PLoS ONE: MicroRNA-18a Dæmper DNA Damage Repair gennem undertrykkelse af ekspressionen af ​​Ataksi Telangiectasia muteret i kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

MIR-18a er en af ​​de mest up-regulerede miRNA i tarmkræft (CRC) baseret på miRNA profilering. I denne undersøgelse undersøgte vi den funktionelle betydning af miR-18a i CRC.

Metoder

Angivelse af miR-18a blev undersøgt i 45 CRC patienter. Potentielle målgener af miR-18a blev forudsagt af

i silico

søge og bekræftet af luciferaseaktivitet assay og Western blot. DNA-skader blev målt ved komet assay. Gene-funktion blev målt ved cellelevedygtighed, kolonidannelse og apoptose analyser.

Resultater

opregulering af miR-18a blev valideret og bekræftet i 45 primære CRC tumorer sammenlignet med tilstødende normale væv

(

p

0,0001). Gennem

i silico

søgning, 3’UTR af

Ataxia telangiectasia muteret (ATM)

indeholder en bevaret miR-18a bindingssted. Ekspression af ATM blev nedreguleret i CRC tumorer (p

0,0001) og omvendt korreleret med miR-18a-ekspression (r = -0,4562, p

0,01). Over-ekspression af MIR-18a i colon cancerceller væsentligt reduceret luciferaseaktiviteten af ​​konstruktionen med vildtype-ATM 3’UTR men ikke at med mutant ATM 3’UTR, udlede en direkte interaktion mellem MIR-18a med ATM 3’UTR . Dette blev yderligere bekræftet af nedregulering af ATM protein ved miR-18a. Som ATM er et nøgleenzym i DNA beskadigelse reparation, vi evaluerede effekten af ​​MIR-18a på DNA dobbelt-strengbrud. Ektopisk udtryk for miR-18a signifikant hæmmede reparation af DNA-skader fremkaldt af etoposid (p

0,001)., Hvilket fører til ophobning af DNA-skader, stigning i celle apoptose og dårlig klonogen overlevelse

Konklusion

mIR-18a dæmper cellulære reparation af DNA dobbelt-streng pauser ved direkte at undertrykke ATM, et nøgleenzym i DNA-skader reparation

Henvisning:. Wu CW, Dong YJ, Liang QY, Han xq, Ng SSM, Chan FKL, et al. (2013) MicroRNA-18a Dæmper DNA Damage Repair gennem undertrykkelse af ekspressionen af ​​Ataksi Telangiectasia muteret i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (2): e57036. doi: 10,1371 /journal.pone.0057036

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: November 15, 2012; Accepteret: 16 Januar 2013; Publiceret: 21 feb 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev understøttet af en National Natural Science Foundation of China (NSFC) (Project kode 81.101.488), en Kina 863 program (2012AA02A506) og Hongkong ITF fond (ITS /276/11). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

miRNA er 18- til 25-nucleotid ikke-kodende RNA-molekyler, der regulerer mRNA-translation. De udøver virkningerne ved at målrette RNA-inducerede silencing kompleks (RISC) til komplementære sites i 3′-utranslaterede region (UTR) af deres målgener [1]. Binding af en miRNA-loaded RISC til en komplementær sekvens giver anledning til enten translationel undertrykkelse eller henfald af det målrettede [2] mRNA. Gennem dette, miRNA regulere en række cellulære processer, herunder apoptose [3], [4], differentiering [5] og celleproliferation [6]. Altered miRNA udtryk profiler blev fundet i de fleste tumor typer, herunder kolorektal cancer (CRC) [7], [8], [9], [10]. Manipulation af specifikke miRNA fandtes at være i stand til at modulere tumorudvikling i dyremodel [6], [11], [12]. Tidligere gennem profilering udtryk for 667 miRNA i humane kolorektal cancer væv, vi identificeret miR-18a som en af ​​de mest up-regulerede miRNA i humant CRC [13]. kan påvises Et højt niveau af miR-18a i afføringen af ​​CRC patienter sammenlignet med personer med normal koloskopi. Ved fjernelse af tumoren, afføring niveau af MIR-18a faldet betydeligt [13].

MIR-18a tilhører MIR-17-92 klynge, som er placeret på kromosom 13q31.1 regionen. Den onkogene rolle MIR-17-92 klynge er veldokumenteret. Over-ekspression af klyngen er forbundet med accelereret tumorvækst [6] og celleproliferation [14]. Kromosomalt kopital tilvækst ved MIR-17-92 klynge region var forbundet med den neoplastiske progression fra adenom til carcinom [15]. Høj ekspression af MIR-18a er blevet impliceret i brystcancer [16], blærecancer [17] og pancreascancer [18]. Men fortsat uklart den funktionelle rolle af miR-18a i CRC. I denne undersøgelse, vi havde til formål at identificere sit mål gen og dets afgørende rolle i CRC.

