PLoS ONE: Udvikling af en T-celle-receptor Målretning en HLA-A * 0201 Begrænset epitop fra Cancer-Testikel Antigen SSX2 for adoptiv immunterapi af Cancer

Abstrakt

Den kliniske succes adoptiv immunterapi af kræft er afhængig af udvælgelse af målantigener, der er meget udtrykt i tumorceller, men fraværende i essentielle normale væv. En gruppe af gener, der koder for cancer /testis eller cancer germlinie antigener er blevet foreslået som ideelle mål for immunterapi grund af deres høje ekspression i flere typer cancer og deres begrænsede ekspression i immunoprivileged normale væv. I det foreliggende arbejde beskrives isoleringen og karakteriseringen af ​​humane T-celle-receptorer (TCR’er) med specificitet for synovial sarkom X breakpoint 2 (SSX2), en cancer /testis antigen udtrykt i melanom, prostatacancer, lymfom, multipelt myelom og kræft i bugspytkirtlen, blandt andre tumorer. Vi isoleret syv HLA-A2-begrænsede T-cellereceptorer fra naturlige T-cellekloner afledt af tumor-infiltrerede lymfeknuder fra to SSX2-seropositive melanompatienter, og udvalgt fire TCR’er til kloning i retrovirusvektorer. Perifere blodlymfocytter (PBL) transduceret med tre af fire SSX2 TCR’er viste SSX2

41-49 (KASEKIFYV) peptidspecifik reaktivitet, tumorcelle genkendelse og tetramer binding. En af disse, TCR-5, udviste tetramer bindende i både CD4 og CD8 celler og blev valgt til yderligere undersøgelser. Antigen-specifikke og HLA-A * 0201-begrænset interferon-γ frigivelse, cellelyse og lymfocytproliferation blev observeret efter dyrkning af TCR manipuleret humant PBL med relevante tumorcellelinier. Kodonoptimering fandtes at stige TCR-5-ekspression i transducerede T-celler, og denne konstruktion er blevet udvalgt til udvikling af klinisk kvalitet virale vektor-producerende celler. Tumoren-specifikke mønster af udtryk for SSX2, sammen med potent og selektiv aktivitet af TCR-5, gør dette TCR en attraktiv kandidat til potentiel TCR genterapi til behandling af flere kræft histologier

Henvisning:. Abate-Daga D, Speiser DE, Chinnasamy N, Zheng Z, Xu H, Feldman SA, et al. (2014) Udvikling af en T-celle-receptor Målretning en HLA-A * 0201 Begrænset epitop fra Cancer-Testikel Antigen SSX2 for adoptiv immunterapi af kræft. PLoS ONE 9 (3): e93321. doi: 10,1371 /journal.pone.0093321

Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA

Modtaget: December 13, 2013; Accepteret: 4 mar 2014; Udgivet: 28 Marts 2014

Copyright: © 2014. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev delvist understøttet af et bidrag fra Milstein Family Foundation og af Intramural Research Program for center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda MD. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nylige fremskridt inden for tumor immunologi, har kræft genomforskning og genoverførsel teknologier tilladt udvikling af terapier baseret på adoptiv overførsel af autologe tumor-reaktive T-celler til behandling af humane maligniteter [1], [2 ]. Tumor-reaktive T-celler kan være naturligt, som i tilfældet med tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) oprenset fra resektion læsioner og stimuleret

ex vivo

, eller genereret ud fra perifert blod ved indføring af gener, der koder for immunreceptorer [3 ].

Mens den høje (50-70%) af objektive kliniske respons opnået af tIL behandling hos patienter med fremskreden fase melanom etableret et solidt proof of concept til behandling af human cancer med T-celler [4 ], [5], er dens udbredte anvendelse begrænset af vanskeligheden ved dyrkning og udvide disse T-celler til klinisk relevante tal for hver patient. Som en alternativ fremgangsmåde kan antigenet specificiteten af ​​let tilgængelige perifere blod-T-celler blive omdirigeret til antigener udtrykt i tumorceller ved genetisk modifikation. Adoptiv overførsel af autologe T-celler manipuleret til at udtrykke T-cellereceptorer (TCR’er) eller antistof-afledte kimære immunreceptorer kan resultere i en potent cellulært immunrespons mod væv som udtrykker mål-antigener, selv ved lave niveauer [3], [6] – [ ,,,0],8]. Det er derfor medvirkende omhyggeligt at udvælge antigener, som udtrykkes i tumorceller, men fraværende fra væsentlige normale væv, for at undgå uønskede on target /off-tumor toksiciteter.

