PLoS ONE: En ny Polymorfi Biomarkør rs629367 forbundet med øget risiko og ringe overlevelse af gastrisk kræft i kinesisk ved opreguleret miRNA-lad-7a Expression

Abstrakt

Baggrund

Variant i pri-miRNA kunne påvirke miRNA udtryk og moden proces eller splejsning effektivitet, og dermed ændre den arvelige modtagelighed og prognose af kræft. Vi havde til formål at vurdere miRNA-lad-7 enkelt nukleotid polymorfier (SNP), der er forbundet med risiko og prognose for mavekræft (GC) som at forudsige biomarkører, og desuden, dens mulige mekanismer.

Metoder

En to-trins case-kontrol undersøgelse designet til at screene fire miRNA SNP’er (PRI-lad-7a-2 rs629367 og rs1143770, pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7f-2 rs17276588) i 107 GC patienter , 107 atrofisk gastritis (AG), og matches 124 kontroller under anvendelse af PCR-RFLP. To lovende SNPs blev valideret i en anden uafhængig 1949 prøver (herunder 579 gastrisk kræftpatienter, 649 atrofisk gastritis og 721 kontroller) ved hjælp Sequenom MassARRAY platform og sekventering.

Resultater

Vi fandt, at PRI-let -7a-2 rs629367 CC-variant genotype var forbundet med øget risiko for mavekræft og atrofisk gastritis med 1,83 gange og 1,86 gange hhv. For mavekræft prognose, patienter med rs629367 CC genotype havde signifikant dårligere overlevelse end patienter med AA genotypen (log-rank

P

= 0,004). Vi undersøgte yderligere Lad-7a ekspressionsniveauerne i serum og fandt, at lade-7a udtryk forhøjet gradvist for rs629367 AA, CA, CC genotype i atrofisk gastritis gruppen (

P

= 0,043). Desuden bekræftede vi disse resultater in vitro undersøgelse fra overekspression lad-7a bærer pri-lad-7a-2 vildtype A eller polymorf-type C allel (

P

0,001).

konklusioner

pri-lad-7a-2 rs629367 CC genotype kan øge risikoen for mavekræft samt atrofisk gastritis og var også forbundet med dårlig overlevelse mavekræft, som muligvis ved at påvirke den modne lad-7a udtryk, og kunne tjene som forudsiger biomarkør for høj risiko og dårlig prognose af mavekræft

Henvisning:. Xu Q, Dong Q, han C, Liu W, Sun L, Liu J, et al. (2014) En ny Polymorfi Biomarkør rs629367 forbundet med øget risiko og ringe overlevelse af gastrisk kræft i kinesisk ved opreguleret miRNA-lad-7a Expression. PLoS ONE 9 (4): e95249. doi: 10,1371 /journal.pone.0095249

Redaktør: Qing-Yi Wei, Duke Cancer Institute, USA

Modtaget: Januar 26, 2014 Accepteret: 24 marts 2014; Udgivet 23. april, 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Key Basic Research Program Kina (973 Program ref nr. 2010CB529304), National Natural Science Foundation of China (Ref nr 31.200.968), og Science Technology Project i Liaoning-provinsen (Ref nr 2011225002) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er 18-25 nukleotider (nt) -Long, enkeltstrenget ikke-kodende RNA [1]. Enhver variation i PRI-miRNA, præ-miRNA eller modne miRNA kan påvirke modne proces og funktion af miRNA, som yderligere kan påvirke ekspressionen af ​​hundredvis af proteiner i samspillet pathway [2]. Til en vis grad, varianten af ​​miRNA spillet en rolle som en “oncogen” eller “tumorsuppressorgen” indirekte [3].

