR reaktioner eller opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse. Alle sæt anvendtes i overensstemmelse med producentens instruktioner.

RT-qPCR

Ekspressionen af ​​CT-antigener og MHC-I blev analyseret ved anvendelse af TaqMan genanalyse primere og TaqMan 1x universal Master Mix (Applied Biosystems) på en RotoGene cycler (Corbett Research, Sydney, NSW). Reaktionsblandingen (10 pi) bestod af 1 pi cDNA, 3,5 pi vand, 0,5 pi primer og 5 pi TaqMan 1x universal mester mix. De følgende cyklus blev anvendt: 2 min 50 ° C, 10 min 95 ° C, 45 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C, 1 min 60 ° C. Ændringen i ekspressionsniveauer af CT-antigener og MHC-I er givet som fold forøgelse i ekspression ved sammenligning af delta-Ct-værdier på det behandlede med den for de ikke-behandlede prøver efter normalisering til 18S rRNA. Ct-værdier 38 cyklusser blev fortolket således at genet ikke udtrykkes og en fold ekspression 2 blev betragtet som ingen ændring. Hver af brystkræft og osteosarcom cellelinier blev testet i to uafhængige forsøg og lungecarcinom og prostatacarcinom-cellelinier i en. Hver prøve blev påsat i dubletter /triplikater for hver af de RT-qPCR eksperimenter.

Flowcytometri

Celler blev farvet med PE-mærket anti-HLA-A, B, C (klon G46 -2,6, 1:100), FITC-mærket anti-β2-mikroglobulin (klon TU99, 1:100) (BD Pharmingen, San Diego, CA) og propidiumiodid (PI; Sigma). Prøver blev målt med et FACS Calibur (BD) og analyseret med FlowJo software (Treestar) efter gating på levende (PI-negative) celler. Passende isotypekontroller blev anvendt.

Immunhistokemi

Formalin-fikseret, paraffinindlejrede parrede vævssnit opnået fra patienter med sarkom før og efter bestråling farvet med muse-anti-humane monoklonale antistoffer mod CD4 (klon 1F6, 01:30, Zymed Laboratories Inc.), CD8 (klon C8 /114B, 1:100, DAKO A /S, Carpinteria, CA), granzym B (klon Gr B-7, 01:25, DAKO A /S ), MHC-I (klon C21, 1:1000, FUI Research Diagnostics, Inc.), CT7 (klon CT7-33, 1:80, DAKO A /S), CT10 (kanin polyklonale, 1:500, Proteintech Group, Inc.), NY-ESO-1 (klon E978, 01:50, Zymed) og Perforin (klon 5B10, 1:20 Novocastra Laboratories Ltd). Snit blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret og monteret. Alle afsnit blev farvet enten med Ventana Benchmark automatisk farvning systemet (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) hjælp Ventana reagenser til hele proceduren for NY-ESO-1, CT7, granzym B, CD4, CD8 og perforin og BondMax (Vison BioSystems , Newcastle upon Tyne, UK) for CT10 og MHC-i. UView (Ventana) eller Tilpas DAB (Vision BioSystems) blev anvendt som chromogener mod de primære antistoffer. Billeder af de farvede sektioner blev erhvervet på Zeiss-Axiovert 200 M (Carl Zeiss Light Microscopy Göttingen, Gearmany) omvendt mikroskop bruger Carl Zeiss Axiovision CD28 imaging system. De farvninger blev bedømt på en skala fra 0 til 5 til ekspression af NY-ESO-1, MAGE-C1 /CT7, og MAGE-C2 /CT10 i procent, baseret på antallet af positive celler, der udtrykker antigenet til den samlede antallet af celler i en høj effekt felt (HPF) under anvendelse af en 40X objektiv. Scoringen for MHC-I-ekspression blev gjort ud fra intensiteten af ​​farvning. Tumor infiltrater blev beregnet som antallet af celler, der udtrykker CD4, CD8 og granzym pr HPF anvendelse af et 40X objektiv. Hver farvede afsnit blev evalueret i fem forskellige regioner (for detaljeret liste over scoringer se tabel S4). Tre personer udførte scoring blindt og uafhængigt for MHC-I farvninger og to personer udførte scoring blindt for de andre farvninger.