Igangværende bestræbelser på at identificere de optimale målantigener for adoptiv immunterapi er hovedsagelig fokuseret på de neoantigener genereret af somatiske mutationer forekommer i tumorer, men fraværende i normale væv [9], [10], på antigener udtrykt på undværlige normale væv, og om en gruppe af gener, der koder for cancer-testis ( CT) antigener. Sidstnævnte er defineret ved deres mønster af udtryk, som i voksne, er generelt begrænset til ikke-MHC udtrykker kimceller testikel, der således ikke til stede antigener til T celler, og til tumorceller af forskellig oprindelse [11] – [13 ]. Adoptiv overførsel af autologe perifere blodlymfocytter udtrykker en TCR specifikt for en cancer-testis antigen, NY-ESO-1, medieret objektive tumorregressioner hos patienter med fremskreden melanom og med synovialcelle sarkom, uden NY-ESO-1 relateret toksicitet [14 ].

for at udvide det repertoire af antigener der kan målrettes ved denne fremgangsmåde, derfor udvide antallet af patienter og tumortyper, som kan behandles, udviklede vi en TCR-udtrykkende vektor målrettet mod et medlem af synovial sarkom X breakpoint familie, SSX2. De synovial sarkom X breakpoint (SSX) gener er placeret på X-kromosomet og koder for en familie af ti meget homologe kerneproteiner, SSX1-10. SSX2 blev oprindeligt identificeret som en del af et genomisk translokation stede i synovial sarkom [15], [16] og senere fundet at være identisk med HOM-MEL-40, et immunogent protein, som vides at inducere spontane antistofresponser hos 10% af patienter med melanom [17].

Vi genererede retrovirale vektorer, der koder TCR’en alfa- og beta-kæder er målrettet mod HLA-A * 0201-begrænset epitop SSX2

41-49, isoleret fra tidligere beskrevne melanompatienter viser aktiv immun reaktioner på SSX2 [18]. Vi endvidere vist, at T-celler manipuleret med disse vektorer genkende cellelinjer afledt fra flere kræft histologier. Optimering af TCR ekspression og aktivitet ved modifikation af dets nukleotidsekvens tilladt os at identificere den optimale design for effektiv ekspression og potent antigen-specifik reaktivitet mod SSX2. Produktion af en klinisk kvalitet retroviral vektor producent cellelinje blev videreført for dens fremtidige anvendelse i adoptiv immunterapi kliniske forsøg.

Materialer og metoder

cellelinjer og humane PBL’er

HLA-A * 0201 + /SSX2 + melanom cellelinje 624, og ikke-HLA-A * 0201-cellelinjer 888 og 938 blev etableret fra kirurgisk resektion metastatisk melanom tumorer og vedligeholdes på det Surgery Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health ( Bethesda, MD). HLA-A * 0201 + /SSX2 + gliom cellelinie U251 blev opnået fra afdelingen for kræftbehandling og Diagnose Tumor Repository, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Frederick, MD). Melanom linjer SKmel23 og SKmel37 og brystcancer MCF7 blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA). COS7-A * 0201 og 293-A * 0201-celler blev retroviralt manipuleret til at udtrykke HLA-A * 0201 som tidligere beskrevet [19], [20]. COS7-A * 0201-SSX2 og 293-A * 0201-SSX2-celler blev transduceret med en retroviral vektor, der udtrykker cDNA for SSX2. T2 er en lymfoblastoidcellelinie mangler TAP-funktion, hvis HLA klasse I proteiner kan let lastes med exogene peptider. PG13 emballage kloner blev dannet ved anvendelse af PG13 gibbonabeleukæmivirus pakning cellelinje (ATCC CRL-10686), og den humane ecotropiske pakning cellelinje, Phoenix ECO (venligst tilvejebragt af Dr. Hans-Peter Kiem, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle , WA). Alle celler blev dyrket i D10 medium bestående af høj-glucose (4,5 g /l), Dulbeccos modificerede essentielle medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone, Logan, UT) og 6 mM glutamin (slutkoncentration; Invitrogen, Carlsbad, CA). Celler blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2.