Lad-7 er den anden identificeret miRNA efter opdagelsen af ​​den første miRNA, lin -4 [4] – [6]. Den lad-7 familie har 10 medlemmer, herunder lad-7a at lade-7g, lad-7i, miR-98 og miR-202. Den Lad-7 familien spiller en afgørende rolle i at opretholde den normale fysiologiske funktion af menneske. For eksempel kunne PRI-miRNA af lad-7 familie kombinere med LIN28 og undertrykke proceduren ifølge drosha og Dicer splejsning, to vigtige restriktionsenzymer involverer i det modne fremgangsmåde til alle miRNA [7]. Ud ved at banke ned drosha enzymet til at undertrykke alle de miRNA modne proces omfattende, Kumar på al fandt, at den væsentligste årsag til aktivering og fremme af cellens malign transformation var nedregulering af lad-7 familie udtryk [8]. Selv om mange tidligere undersøgelser har bidraget stort set at illustrere de biologiske funktioner af lad-7 familie, har nogle undersøgelse fokuserede på genetiske variationer af medlemmer af familien. Faktisk, hvis to individer blev udvalgt tilfældigt, kan deres genomer demonstrere ca. 0,1% mangfoldighed, hvoraf den mest almindelige mangfoldighed var SNP [9]. På grund af eksistensen af ​​disse forskelligheder, kan det samme gen føre til forskellige genekspressionsprodukter som kan resultere i forskellige sygdom modtagelighed, arvelig fænotype og prognose af sygdom [10].

Tidligere undersøgelser viste, at PRI-miRNA SNP’er kan anvendes som genetiske markører til forudsigelse af risiko for kræft. For eksempel blev PRI-MIR-185 rs2008591 forbundet med risiko for brystkræft [11]; PRI-MIR-34b /c rs4938723 var forbundet med risiko for hepatocellulær cancer [12]. I den foreliggende undersøgelse, ved hjælp af data fra NCBI bioinformatik-databaser, screenede vi alle SNP’er i det primære precursor området lad-7 familie (± 600 bp), og fandt, at kun 4 SNPs (PRI-let-7A-1 rs10739971, pri -Lad-7a-2 rs629367 og rs1143770, pri-let-7f-2 rs17276588) havde Minor Allel Frequency (MAF) 5% i kinesiske befolkning, og de var alle tagSNPs i Hapmap database. Hidtil har kun få undersøgelser nævnt forholdet mellem de fire tagSNPs og sygdom risiko forudsigelse bortset skizofren sygdom [13], ikke-småcellet lungecancer [14] og diabetisk nefropati [15]. Deres potentielle rolle i at forudsige kræftrisiko stort set ukendt

mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan og en af ​​de hyppigste kræftformer i østasiatiske og kinesiske befolkning [16] – [18].. Undersøgelser har vist, at flere miRNA SNPs var forbundet med mavekræft risiko [19] – [22]. Imidlertid, om de ovennævnte fire tagSNPs i pri-miRNA gener af lad-7 blev associeret med risiko for mavecancer og atrofisk gastritis i kinesiske befolkning, om den kan anvendes som en prædiktiv genetisk biomarkør for mavekræft, og den specifikke mekanisme for, hvordan de regulerer risiko for sygdom stadig skal afklares.

i denne undersøgelse vi først vurderet sammenhængen mellem disse fire ansøgerlande tagSNPs i pri-lad-7a og modtagelighed for mavekræft og dens forløber ved at foretage en to-trins case-kontrol undersøgelse på kinesisk. I mellemtiden har vi undersøgt, om risikoen-associerede polymorfi bidrager mod mavekræft patienternes overlevelse. Derudover undersøgte vi effekten af ​​risikoen-associerede polymorfi om regulering sin modne miRNA udtryk i serum og gastrisk væv samt udforsket dens mulige reguleringsmekanisme i modulerende sygdomsrisiko og overlevelse. Ved at udføre den foreliggende undersøgelse, håber vi at foreslå potentielle anvendelse udsigten til undersøgte SNP som en forvarsel biomarkør for personer med høj risiko for mavekræft og dens præcancerøse sygdom (atrofisk gastritis).