Immunofluorescens

Celler (10’000-20’000 celler i 1 ml medium) blev udsået på rumopdelte kultur slides (BD Biosciences) at overholde natten over. Celler blev derefter fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i 5 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af blokering med 10% BSA /PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter inkuberet med monoklonale museantistoffer mod NY-ESO-1 (klon E978, 1:500, Invitrogen) eller MAGE-C1 /CT7 (klon CT7-33, 1: 500, Dako) i 10% BSA /PBS i 1 time ved stuetemperatur i mørke, efterfulgt af inkubering med FITC- mærket sekundært antistof gede-anti-muse IgG1 (Poly4053, 1:2000, Biolegend) i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Objektglassene blev modfarvet med 4 ‘, 6’-diamidino-2-phenylindol-hydrochlorid (DAPI, 1:500) i 2 minutter i mørke og inspiceret ved anvendelse af et Zeiss-Axiovert 200 M inverse mikroskop og et Carl Zeiss Axiovision CD28 imaging system.

Western blot analyse

bestrålet og ikke-bestrålede celler blev kontrolleret for protein-ekspression ved anvendelse af monoklonale antistoffer fra mus mod NY-ESO-1 (klon E978, 1:500, Invitrogen) eller MAGE- C1 /CT7 (klon CT7-33, 1: 500, Dako) og β-actin (klon 4i374, 1:8000,

Santa Cruz

Biotech, CA). Virkningen af ​​genotoksiske midler og DNA-PKcs og ATM-inhibering, på γ-bestråling induceret genekspression i celler blev vurderet ved anvendelse af antistoffer mod pS2056-DNA-PKcs (kanin polyklonale til phospho S2056-DNA-PKcs, 1:300, Abcam Inc, MA), fancy-D2 (klon FL17, 1:200,

Santa Cruz

Biotech, CA), pS1981-ATM (klon EP1890Y, 1:5000, Eitomics, CA) og PS15-p53 (klon 16G8, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA). Efterfulgt af inkubering med det sekundære antistof, polyklonalt ged anti-mus IgG1 HRP (Poly4053, 1:10000, Biolegend) eller polyklonalt gede-anti-kanin-HRP (1:10000, Abcam). ECL-reagens (Amersham, UK) blev anvendt som luminescens substrat.

CD107a Degranulering Assay

Anerkendelse af celler, der udtrykker NY-ESO-1 efter bestråling af antigen-specifikke CD8

+ T-celler blev testet under anvendelse af CD107a degranulering assay. Tre x 10

5 NY-ESO-1

157-165 /HLA-A2-specifik klonet CD8

+ T-celler (genereret som beskrevet [22]) blev inkuberet med 10

6 CFSE- mærket (1 uM) HLA-A2

+ MDA-MB-469-celler – som var eller ikke var bestrålet med 20 Gy 72 timer tidligere – i en 96-brønds mikrotiterplade rundbundet plade i et endeligt volumen på 200 pi RPMI + 10 % FCS og antibiotika i nærværelse af PE-mærket anti-CD107a (1:20, BioLegend, SD, California). Som positiv kontrol blev MDA-MB-469-celler fyldt med 10

-6 M NY-ESO-1

157-165 peptid. To uafhængige T-cellekloner (2A7 og 2B5) blev anvendt, og alle kulturer blev udført i dobbeltbestemmelse. Inkubationen blev udført ved 37 ° C i 4 timer. Cellerne blev opsamlet og vasket i 2 ml FACS-buffer (FB) efterfulgt af farvning med pacific blå-mærket anti-CD8 (BioLegend) i 50 pi FB i 30 min ved 4 ° C. Cellerne blev vasket en gang med 2 ml FB og resuspenderes i 200 pi FB. Prøverne blev målt på Cyan ADP9 (Beckman Coulter, Fl, USA) og analyseret med FlowJo software (Treestar).

Resultater

In vitro

γ-stråling up- regulerer udskrifter af CT-antigener og MHC-i-molekyler

Breast, osteosarkom, lunge- og prostatakræft og normale primære celler blev udsat for en enkelt-dosis stråling på 20 Gy, efter 72 timer cellerne blev høstet og analyseret til ekspression af CT-antigener og MHC-i ved RT-qPCR. De fleste af disse cancercellelinier udtrykt upåviselige eller meget lave niveauer af CT-antigener under standard dyrkningsbetingelser. I modsætning hertil viste y-udstrålede celler