Perifere blodlymfocytter anvendt i denne undersøgelse blev opnået fra melanom patienter behandlet i Surgery Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health, på NCI Institutional Review Board-godkendt protokoller. Patienterne forudsat skriftligt samtykke til udtagning af væv og anvendelse af disse til forskningsformål, som nærmere beskrevet i protokol 03-C-0277. Humane lymfocytter blev opretholdt i AIM-V-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 5% humant AB-serum (Valley Biomedical, Winchester, VA), 50 U /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin (Invitrogen), og 300 IU /ml IL-2 og holdt ved 37 ° C med 5% CO2. SSX2 specifikke T-cellekloner var nyligt genereret fra tumor infiltreret lymfeknude-afledte T-celler fra patienter Lau 567 og Lau 672, på samme måde som tidligere beskrevet [18].

Syntetiske peptider

SSX2

41-49 peptid (KASEKIFYV) svarende til aminosyrerne 41 til 49 i SSX2, og homologe peptider afledt af SSX1 (KYSEKISYV), SSX3 (KVSEKIVYV), SSX4 (KSSEKIVYV), SSX5 (KASEKIIYV), SSX6 (KFSEKISCV), SSX7 (KSLEKISYV), SSX8 (KYSEKISYV), SSX9 (KSSEKIIYV), SSX10 (KASEKILYV), IGSF22 (KESAKIFYD), ARHGAP1 (KFGQKIFYV), GPR82 (SCYEKIFYG), PHF8 (LKGEKIFYL), LIPM (TGQEKIYYV), SYT14 (IVGEKIFYL), TCOF1 (KASEKILQV), RBL2 (SPREKIFYY) og FRAS1 (SPREKIYYV) blev syntetiseret ved genscript (Piscataway, NJ). Peptider blev opløst i DMSO og fortyndet i RPMI 1640 medium til lastning af T2-celler. Bindingsaffinitet til HLA-A2 * 0201 blev forudsagt for hvert peptid ved anvendelse NetMHC-3,0 [21]. Identifikation af peptider homologe til SSX2

41-49 med et potentiale for krydsreaktivitet blev udført ved blast søgning (BLASTP algoritme).

Konstruktion af retrovirale vektorer for ekspressionen af ​​SSX2-specifikke HLA-A * 0201-begrænsede TCR’er

MSGV1-baserede retrovirale vektorer blev konstrueret ved overlappende PCR med alfa- og beta-TCR-kæder, der er anbragt i følgende rækkefølge: TCR alpha-kæde, linkerpeptid furin-SGSGP2A, TCR beta-kæde som tidligere beskrevet [22]. De klonede TCR inserts blev verificeret ved restriktionsenzymanalyse profilering og direkte DNA-sekventering. CDNA kodende for codon-optimeret version af SSX2-specifikke TCR og et codon-optimeret TCR med murine konstante regioner blev syntetiseret af genscript. Det humane-muse hybrid version af TCR-5 blev konstrueret som tidligere beskrevet [23].

T-celle transduktion

Retrovirale supernatanter blev genereret ved transfektion hver pMSGV1-SSX2-TCR-plasmid sammen med en vektor, der koder RD114 konvolutten i 293-GP celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i Opti-MEM-medium (Invitrogen) [22]. Virale supernatanter blev derefter sat på RetroNectin-belagt (Takara Bio, Japan) ikke-vævskultur-behandlet seks-brønds plader. PBL’er blev stimuleret med OKT3 (50 ng /ml) og rhIL-2 (300 IU /ml) 48 timer forud for transduktion, og transduktionen blev udført som beskrevet tidligere [24].

Tetramerfarvning

HLA-A * 0201-begrænset SSX2-afledt peptid SSX2

41-49 (KASEKIFYV) blev produceret af National Institutes of Health Tetramer Core Facility ved Emory University (Atlanta, Georgien) hjælp phycoerythrin (PE) som fluorochromet. Ved evaluering af TCR transduktionseffektivitet i T-celle- delmængder blev transducerede T-celler farvet med et FITC-mærket anti-humant CD8 (BD Pharmingen, San Jose, CA) og med PE-mærket HLA-A * 0201 tetramerer. Celler blev analyseret ved hjælp af en FACScan flowcytometer med CellQuest software (BD Biosciences) eller FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR).