Metoder

Patienter og studiedesign

Dette forskningsprojekt blev godkendt af Etisk Komité First Affiliated Hospital i Kina Medical University og undersøgelsen blev opdelt i tre selvstændige, men relaterede dele, herunder risiko, prognose og mekanismer forskning . Risikoen del var to trin udformet, man screening fase og den anden er valideret fase. For at belyse foreningen af ​​kandidat SNPs med mavekræft og atrofisk gastritis risici, udvælgelsesstadiet efterfølgende rekrutteret prøver, herunder 338 tilfælde, der består af 107 gastrisk kræftpatienter, 107 atrofisk gastritis tilfælde og 124 matchede kontroller fra First Affiliated Hospital i Kina Medical University mellem 2005 og 2010. i den validerede fase, vi undersøgte i alt 1949 sager, herunder 579 mavekræft, 649 atrofisk gastritis og 721 raske kontrolpersoner fra et sundhedstjek program for gastrisk kræftscreening i Zhuanghe i Liaoning-provinsen, Kina eller fra patienterne i First Affiliated Hospital i Kina Medical University, mellem 2002 og 2013. Alle de emner i denne undersøgelse blev endoskopisk og histologisk bekræftet. Klassificeringen af ​​mavekræft var opdelt i tarm-typen og diffus-type for undergruppe analyse, som var baseret på Laurens klassifikation [23], [24]. Klassificeringen og planering af gastritis var baseret på den Opdateret Sydney System [25], [26]. Individer, der var endoskopisk og histologisk bekræftet med normal slimhinde eller kun minimal gastritis uden anden systemisk sygdom eller andre mavesygdomme tjente som kontroller. Skriftligt informeret samtykke blev indsamlet fra patienter og medicinske historie (herunder alder, køn, rygning, og alkoholforbrug) opnået ved spørgeskema og de optegnelser blev edb som tidligere beskrevet [24].

For yderligere at undersøge sammenhængen risiko-associeret polymorfi med clinicopathologic parametre og overlevelse i mavecancerpatienter, brugte vi data fra 150 gastrisk kræfttilfælde, hvis oplysninger af død eller overlevelse var til rådighed. Tumoren histologiske kvalitet blev vurderet af World Health Organization kriterier og tumorer blev iscenesat ved hjælp af den 7. udgave af TNM af Den Internationale Union Against Cancer (UICC) /American fælles udvalg om kræft (AJCC) (2010) baseret på postoperativ patologisk undersøgelse . Patienter (i) med fjernmetastaser fundet præoperativt, (ii), der gennemgik præoperativ strålebehandling eller kemoterapi, eller (iii) med ufuldstændige patologiske dataposter blev udelukket fra overlevelse analyse. Opfølgning blev afsluttet i august 2013. Endelig blev 150 patienter inkluderet i overlevelse analyse.

Til vurdering af sammenhængen mellem risiko-associeret polymorfi og dens miRNA udtryk i serum, 364 sager, herunder 164 mavekræft, 100 atrofisk gastritis og 100 raske kontroller blev undersøgt. Kendetegnene for omfattede emner blev vist i supplerende tabel S1. Hertil kommer, til vurdering af sammenhængen mellem risiko-associeret polymorfi og dens miRNA-ekspression i gastrisk væv, 97 ikke-canceous prøver og 94 gastriske kræft prøver blev opnået fra 97 patienter, som gennemgik gastrektomi på First Affilicated Hospital i Kina Medical University mellem 2009 og 2013.

Emne s genotype

Genomisk DNA blev ekstraheret som beskrevet tidligere med visse ændringer [27]. Genotypebestemmelse blev udført ved CapitalBio (Beijing, Kina) under anvendelse af Sequenom MassARRAY platform (Sequenom, San Diego, CA, USA) som tidligere beskrevet [24]. 5% af hele prøver blev gentagne gange genotypebestemmes, og konkordansen sats var 100%, hvilket viser, at genotype var korrekt. De detaljerede materialer blev vist i de supplerende metoder.

Påvisningen af ​​serum H. pylori-IgG titer

Ifølge fremgangsmåden beskrevet af litteraturen [28], serum

H. pylori

-IgG titer blev påvist ved enzymbundet immunsorbentassay (ELISA, Helicobacter pylori IgG kit; Biohit, Helsinki, Finland). De detaljerede materialer blev vist i de supplerende metoder.

RNA ekstraktion og real-time PCR-reaktion for miRNA-ekspression in vivo

blev brugt Den miRNA udvundet metode fra serum og væv som beskrevet af litteratur [29] med visse modifikationer. Den revers transkription reaktion blev anvendt One Step Prime Script miRNA cDNA (Perfect Real Time) Kit (TAKARA Biotechnology Co., Ltd, Dalian, Kina) og Real-time PCR-reaktion blev brugt miRcute miRNA qPCR afsløring kit (SYBR) (TIANGEN Biotech Co ., Ltd, Beijing, Kina). De detaljerede materialer blev vist i de supplerende metoder.