de novo

eller opreguleret ekspression af forskellige CT-antigener i en randomiseret måde (figur 1A-D). I et panel af de fire kræft cellelinje typer blev γ-stråling fundet at have den mest dybtgående effekt på brystkræft og osteosarkom cellelinjer og den mindste på prostata kræft cellelinjer. Den opregulering af MHC-I og CT-antigener ved γ-stråling synes at være en bestemt funktion af maligne celler, da dette ikke blev observeret i nogen af ​​de normale primære celler, som vi testede her (ZT-812, human forhud keratinocytter , HMEC-1, MRC-5, NHDF og MCF 10A, fig S1A, S1B). Melanomacellelinien SK-MEL-37 er kendt for at udtrykke alle testede CT-antigener under normale dyrkningsbetingelser og blev derfor medtaget som positiv kontrol. Bestråling af denne cellelinie resulterede i en klar opregulering af alle CT-antigener og MHC-I (data ikke vist). Vi har registreret en forøget ekspression af CT-antigener og MHC-I så tidligt som 24 timer efter bestråling i nogle tilfælde og en støt stigning i genekspression blev observeret op til 96 timer efter bestråling. Som vi observerede betydelig celledød ved 96 timer efter bestråling, udføres vi alle yderligere analyser på 72 timer efter bestråling. Som strålebehandling kan gives som en enkelt høj dosis (20 Gy) eller som fraktionerede doser, vi bestrålet udvalgte cellelinjer (de brystkræft cellelinier MDA-MB-469 og MCF7, samt osteosarkom cellelinier Saos, HOS, LM5 og 143B, med 2 Gy pr dag på 10 på hinanden følgende dage. Denne protokol resulterede i lignende ændring af CT-antigen og MHC-i-ekspression som observeret med en enkelt dosis på 20 Gy (fig S2A, S2B). en enkelt dosis på 20 Gy blev anvendt i alle yderligere forsøg.

Etablerede cancercellelinier blev udsat for enkelt dosis bestråling på 20 Gy og mRNA ekspression af CT-antigener og MHC-i blev bestemt 72 timer senere ved RT-qPCR. (A ) brystcancer cellelinjer, (B) osteosarcom cellelinier, (C) lungekræft cellelinier, (D) prostata cancercellelinjer. Alle Ct-værdier normaliseres til 18S rRNA og dataene præsenteret som den fold forøgelse af ekspression i bestrålede sammenlignet med de tilsvarende ubehandlede prøver. Fordi fold udtryk ikke kan beregnes for gener, der

de novo

udtrykt ved bestråling, vi sætter symbolerne i sådanne tilfælde over den tynde vandrette linje i (A).

In vitro

γ-stråling opregulerer CT-antigener og MHC-i-molekyler på proteinniveauet

for at bekræfte bestråling-induceret ekspression af CT-antigener på proteinniveauet, farvede vi bestrålede og ikke-bestrålede MDA-MB-469 celler med antistoffer mod NY-ESO-1 og CT7 og analyseret ekspressionen af ​​CT7 og NY-ESO-1 på forskellige tidspunkter efter bestråling ved immunfluorescens mikroskopi og ved Western blotting. Melanomacellelinien SK-MEL-37 konstitutivt udtrykker NY-ESO-1 og CT7 og blev anvendt som positiv kontrol. Vi observerede den

de novo

udtryk for både CT-antigener efter bestråling, at øget med tiden (figur 2A, 2B), hvilket bekræfter de opnåede data ved RT-qPCR. Bestråling af normalt bryst-cellelinie MCF10A resulterede ikke i forøgede NY-ESO-1 eller CT7 proteinniveauer (figur 2B). For at undersøge virkningen af ​​γ-stråling på overfladen ekspression af MHC-I på proteinniveauet, vi bestrålede flere cancercellelinier (brystcarcinoma og osteosarcom) og normale primære celler af forskellig oprindelse, efterfulgt af flowcytometrisk påvisning af overfladen MHC-I og observeret, at bestråling medførte en tidsafhængig stigning i MHC-i overfladeekspression på forskellige cancercellelinier (figur 2C, 2D), men ikke i de normale primære celler (fig S1B).