Cytokine release assay

TCR-transducerede lymfocytter blev testet for antigen -specifik reaktivitet i cytokinfrigørelse assays under anvendelse peptidbelastede T2-celler eller tumorceller. Til dette formål blev effektorceller og målceller samdyrket ved et 1:01 forhold (1 × 10

5 af hver) i 200 pi AIM-V-medium i dobbelte brønde i en 96-brønds mikroplade. Kultursupernatanter blev høstet 18-24 timer efter initieringen af ​​cokultur og analyseret for interferon-γ (IFNg) ved ELISA (Thermo Scientific).

[

51Cr] frigivelsesassay

evne transducerede PBL’er at lysere HLA-a * 0201 + SSX2 + tumorceller blev vurderet ved anvendelse af en [

51Cr] frigivelsesassay som beskrevet tidligere [25] Kort fortalt TCR-manipulerede PBL’er blev dyrket med faldende forhold af

51Cr-mærkede målceller (E: T-forhold) i AIM-V-medium i 96-brønds U-plader ved 37 ° C i 4 timer. Lysis blev målt ved [

51Cr] frigivelse i mediet efter formlen: procent lyse = (prøve release – minimum release) /(maksimal frigivelse – minimum release) x 100%. Resultater udtrykkes som gennemsnittet af dobbelte prøver.

Frembringelse af en PG13 emballage klon koder for en SSX2-specifik TCR

A PG13 retroviral pakningscellelinie klon blev frembragt som tidligere beskrevet med følgende ændringer [24] . Phoenix ECO-celler blev transficeret med 9,5 pg plasmid-DNA (pMSGV1-SSX2.567.5-co) under anvendelse af Lipofectamine 2000CD transfektionsreagens (LifeTechnologies, Carlsbad, CA). Efter 48 timer blev supernatanten høstet og anvendt til at transducere retroviral pakkende cellelinje, PG13. Ikke-vævskulturbehandlet 6-brønds plader coatet med 20 ug /ml RetroNectin som beskrevet af producenten. Retroviral vektor supernatant (4 ml) blev tilsat til hver brønd efterfulgt af centrifugering (2000 x g) ved 32 ° C. Efter 2 timer blev supernatanten fjernet og 5 × 10

5 PG13-celler blev tilsat til brønden, centrifugeret (1000 x g) i 10 minutter ved 32 ° C. To runder af transduktion blev udført, og derefter PG13 emballage kloner blev frembragt ved begrænsende fortynding kloning. På grund af manglende genetisk markør var høj titer kloner identificeret ved RNA dot blot som tidligere beskrevet [24], [26]. Retroviral vektor fra de 6 højeste titer kloner blev dannet som beskrevet. Kort fortalt, 175 cm

2 vævskulturkolber (Nunc, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) blev podet ved 4 × 10

4 celler /cm

2, efterfulgt af en medium udveksling (30 ml) på dag 3. Supernatanten blev høstet 24 timer senere, alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. Supernatant fra hver klon blev evalueret for evnen til effektivt at transducere humane PBL og fremkalde IFNg i en cytokinfrigørelse assay. En høj titer klon vil blive udvalgt til produktion af en mastercellebank og efterfølgende GMP retroviral vektor supernatant.

Generering af GMP retroviral vektor supernatant

I alt 26 1700 cm

2 udvidet overflade rulleflasker blev podet på dag 0 ved en celletæthed på 4 x 10

4 celler /cm

2 i 200 ml D10 medium. På dag 3 blev mediet udskiftet og erstattet med 120 ml D10 medium. Medium indeholdende den retrovirale vektor blev høstet dagligt med flasker bliver igen tilført 120 ml medium. Glucose niveauer blev overvåget dagligt bruger Roches Accu-kontrol-system (Roche, Basal, Schweiz). Hvis glucoseniveauer faldt til under 2 g /l blev volumenet af mediet udveksling fordoblet til 240 ml /rulleflaske for alle efterfølgende høst. Alle høst blev opdelt i portioner og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. En alikvot fra hver høst blev testet for transduktionseffektivitet og cytokinfrigørelse som tidligere beskrevet. Alle kliniske produkter blev udsat for et omfattende biosikkerhed testprogram efter gældende regulatoriske retningslinier (US Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, referencepunkter at overveje i produktion og test af nye lægemidler og Biologicals fremstillet ved rekombinant DNA-teknologi , 1985; punkter at overveje, i karakterisering af cellelinier anvendes til fremstilling Biologicals, 1993; Vejledning for Branche: Vejledning til human somatisk celleterapi og genterapi, 1998; Vejledning til industri, IND- – tilgange til Overholdelse CGMP løbet af fase i, 2006).