Transient transfektion og real-time PCR-reaktion for miRNA-ekspression in vitro

Den kommercielle ekspressionsplasmid pCMV-MIR-lad-7a-2 rs629367- C blev købt fra Origene Company (Origene Biotech Co., Ltd, Shanghai, Kina). Dette plasmid blev gennemført en stedsspecifik mutagenese ved -216 fra C til A (pCMV-lad-7a-2 rs629367-A) ved Sainuo Company (Sainuo Biotech Co., Ltd, Beijing, Kina) og bekræftet ved sekventering. Og kandidatlandene cellelinjer blev sekventeret at genotype pri-let-7a-2 rs629367 websted for at undersøge, om der var nogen variant af denne rs629367 polymorfi site. Derefter de cellelinjer af vildtype og også den laveste to lad-7a udtryk, SGC-7901 og AGS, blev udvalgt til transfektion (Flere detaljer se supplerende metoder og supplerende Figur S2). Den menneskelige gastrisk karcinom cellelinje blev AGS indkøbt fra ATCC, American Type Culture Collection, USA og SGC-7901 blev købt fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina. Efter 72 timer blev det totale RNA af celler ekstraheret og Real-time PCR blev anvendt til detekteret Lad-7a-ekspression efter revers transkription for at kunne sammenligne det modne Lad-7a produceret af pCMV-let-7a-2 rs629367-A vs. pCMV-lad-7a-2 rs629367-C.

Statistik

de undersøgte fire miRNA polymorfier blev testet for Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) blandt kontrollerne. De kontinuerlige variabler blev vist som middelværdi ± standardafvigelse (SD) og sammenlignet ved variansanalyse, medens de diskrete variabler var repræsenteret frekvenser og procenter og sammenlignet ved χ2 test [24]. Multivariat logistisk regression med justeringer for alder, køn og

H. pylori

infektion blev anvendt til at vurdere sammenhængen mellem miRNA polymorfier og sygdomsrisici. Fordi rygning og alkoholforbrug havde næsten en tredje manglende data var ikke egnet som justeringsfaktorer, kun som lagdelte faktorer for analyse af sammenhængen mellem miRNA polymorfier og sygdomsrisici. Univariate og multivariate overlevelse analyser blev udført ved log-rank test og Cox proportional hazards model. Overlevelseskurverne blev kortlagt ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden. Multivariat overlevelse analyse blev udført ved at tilsætte SNP til alle klinisk-patologiske parametre med

P

0,05. Desuden blev kopier af miRNA brugte lg værdi for en normalfordeling, og effekten af ​​miRNA polymorfier på dets udtryk niveauer blev testet af variansanalyse (ANOVA) test. Korrelationen af ​​lad-7a ekspression i serum og væv blev vist som korrelationskoefficient ved korrelationsanalyse. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS-version 16,0 software (SPSS, Chicago, IL, USA) og i screeningen fase, p-værdier 0,10 blev betragtet som signifikant, mens alle andre analyser blev anset p-værdier. 0,05 som signifikant

Resultater

Main effekt af miRNA polymorfier på mavekræft og atrofisk gastritis risiko

de genotypefrekvenser af den undersøgte SNP i screeningen etape blev vist i tabel 1 og elektroforetogram og sekventering tal på disse fire miRNA polymorfismer genotyper blev vist i supplerende Figur S1. PRI-lad-7f-2 rs17276588 blev udelukket fra yderligere analyse, fordi det afveg fra HWE. To SNPs blev anset promisingly at være forbundet med sygdomsrisici: de variant genotypefrekvenser af pri-lad-7a-1 rs10739971 mellem atrofisk gastritis og kontrolgruppen udviste statistisk forskel (27,1% vs. 13,7%,

P

= 0,018, tabel 1), og den variant genotypefrekvenser af pri-lad-7a-2 rs629367 mellem mavekræft og kontrolgruppen viste også forskel (1,9% vs.6.5%,

P

= 0,094, tabel 1) . Vi overvejede p værdi 0,10 så væsentlig og valgt denne to lovende SNP sites i den validerede fase