(a) immunofluorescens af MDA-MB-469 og SK-MEL-37 celler udsat for en enkelt dosis bestråling på 20 Gy og farvet med antistoffer mod NY-ESO-1 og CT7 på forskellige tidspunkter efter bestråling. (B) MDA-MB-469, SK-MEL-37 og MCF 10A cellelinjer blev udsat for en enkelt dosis på 20 Gy og ekspressionen af ​​NY-ESO-1 og CT7 blev analyseret ved Western blotting 72 timer senere. (C) brystkræft og (D) osteosarcom cellelinier blev udsat for enkelt dosis bestråling på 20 Gy og ekspressionen af ​​HLA-ABC og β

2microglobulin blev kvantificeret på forskellige tidspunkter efter bestråling ved flowcytometri. RAD: angiver γ-stråling

Bestråling af kræftceller øger T-celle genkendelse

in vitro

For at afgøre, om bestråling-induceret opregulering af. CT-antigener og MHC-i resulterer i øget anerkendelse af antigen-specifikke CD8

+ T-celler, vi målte degranulering [23] – [24] af NY-ESO-1

157-165 /HLA-A2- specifikke klonede CD8

+ T-celler efter inkubering med bestrålede og ikke-bestrålede HLA-A2

+ MDA-MB-469 brystcancerceller. MDA-MB-469 celler er negative for NY-ESO-1, men bliver positive ved bestråling (figur 1A, 2A, 2B). Vi fandt, at kun bestrålet MDA-MB-469-celler induceret degranulering af to uafhængige NY-ESO-1

157-165-specifikke CD8

+ T-cellekloner (2A7, 2B5) (figur 3). Bestråling ikke yderligere øge degranulering når blev anvendt peptidbelastede MDA-MB-469-celler (data ikke vist), hvilket indikerer, at ikke mængden af ​​MHC-I, men mængden af ​​NY-ESO-1

157-165 præsenteret af MHC-i var den begrænsende faktor i ubestrålede MDA-MB-469-celler, som passer til, at bestråling induceret

de novo

ekspression af NY-ESO-1 i MDA-MB-469-celler (figur 1A, 2).

10

6 CFSE-mærkede HLA-A2 + MDA-MB-469 brystcancerceller blev bestrålet eller ikke med en enkelt dosis på 20 Gy og blev inkuberet 72 timer senere med 3 × 10

5 NY-ESO-1

157-165 /HLA-A2-specifikke CD8 + T-cellekloner (klon 2A7 og klone 2B5) i nærvær PE-mærket anti-CD107a-PE i 4 timer ved 37 ° C. Cellerne blev derefter farvet med pacific blå-mærket anti-CD8- i 30 minutter ved 4 ° C. Peptidbelastede MDA-MB-469 celler blev anvendt som positiv kontrol. Alle kulturer blev udført i dobbeltbestemmelse. Den degranulering blev målt som procent CD107a

+ celler af CD8

+ celler efter gating på CFSE-negative celler ved flowcytometri.

Ex vivo

bestråling af frisk tumorbiopsier inducerer opregulering af CT-antigener og MHC-i

for at udvide vores resultater til klinisk relevant materiale, vi indsamlet friske tumor biopsier fra 23 forskellige kræftpatienter, skære dem i mindst 50 små stykker, og randomiseret dem i to forsøgsgrupper. Vi bestrålet en gruppe af biopsier med 20 Gy, mens de andre tjente som kontrol, og analyseret udtryk for CT-antigener og MHC-I 72 timer senere ved RT-qPCR og immunhistokemi. Disse resultater bekræftede resultaterne, vi opnåede med cancercellelinjer, at γ-stråling ofte induceret forøget ekspression af CT-antigener og /eller MHC-I (figur 4A, 4B, tabel S1). Vigtigere, vores resultater antyder, at heterogene ekspression af CT-antigener og /eller MHC-I kan blive mere homogene ved strålebehandling, som naturligvis understøtter immunologisk kontrol af tumoren.

Friske tumoreksplantater fra forskellige cancerpatienter (n = 23) blev bestrålet eller ikke med enkelt-dosis på 20 Gy. Diagnosen af ​​de individuelle patienter, er vist i supplerende tabel S1. (A) Efter 72 timer blev de bestrålede og kontrol eksplantater analyseret for ekspression af NY-ESO-1 og MHC-I ved RT-qPCR. (B) Repræsentative sektioner (patient nummer 9 og 20) afbilder ekspressionen af ​​NY-ESO-1 og MHC-I ved immunhistokemi (20X forstørrelse). NR indikerer ikke-udstrålede og RAD angiver tilsvarende bestrålede sektioner.