Resultater

Kloning af menneskelige SSX2-reaktivt TCR’er

De kodende regioner af TCR alfa- og beta-kæder blev klonet fra tidligere beskrevet naturligt forekommende SSX2-reaktivt T-celler fra to melanompatienter [18]. Disse HLA-A2-begrænsede CD8 celler genkender en epitop, der spænder over resterne 41 til 49. cDNA blev syntetiseret ved 5’RACE under anvendelse af primere specifikke for den konstante region af TCR-gener og de produkter blev sekventeret, identificere syv forskellige par TRAV og TRBV gener ( tabel 1). Ekspressionskassetter indeholdende alfa- og beta-TCR-kæder adskilt af 2A linkerpeptid [27], [28] blev dannet ved overlappende PCR og klonet ind på pMSGV1 til generering af retrovirale ekspressionsvektorer for kloner 5, 8, 9 og 11 ( figur 1A).

den kodende region af hver TCR alpha-kæden blev amplificeret ved PCR under anvendelse af primere flankeret af et Ncol restriktionssite i 5′-enden og en overhængende sekventering indeholdende grundstoffet i 3′-enden. Parallelt blev hvert TCR-beta-kæde amplificeret ved PCR under anvendelse af en fremadrettet primer indeholdende et 5′-overhæng, der overlapper med 3′-overhæng til stede i primeren anvendt til amplifikation af alfa-kæden. Den reverse primer anvendt til amplifikation af beta-kæden indeholdt et stopkodon og et

Eco

RI restriktionssted. I en anden runde af PCR, blev produkterne af alfa- og beta-kæde-amplifikationer samlet, og ligering af begge cDNA-fragmenter gennem de overlappende udhæng blev opnået ved PCR under anvendelse af eksterne primere. De resulterende PCR-produkter blev klonet i pMSGV1 vektor til retrovirus-produktion. LTR: lang terminal gentagelse, sd: splejsningsdonor-, sa: splejsningsacceptor, ψ:. Retrovirus indkapsling signal

Angivelse af klonede TCR’er i humane lymfocytter

retroviral vektor supernatanter blev dannet ved transient transfektion af 293GP og anvendt til transduktion af OKT3-stimulerede humane T-celler. Ekspression og korrekt samling af TCR’er blev vurderet ved flowcytometri under anvendelse af fluorescens-mærkede HLA-A2-SSX2

41-49 tetramerer. TCR5 blev udtrykt effektivt i både CD8 og CD4-celler, TCR9 og TCR11 blev kun udtrykkes i CD8 celler, medens ekspression af TCR8 ikke blev påvist ved denne teknik (figur 2 A).

A) Analyse af overfladeekspression af SSX2

41-49-specifikke TCR’er i CD8 og CD4 T-cellepopulationer ved flowcytometri. Humane mononukleære celler fra perifert blod blev stimuleret med OKT3 og transduceret med de angivne retrovirale ekspressionsvektorer. En uge senere blev celler farvet med anti-humane CD3, CD8 antistoffer og med en fluorescens-mærket tetramer indeholdende SSX2

41-49 peptid. Resultater fra et repræsentativt donor af mindst fire uafhængige forsøg. Begivenheder gated på lymfoide, enkelt, levedygtige, CD3 + celler. B) – D) Koncentration af IFNg i supernatanter af TCR-transducerede T-celler dyrket natten over med de angivne mål (1 × 10

5 effektorer vs 1 × 10

5 mål). Resultater er vist som gennemsnit af dubletter for to repræsentative donorer ud af fire. UT:. Untranduced

Reaktivitet PBL transduceret med humane anti-SSX2 TCR’er mod SSX2-positive tumorceller

Den korrekte behandling og præsentation af SSX2

41-49 epitop og anerkendelse af TCR-manipuleret PBL blev testet in vitro ved dyrkning af PBL med derivater af COS-7 og HEK293-celler, som udtrykker HLA-A * 0201 med eller uden samtidig ekspression af antigenet SSX2 (Cos-A2, Cos-A2 SSX2 , 293-A2 og 293-A2 SSX2, henholdsvis). Som vist i figur 2B, T-celler transduceret med TCR-5, -9 og -11 udskilte høje niveauer af IFNg (i størrelsesordenen 1 × 10