For at bekræfte sammenslutningen af ​​pri-lad-7a-1 rs10739971 og pri-lad-7a-. 2 rs629367 polymorfier med gastrisk cancer og /eller atrofisk gastritis risici, vi re-evalueret disse to SNPs i en anden 1949 sager i det udvidede valideret scenen. Frekvenserne af polymorfier i alle prøverne blev vist i supplerende Tabel S2. Sunde kontroller var frekvens matchet til mavekræft og atrofisk gastritis sager efter alder (± 5 år) og køn (01:01). Efter frekvens matching, blev kun 501 mavekræft og 501 kontroller for mavekræft risikoanalyse og 612 atrofisk gastritis og 612 kontroller for atrofisk gastritis risikoanalyse endelig inkluderet. I den udvidede validerede fase varianten genotypefrekvenser af pri-Lad-7A-2 rs629367 mellem mavekræft og kontrolgruppen var statistisk forskellige (6,4% versus 4,0%, tabel 1). Sammenlignet med det fælles AA-genotypen, blev varianten CC genotype forbundet med en 1,83-fold øget risiko for mavecancer (

P

= 0,048, 95% konfidensinterval = 1,01 til 3,32, tabel 1), og var også forbundet med en 1,86-gange forøget risiko for atrofisk gastritis (

P

= 0,032, 95% konfidensinterval = 1,06 til 3,28, tabel 1). Desuden blev varianten CC genotype forbundet med en 1,93-gange forøget risiko for atrofisk gastritis i forhold til (AA + AC) genotyper (

P

= 0,021, 95% konfidensinterval = 1,11 til 3,36, tabel 1) , Men vi ikke observere statistisk signifikant sammenhæng mellem pri-lad-7a-1 rs10739971 og sygdom risici i den validerede fase.

Stratificeret analyse og interation analyse

for yderligere at undersøge den potentielle indflydelse af alder, køn og miljømæssige faktorer som status for

H.pylori

infektion, rygning og alkoholindtagelse på genetisk effekt, vi udførte stratificerede analyser for pri-lad-7a-1 rs10739971 og pri-lad-7a-2 rs629367 polymorfier baseret på disse faktorer (tabel 2). Vi observerede forskellige virkninger af pri-lad-7a-2 rs629367 på sygdomsrisiko i forskellige undergrupper. Statistisk association mellem CC genotype og øget atrofisk gastritis risiko blev fundet hos kvinder (

P

= 0,025, OR [95% CI] = 2,59 [1,13-5,92]),

H. pylori

serologi-negative undergruppe (

P

= 0,036, OR [95% CI] = 1,97 [1,05-3,73]), og i ikke-drikke undergruppe (

P

= 0,023 ELLER [95% CI] = 2,44 [1,13-5,26]). Desuden blev CC genotype fundet at være associeret med øget gastrisk cancer risiko hos patienter med alder ≦ 50 år (

P

= 0,026, OR [95% CI] = 6,02 [1,24-29,10]) og

H. pylori

serologi-negative delpopulation (

P

= 0,036, OR [95% CI] = 2,02 [1,05-3,90]). Men når vi udførte interaktionsanalyse mellem rs629367 SNP og

H. pylori

infektion, rygning og alkoholindtagelse, blev der ikke statistisk interaktion effekt fundet (

P

interaktion = 0,786 og 0,382 henholdsvis se Supplerende tabel S3). Ingen signifikant sammenhæng blev fundet mellem pri-lad-7a-1 rs10739971 og mavekræft eller atrofisk gastritis risici i enhver stratificeret analyse.

Sammenhæng mellem pri-lad-7a-2 rs629367 polymorfi og clinicopathologic parametre og længden af ​​overlevelsen af ​​gastrisk kræftpatienter

på grund af den observation af statistisk signifikant sammenhæng mellem rs629367 og mavekræft og atrofisk gastritis risiko i de vigtigste effekt analyser og stratificerede analyser, vi yderligere undersøgt, om risikoen-associerede rs629367 korrelerer med den clinicopathologic fænotype og prognostisk overlevelse af gastrisk cancer. Resultaterne viste, at ingen signifikant korrelation af denne SNP blev fundet med klinisk-patologiske parametre, herunder tumorstørrelse, tumorplacering, BORRMANN typen, histologiske type, Lauren typen, TNM stadie, vækstmønster, dybde af invasion, lymfe metastase,