In vivo

bestråling af humane sarkom resulterer i øget ekspression af CT-antigener og MHC-I og i lymfocytinfiltrering

Endelig har vi sammenlignet ekspressionen af ​​CT-antigener, MHC-i og infiltration af lymfocytter i 15 parrede paraffin-sektioner opnået fra patienter med sarkom før og efter strålebehandling ved immunohistokemi. Vi fandt, at strålebehandling resulterede i væsentlig opregulering eller

de novo

ekspression af CT-antigener og /eller MHC-I-molekyler, som blev ledsaget af en forøget infiltration af lymfocytter og granzym ekspression i 7/15 og 12 /15 prøver, henholdsvis (figur 5A-D, tabel S2, S3).

paraffinindlejrede parrede vævssnit opnået fra sarkom patienter (n = 15) før og efter bestråling blev analyseret ved immunohistokemi for (A) tilstedeværelsen af ​​CD8

+, CD4

+ og granzym

+ celler, (B) ekspression af CT7, NY-ESO-1 og CT10 og (C) MHC-i-ekspression. CT-antigener blev bedømt som den gennemsnitlige procentdel af levende celler, der udtrykker antigenet til det samlede antal celler i fem høj effekt felter (40X objektiv). Infiltration af lymfocytter blev taget som middelværdien ved at tælle antallet af celler, der udtrykker CD4, CD8 og granzym i fem høj effekt felter, og MHC-I blev scoret baseret på intensiteten af ​​farvningen. (D) Repræsentative snit viser ekspressionen af ​​CT-antigener og MHC-I og infiltration af lymfocytter før og efter strålebehandling ved immunohistokemi. Afbildet er: patient F til ekspression af CT7, patient A til CT10, patient K for NY-ESO-1, patient D for CD4 og MHC-I og patient E for CD8-ekspression. NR angiver ikke-udstrålede og RAD angiver tilsvarende bestrålede sektioner. Pt: angiver patient nummer. Patientinformation er opført i supplerende tabel S2.

Andre former for stress har ingen indvirkning på ekspressionen af ​​CT-antigener eller MHC-I

in vitro

Stress og miljømæssige forandringer medføre ændringer i den transkriptionelle profil for at klare disse overfald [25], [26], [27]. Som bestråling inducerer DNA-skade, undersøgte vi, om det opreguleret ekspression af MHC-I og CT-antigener også ville forekomme efter eksponering af cellelinier til andre behandlinger, der inducerer DNA-skade, såsom cisplatin, etoposid og radiomimetiske lægemiddel bleomycin. MDA-MB-469 og SK-MEL-37 celler blev behandlet separat med hver af de DNA-skadelige midler og RNA-niveauer blev overvåget på forskellige tidspunkter efter behandling. Vores resultater viser, at ingen af ​​disse midler opreguleret ekspression af CT-antigener og MHC-I (figur S3B-D). Kendetegnet generne PS15-p53 og fancy-D2 var imidlertid opreguleret efter behandling, hvilket indikerer, at disse midler induceret stress på den anvendte koncentration (figur S3A). Desuden testede vi, om andre former for kræft stress, herunder forhøjede temperaturer eller lavt iltindhold, induceret forøget ekspression af CT-antigener og /eller MHC-I. Vi fandt, at ingen af ​​disse behandlinger haft indflydelse på ekspressionen af ​​CT-antigener og MHC-I mens signaturen gen CA9 blev opreguleret (Figur S4A, s4b). Tilsammen tyder disse resultater på, at den forøgede ekspression af CT-antigener og MHC-I ved cancercellelinjer er et specifikt svar på y-stråling og ikke forekomme efter udsættelse for andre inducere af forskellige stress response pathways.

ATM og DNA-PK signalveje kan undværes for γ-stråling-induceret ekspression af CT-antigener og MHC-i

aktiveringen af ​​DNA-beskadigelse reparation checkpoint pathways som en reaktion på genotoksisk insult bidrager til at opretholde den genomisk integritet i pattedyrceller [28]. DNA-skader udløser aktivering af forskellige serin /threonin protein kinaser, som udgør de primære transducere i signaleringskaskade, og som, ataksi telangiectasia muteret (ATM) og DNA-afhængige proteinkinaser (DNA-PKcs) er af allerstørste betydning [29] . ATM proteinkinasen er en kritisk mellemprodukt i en række cellulære responser på y-stråling og andre former for stress [30]. Vi således undersøgt, om den opregulering af CT-antigen og MHC-I-ekspression som reaktion på y-stråling afhænger af aktivering af ATM og /eller DNA-PKcs.