4 pg /mL) når samdyrket med SSX2-transfektanter. TCR-8-transducerede T-celler udskilte kun baggrundsniveauer af IFNg, i overensstemmelse med manglen på tetramer binding vist i figur 2A. For at kontrollere HLA-A * 0201 begrænsning af disse TCR, en SSX2-positive HLA-A * 0201-negative melanom cellelinie (938) eller derivat manipuleret til at udtrykke HLA-A * 0201 (938-A2) blev anvendt som mål for cokultur eksperimenter. Som vist i figur 2C, lymfocytter, som udtrykker TCR-5, -9 og -11 udskilt IFNg kun når de dyrkes i nærvær af 938-A2-celler. Anerkendelse af 938-A2 endogen SSX2 var stærkere i TCR-5-transducerede lymfocytter, som det fremgår af en 2 gange højere IFNg sekretion af disse celler sammenlignet med den af ​​T-celler transduceret med TCR-9 og -11 (figur 2C).

for at teste evnen af ​​disse TCR til at genkende den endogene SSX2 udtrykt af tumorceller, vi dyrkes PBL’er (transduceret med TCR-5, -8, -9, -11) med cellelinjer afledt af melanom (888, SKMEL-23, 624), gliom (U251), og brystcancer (MCF-7). Som vist i figur 2D, TCR-5, -9 og -11 medieret IFNg frigivelse ved transducerede lymfocytter ved dyrkning i nærværelse af HLA-A * 0201-positive SSX2-positive tumorceller fra gliom og melanom. Notatet TCR-5 formidlede den stærkeste målet anerkendelse blandt de forskellige TCR testen. Baseret på dette, og på dens effektive udtryk i både CD8 og CD4 T-celler, valgte vi TCR-5 for yderligere karakterisering.

krydsreaktivitet med andre medlemmer af SSX familien og ikke-SSX proteiner

SSX-familien omfatter 10 gener, der koder proteiner, som er stærkt homologe med hinanden. Især epitopen af ​​SSX2 målrettet efter TCR-5 ligger inden for et af områderne af homologi mellem familiemedlemmer. Som vist i figur 3A, aminosyresekvensen af ​​SSX5 og SSX10 forskellige fra SSX2

41-49 i kun en rest; SSX1, SSX3, SSX4, SSX8 og SSX9 forskellige fra SSX2

41-49 i to aminosyrer; og SSX6 og SSX7 adskiller sig fra SSX2

41-49 i tre aminosyrer. Foruden SSX2, blev SSX3 og SSX5 forudsagt at binde HLA-A2-molekyler med høj affinitet. Peptider afledt af SSX4, SSX7, SSX9 og SSX10 blev forudsagt at binde til HLA-A2 med lavere affinitet. Reaktivitet af TCR-5 for hver af disse peptider blev testet i cokultur eksperimenter under anvendelse af humane lymfocytter, som udtrykker TCR-5 som effektorer og peptid-pulserede T2-celler som mål, og sekretion af IFNg blev vurderet som en markør for antigengenkendelse. Mens TCR-5-udtrykkende celler udskilte IFNg ved eksponering for SSX2

41-49 ved lav koncentration af peptid ( 0,01 ng /ml), de reagerede på SSX3-, SSX4-, SSX5-, SSX9- og SSX10- afledte peptider kun når de udsættes for høje koncentrationer af peptid (over 10 ng peptid /ml, figur 3 A). Denne forskel i reaktivitet på tre til fire størrelsesordener indikerer, at TCR-5 er relativt specifikt for SSX2

41-49, og foreslår, at anerkendelse af celler, der udtrykker homologe peptider afledt fra andre SSX gener kan være usandsynligt.

Perifere blod-T celler, der udtrykker TCR-5 blev dyrket sammen natten over med T2-celler, der tidligere pulseret med de serielle fortyndinger af de viste peptider. Resultater af IFNg koncentration i kultursupernatanterne er udtrykt som gennemsnit af dubletter i et repræsentativt eksperiment. Sekvensalignment af de testede peptider er vist i figuren legenden til A) SSX-familien gener og b) ikke-SSX-gener med overlappende sekvenser. IGSF22: immunglobulin 22, ARHGAP1: Rho GTPase-aktiverende protein 1, GPR82: Sandsynlig G-protein koblet receptor 82, PHF8: histon lysin demethylase PHF8, LIPM: lipase medlem M, SYT14: synaptotagmin-14, TCOF1: sirup protein, RBL2: retinoblastoma-lignende protein 2, FRAS1: ekstracellulært matrixprotein FRAS1. Forudsigelse af bindingsaffinitet til HLA-A2 * 0201 er vist for hvert peptid, udtrykt som dissociationskonstant (K

D, nM).