H.pylori

infektion status, rygning, alkohol, og familiens historie (

P

0,05, se supplerende tabel S4), men denne SNP blev fundet associeret med gastrisk overlevelse kræft. De CC genotype luftfartsselskaber viste ugunstig overlevelse (CC vs AA: 22,2 måneder vs 32,0 måneder) og øget HRs for mavecancerpatienter i univariat analyse (CC vs AA:

P

= 0,011, HR [95% CI] = 3,39 [1,33-8,65] CC vs AA + AC:

P

= 0,005, HR [95% CI] = 3,51 [1,45-8,49]; tabel 3 og figur 1-A og – B). Ved at justere flere klinisk-patologiske parametre, som var potentielle forstyrrende faktorer korreleret med gastrisk overlevelse kræft (

P

≤0.0001 for tumorstørrelse, BORRMANN type, TNM stadie, dybde invasion og lymfe metastase, se supplerende tabel S5), statistisk øget HRs blev også opnået for CC luftfartsselskaber i den multivariate analyse (CC vs AA:

P

= 0,004, HR [95% CI] = 4,48 [1,60-12,60] CC vs AA + AC:

P

= 0,001, HR [95% CI] = 4,69 [1,84-11,95], tabel 3)

A, CC vs AA.; B, CC vs AA + CA.

Sammenhæng mellem rs629367 og modne lad-7a udtryk i serum og gastrisk væv

For at studere den mulige mekanisme for rs629367 polymorfi relateret til mavekræft, vi yderligere undersøgt den modne lad-7a udtryk in vivo og in vitro. udvalgt til undersøgelsen af ​​ekspression i serum og væv Patienternes egenskaber blev vist i supplerende Tabel S6. I serum niveau stratificeret af forskellige sygdomme, fandt vi, at der i atrofisk gastritis gruppe, den modne Lad-7a udtryk for rs629367 AA, CA, CC genotype viste en tendens til gradvist stigende, og denne forskel havde en statistisk signifikans (3,30 ± 0,56 Vs . 3,52 ± 0,55 Vs. 3,76 ± 0,34,

P

= 0,043, tabel 4, figur 2-A). I vævsniveau, analyserede vi effekten på lad-7a SNP genotyper på sin modne lad-7a-ekspression i gastrisk cancer væv, og fandt rs629367 AA, CA, CC genotype viste også en tendens til gradvist stigende, selv om denne forskel ikke nåede statistisk betydning (tabel 4).

A, The lad-7a udtryk for forskellige genotype af pri-lad-7a-2 rs629367 i atrofisk gastritis gruppe i serumprøver. B. cellen modne lad-7a-ekspression transinfected af forskellige PRI-let-7a-2 rs629367 plasmid. *

P

. 0,001

Den modne Lad-7a udtryk for pCMV-MIR-pri-lad-7a-2 rs629367-A og C

først blev kandidatlandene cellelinjer sekventeret at genotype pri-let-7a-2 rs629367 websted og fundet, at disse kandidat cellelinjer var alle rs629367 vildtype (se supplerende figur S3). I vitro plan blev SGC-7901 og AGS cellelinier transinfected i to plasmider, pCMV-MIR-PRI-let-7a-2 rs629367-A og pCMV-MIR-PRI-let-7a-2 rs629367-C. Efter 72 timer modne lad-7a-ekspression havde statistisk signifikans i SGC-7901 cellelinje (

P

0,001, figur 2-B). Varianten C allel udtrykt en højere Lad-7a sammenlignet med den gamle A-allelen. Den AGS cellelinje fik ingen statistisk signifikans og kun gav tendens i overensstemmelse med SGC-7901 (se supplerende figur S4).