Ni yderligere protein-kodende gener blev identificeret ved BLAST-søgning som delvist homolog med SSX2

41-49 epitop: IGSF22, ARHGAP1, GPR82, PHF8, LIPM, SYT14, TCOF1, RBL2 og FRAS1. De overlappende peptider i to af disse proteiner, IGSF22 og TCOF1, afveg i kun to rester fra den målrettede SSX2 epitop. Desuden blev peptider afledt af SYT14 og TCOF1 forudsiges at være stærke og svage HLA-A2 bindemidler, henholdsvis (figur 3b). Vi analyserede anerkendelsen af ​​disse nonamere peptider ved TCR-5 i cokultur eksperimenter ved hjælp peptid-pulserede T2 celler. Som vist i figur 3B, IFNg frigivelse induceret af SSX2

41-49 peptid var to til fire størrelsesordener bedre end induceret af de homologe peptider, hvilket bekræfter specificiteten af ​​TCR-5.

kodonoptimering og murinization af TCR-5

Vi næste vurderet, om optimering af kodonanvendelse i den kodende sekvens af TCR-5 og /eller anvendelsen af ​​humant-muse hybrid TCR’er kan forbedre TCR-5-ekspression og /eller biologisk aktivitet . cDNA, der koder for den samme aminosyresekvens som TCR-5, men med en nukleotidsekvens optimeret til kodonanvendelse hos mennesker blev syntetiseret og klonet i pMSGV1 til generering af retrovirale vektorer. Tilsvarende vil en codon-optimeret version af TCR-5, ved hvilken TCR konstante områder blev erstattet med den konstante region af et muse TCR [23] blev syntetiseret og klonet i pMSGV1. De tre versioner af TCR-5 (WT, codonoptimeret, og codon optimeret + mus konstant region, figur 4A) var næste sammenlignet i deres udtryk og evne til at genkende antigen og mægle cellelysis.

A) Skematisk fremstilling af de tre konstruktioner genereret for ekspressionen af ​​TCR-5 og derivater. LTR: lange terminale gentagelse, sd: splejsningsdonor, sa: splejsningsacceptor, ψ: retrovirus encapsidation signal, MC: muse TCR konstant region, 2A: linkerpeptid. B) Analyse af ekspressionen af ​​TCR-5 varianter af tetramerfarvning. OKT3-stimulerede lymfocytter blev transduceret to gange med den tilsvarende TCR-udtrykkende vektor og farvet med anti-CD3, anti-CD8 og SSX2

41-49 tetramerer en uge efter transduktion. Repræsentative resultater fra tre uafhængige eksperimenter. Værdier i parentes repræsenterer den gennemsnitlige fluorescensintensitet af tetramerfarvning i CD8 T-celle population. C)

51Cr-frigivelsesassay til evaluering af antigen-specifik cytolyse induceret af TCR-5-transducerede lymfocytter efter fire timers cokultur med de angivne målceller. Procentdel af lysis afbildet for hvert mål cellelinie ved forskellige effektor: mål-forhold er gennemsnittet af duplikater i et repræsentativt eksperiment af tre uafhængige forsøg. UT: utransducerede T-celler, der anvendes som negativ kontrol af uspecifik lyse, WT: Wild-typen TCR, Co Op: copon-optimeret TCR, MCR:. Codon-optimeret TCR med musen konstant område

Efter retroviral transduktion af OKT3-stimulerede humane lymfocytter blev tetramerfarvning anvendt til at evaluere ekspressionen af ​​de tre konstruktioner. Som vist i figur 4 B, kodonoptimering steg tætheden af ​​membranen ekspression af TCR i CD8 T-celler som påvist ved en forøget gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) på SSX2