Diskussion

Baseret på forskellige undersøgelser vedrørende modne miRNA funktioner [30], det har været godt accepteret, at miRNA spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​cancer som en “oncogen” eller “tumorsuppressorgen” [31]. Men forholdet mellem miRNA varianter og kræftrisiko samt prognose brug, stadig at blive afklaret [32]. I den foreliggende undersøgelse, rapporterede vi, for første gang, distributions- frekvenser på fire miRNA tagSNPs (PRI-lad-7a-1 rs10739971, pri-let-7a-2 rs629367 og rs1143770, pri-let-7f-2 rs17276588) i Northern kinesisk. Vi yderligere valideret lovende polymorfi steder i uafhængig og udvidet prøver og fandt varianten CC genotype af pri-lad-7a-2 rs629367 øget risikoen for mavekræft og atrofisk gastritis til 1,83 og 1,86 gange, samt i forbindelse med en dårlig overlevelse af mavecancerpatienter. Vi nærmere effekten af ​​pri-lad-7a-2 rs629367 på sit udtryk og de mulige mekanismer, og anførte, at mekanismen kan på grund af den vekslen af ​​den modne Lad-7a udtryk, som i sidste ende kan ændre modtagelighed og prognosen for gastrisk kræft. Til vores viden, dette er den første rapport om forholdet af rs629367 SNP med modtagelighed og prognose af mavekræft.

Som vi ved, genetiske variationer, der opstår i miRNA gener inklusive deres pri- og pre-miRNA regioner ville have mulighed for at påvirke flere biologiske veje og indflydelse sygdomsforekomst [33]. Således kan pri- og pre-miRNA polymorfier anvendes som genetiske markører til forudsigelse af risiko for kræft [32], [34], som har flere fordele og styrker end kodning gen polymorfier på forudsige potentiale, fordi miRNA ofte placeret i cancer-associeret genomisk regioner [35], og kunne regulere næsten alle kodende gener [36]. For nylig, forskellige undersøgelser fokuseret på de pre-miRNA polymorfier placeret på hårnåle-, såsom pre-mir-196a2 rs11614913 [37], præ-mir-146a rs2910164 [38], præ-mir-499 rs3746444 [39], [40], pre-mir-149 rs2292832 [41], præ-mir-27a rs895819 [42]. På grund af kompleksiteten af ​​RNA plads struktur, var stigende opmærksomhed blevet betalt til SNP på PRI-miRNA. Det repræsentative pri-miRNA SNPs var pri-miR-185 rs2008591 forbundet med brystkræft [11], pri-miR-34b /c rs4938723 forbundet med hepatocellulær cancer [12], pri-miR-30c rs928508 [22] og pri-miR -938 rs2505901 [43], der er forbundet med mavekræft. Lad-7 familier var mest tidligere identificerede miRNA [4], og spiller en afgørende rolle i at opretholde den normale fysiologiske funktion af menneske. Ved at bruge NCBI bioinformatik-databaser, fandt vi 4 SNPs i det primære forløber område lad-7 familie (PRI-lad-7a-1 rs10739971, pri-lad-7a-2 rs629367 og rs1143770, pri-lad-7f-2 rs17276588) havde Mindre Allel Frekvens (MAF) 5% i kinesiske befolkning, som var alle tagSNPs men deres potentielle forudsige roller var uklare. I den foreliggende undersøgelse, ved screening og validering to faser undersøgelse vi først fundet, at blandt 4 tagSNPs, PRI-let-7a-2 rs629367 polymorfisme var forbundet med modtagelighed af gastrisk cancer (varianten CC genotype af PRI-let-7a-2 rs629367 øgede risikoen for mavekræft og atrofisk gastritis til 1,83 og 1,86 gange). Denne PRI-let-7a-2 rs629367 SNP blev placeret i nedstrøms 3′-UTR, som var den nærmeste SNP med de modne miRNA gener blandt de fire screening SNP’er, og det ville være en ny biomarkør forudsige gastrisk cancer risiko.

Vi yderligere udført univariate og multivariate Cox proportionel risiko regressions analyse af de opfølgende data til at udforske sammenslutninger af PRI-lad-7a-2 rs629367 SNP med samlet overlevelse af gastrisk kræftpatienter. Konsekvent signifikante resultater blev observeret fra univariate og multivariate Cox modeller (tabel 3). PRI-let-7a-2 rs629367 variant CC genotype bærere viste øget HR med en

P

-værdi på 0,011 (HR = 3,39) og 0,005 (HR = 3,51) sammenlignet med AA vildtype og AA + AC genotype henholdsvis univariat analyse. Fordi flere klinisk-patologiske parametre bidraget væsentligt til den samlede gastrisk overlevelse kræft (