41-49 tetramerfarvning i celler transduceret med den codon-optimerede TCR-5 (910 fluorescensenheder), sammenlignet med dem transduceret med vildtype-version (656 fluorescensenheder). Men anvendelsen af ​​en murin konstant region i tilsætning af kodonoptimering kun minimalt forøget tetrameren binding af TCR (949 fluorescensenheder). Den biologiske aktivitet af T-cellereceptorer blev testet i cokultur eksperimenter, hvor de TCR-transducerede lymfocytter blev udsat for gentagne HLA-A * 0201-positive målceller, der var positive for SSX2 (Cos-A2-SSX2, 293-A2-SSX2, K562- A2, 624, 938-A2 og U251). Koncentrationen af ​​IFNg i supernatanterne blev målt ved ELISA efter en nats cokultur, og resultaterne er vist i tabel 2. Lymfocytter transduceret med den codon-optimerede version af TCR-5 udskilt i gennemsnit 30% mere IFNg end dem transduceret med den vildtype TCR. Tilstedeværelsen af ​​en mus TCR konstant region steg også IFNg sekretion sammenlignet med vildtype TCR, men denne modifikation forøgede ikke IFNg sekretion af codon-optimerede variant (tabel 2). De tre konstruktioner viste lignende egenskaber med hensyn til induktion af antigenspecifik proliferation af T-celler i thymidinoptagelse-assays (figur S1A), T-celle-aktivering ved antigengenkendelse (vist ved opregulering af aktiveringen markør CD137, figur S1B) og interleukin -2 (IL-2) produktion (figur S1c).

Induktion af celle lysis af tumorceller, der udtrykker SSX2

evnen af ​​hver variant af TCR-5 til at inducere antigen- specifik cellelyse af tumortargets ved humane lymfocytter blev bestemt under anvendelse af et chromfrigivelsesassay. Chrom (

51Cr) -mærkede 938, blev 938-A2, Cos-A2, Cos-A2-SSX2, 624, SKmel37 og 888 celler dyrket sammen med humane perifere blod-T-celler transduceret vildtype TCR-5 eller dens codon -optimized eller codon-optimeret murinized varianter, ved forskellige effektor: mål-forhold. Utransducerede T-celler blev anvendt som negativ kontrol. Som afbildet i figur 4 C, lymfocytter transduceret med en af ​​SSX2

41-49-specifikke TCR’er inducerede potent cytolytisk virkning på 938-A2-celler, men ikke på 938 celler, hvilket viser, at lysis er HLA-A * 0201-begrænset. Desuden blev Cos-A2-SSX2 celler lyseret ved TCR-5-udtrykkende celler, men ikke Cos-A2, som mangler ekspression af SSX2, hvilket indikerer, at denne virkning er antigen-specifik. Ligeledes 624 og SKmel37 celler, som er HLA-A * 0201 positiv og naturligt udtrykker SSX2, blev lyseret ved lymfocytter transduceret med enten TCR-5-variant, hvorimod HLA-A * 0201-negative 888 celler ikke var. Samlet set viser disse resultater bekræfter, at TCR-5-afledte konstruktioner er biologisk funktionelt i humane perifere blod-T-celler, og at de kan anvendes til at omdirigere deres antigenspecificitet til SSX2, i en HLA-A * 0201-specifik måde. Hverken kodonoptimering eller murinization af TCR havde en effekt på TCR-5-medieret lyse.

Udvikling og afprøvning af klinisk kvalitet retroviral vektor supernatanter

På grund af tumor-selektive mønster af udtryk for SSX2 og de potente endnu selektive antigen-genkendelse egenskaber af TCR-5, besluttede vi at fremstille og teste klinisk kvalitet retrovirale vektorer er egnede til ekspression af TCR-5 i perifere blod-T-celler fra cancerpatienter. Stabile pakkelinier blev indført ved transduktion af PG13-celler med en retroviral vektor kodende for codon-optimeret version af TCR-5. Efter to transduktioner blev PG13-celler klonet ved begrænsende fortynding, og kloner blev testet for viral RNA-ekspression ved anvendelse af dot-plot (ikke vist). De seks kloner, der udtrykker de højeste niveauer af vektor-RNA (A8, A10, C3, D8, F2 og H2) blev amplificeret, og supernatanterne blev testet for deres evne til at inducere TCR ekspression i OKT3-stimulerede PBL fra tre forskellige donorer. Tetramerfarvning af transducerede T-celler afslørede, at supernatanter af de seks kloner medieret effektiv transduktion af lymfocytter (figur 5 A).