P

≤0.0001 for tumorstørrelse, BORRMANN type, TNM stadie, dybde invasion og lymfe metastase), vi udførte analyse med justering for disse potentielle forstyrrende faktorer i den multivariate analyse. Til sidst fandt vi

P

-værdi af denne rs629367 SNP var mere markant og statistiske HRs blev også forøget (CC vs AA:

P

= 0,004, HR = 4,48; CC vs. AA + AC:

P

= 0,001, HR = 4,69, henholdsvis), hvilket tyder på, at PRI-lad-7a-2 rs628367 kan være en uafhængig risikofaktor for mavekræft prognose

Flere undersøgelser. afslørede, at miRNA polymorfier forringe miRNA forarbejdning og ekspression af modent miRNA og spille en rolle i carcinogenese [12], [33]. For at undersøge mulig mekanisme af rs629367-polymorfi forbundet med gastrisk cancer, i dette studie undersøgte vi virkningen af ​​PRI-let-7a SNP på det modne Lad-7a-ekspression både in vivo og in vitro. Controlling for sygdommen faktor, vi fandt i serum atrofisk gastritis gruppe, det modne lad-7a ekspression af rs629367 AA, CA, viste CC genotype en signifikant gradvist øge (

P

= 0,043, tabel 3). Dette kunne delvis forklare fænomenet at varianten CC genotype af rs629367 havde en højere fordeling frekvens i atrofisk gastritis gruppen end i kontrolgruppen (6,2% versus 3,9%, tabel 1). Forholdet af rs629367 CC genotype med øget atrofisk gastritis risiko indikerede, at denne SNP var forbundet med atrofisk gastritis og endog mavekræft eventuelt ved vekslen af ​​det modne miRNA ekspression, som derved påvirker modtagelighed for mavekræft. På grundlag af ekspressionsniveauet in vivo, vi yderligere konstrueret de udtrykte plasmid indeholdende PRI-let-7a-2 rs629367 vildtype A-allelen og variant C allel for at observere det modne lad-7a ekspression af de to forskellige alleler. Vi fandt, at efter transinfection, SGC-7901 celler, der indeholder pCMV-MIR-pri-lad-7a-2 rs629367-C-allelen demonstreret højere modne lad-7a udtryk end en allel (

P

0,001, Figur 1). Opnået fra vitro eksperiment resultat blev accordant med den vivo, hvilket også viser, at PRI-let-7a-2 rs629367 polymorfi kan påvirke modne Lad-7a-ekspression og ændre modtagelighed for mavekræft. Flere undersøgelser rapporteret, at lade-7a var tumorsuppressor [44], [45]. Vi spekuleret på, at variationen fra A til C might tab på valuta sin oprindelige funktion tumor undertrykke, som kunne ændre mavekræft modtagelighed og fører til dårlig overlevelse til prognose.

Gastrisk kræft er en multifaktoriel sygdom forårsaget af genetisk prædisposition såvel som miljømæssige faktorer [46]. For at undersøge den mulige indflydelse af alder, køn og miljømæssige faktorer som status for

H.pylori

infektion, rygning og alkohol drikke på genetisk effekt, vi yderligere analyseret virkningerne af mulige påvirkningsfaktorer på denne pri-let-7a -2 rs629367 SNP, og fandt PRI-lad-7a-2 rs629367 blev først forbundet med sygdom risici i

H. pylori

serologi-negative patienter gruppe og i ikke-drikke gruppe. I

H. pylori

serologi-negative patienter, den yderste periferi for sammenslutningen af ​​rs629367 SNP og atrofisk gastritis og gastrisk kræft risici forhøjede til at være 2.12 og 1,97 gange, hvilket var højere end den yderste periferi i hele tilfælde (1,83 og 1,86 gange, henholdsvis) . Der var imidlertid ingen statistisk signifikans i

H. pylori

serologi-positive patienter. Tilsvarende blev dette fænomen også observeret i den lagdelte analyse ved at drikke: i ikke-drikke gruppe, OR for sammenslutningen af ​​rs629367 SNP og atrofisk gastritis risiko ophøjet til at være 2,39 gange, mens der ikke var nogen statistisk signifikans i drikkevand gruppe. Dette kan skyldes, at

Helicobacter pylori

og drikke var forbundet med forekomsten af ​​mavekræft. Brenner et al.