Metoder og Materialer

humant væv Prøver

Rektal tumor og tilstødende ikke-tumor-væv blev opnået fra 45 patienter med histologisk bekræftet endetarmskræft, da de blev opereret på Prince of Wales Hospital, Hongkong i 1999 til 2003. Normal rektal slimhinde blev opnået fra raske kontroller under koloskopi på Prince of Wales Hospital i 2009. Alle emner forudsat at deres skriftligt informeret samtykke inden prøvetagning. Proceduren Undersøgelsen protokol og samtykke blev godkendt af den etiske komité i Den kinesiske University of Hong Kong.

cellekultur miRNA prækursorer og transfektion

CRC cellelinjer HCT-116 og HT-29 var vedtaget for

in vitro

analyser, fordi disse to cellelinjer udtrykker funktionel ATM i respons på DNA dobbelt-strenget pause (DSBs) [19], [20]. Begge cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection og dyrket i McCoys 5A-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 5% CO

2 ved 37 ° C. Precursoren for MIR-18a (præ-MIR-18a) og en negativ kontrol (præ-MIR-ctrl) blev indkøbt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). Transfektion blev udført ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til producentens vejledning.

Dual-luciferase Reporter Assay

Den potentielle miR-18a bindingssted i ATM 3 ‘untranslation region (3’UTR) blev forudsagt af Targetscan (www.targetscan.org) og Miranda (www.microRNA.org). Sekvenser med vildtype eller mutante frø regioner blev klonet ind pMIR-RAPPORT luciferase vektor (Applied Biosystems). Mutanten ATM 3’UTR-sekvens blev fremstillet ved at mutere 5 nukleotider i frøet region. De syntetiserede oligoer blev vist som følger:

Vild type sense-strengen:

5′-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTGCACCTTAATGAAATTATCGAGCT-3 ‘

Wild-typen anti-sense-streng:.

5′-CGATAATTTCATTAAGGTGCAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 ‘

Mutant sense-streng:.

5′-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTTCGTATCAATGAAATTATCGAGCT-3′

Mutant anti-sense-streng:.

5′-CGATAATTTCATTGATACGAAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 ‘.

cellelinjerne forbigående transficerede med præ-mIR-18a eller præ-miR negativ kontrol (ved 15 nM slutkoncentration) i 24-brønds plader blev co- transficeret med

Renilla

luciferase rapport vektor (195 ng /brønd) og

Firefly

luciferase vektor (5 ng /brønd) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Celler blev høstet 48 timer efter transfektion og luciferaseaktiviteter blev analyseret af dual-luciferase reporter assaysystem (Promega, Madison, WI).

miRNA Kvantificering ved kvantitativ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) af individuelle miRNA blev udført under anvendelse af TaqMan miRNA revers transkription kit (Applied Biosystems) og TaqMan humane miRNA assay (RNU6B: 001.093; mIR-18a: 002.422; mIR-16: 000.391) baseret på en modificeret protokol fra Applied Biosystems [21]. miRNA ekspressionsniveauet blev normaliseret til den interne kontrol. Eksperimentet operatører var uvidende om de kliniske data på det tidspunkt, kvantificering af miRNA blev udført.

QRT-PCR for mRNA

For ATM mRNA kvantificering, total RNA blev revers transkriberet med tilfældig primer ved hjælp Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), og real-time PCR blev indstillet med Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). ATM ekspression blev normaliseret til glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) Primersekvenser er som følger: ATM: Fremad: 5′- GGAGAGCTGGAAAGCATTGG-3 ‘; Omvendt: 5’TGAGAAGCTGGGAGTGTTTCTG-3 ‘. GAPDH: Forward: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ‘Reverse: 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

Western blot-analyse

Samlet protein blev udvundet og proteinkoncentrationen blev målt ved Bradford DC-proteinet. assay (Bio-Rad, Hercules, CA). 20 til 40 pi af protein fra hver prøve blev separeret på 8% Bis /Tris-polyacrylamidgel gennem elektroforese og blottet på nitrocellulosemembraner (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Blots blev immunfarvet med primære antistoffer ved 4 ° C natten over og sekundært antistof ved stuetemperatur i 1 time. Anti-ATM (2C1) antistof blev købt hos Genetex (Irvine, CA). Anti-phospho-Checkpoint kinase 2-antistof (Thr68) blev købt hos Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-GAPDH (SC-25.778) antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Comet assay

HCT-116-celler blev transient transficeret med præ-MIR-18a eller præ-miR negativ kontrol (ved 15 nM slutkoncentration) i 24-brønds plader. Efter en times inkubation med 2 pM etoposid eller DMSO blev cellerne enten høstet eller skiftet til medium uden etoposid i 2 timer for at tillade DNA-beskadigelse reparation. Ved slutningen af ​​forsøget blev cellerne høstet til komet assay ifølge producentens vejledning (Trevigen, Gaithersburg, MD). De hale øjeblikke af cellen kometer blev analyseret automatisk ved hjælp af en komet analysesoftware, CometScore (Tri Tek Corp, Sumerduck, VA). Tail øjeblikke af 50 eller flere celler pr dias blev bestemt.

Colony Dannelse og Cell levedygtighed Assay

Celler (1 x 10

5 per brønd) blev forgyldt med en 24-brønds plade og transficeret med præ-mIR-18a eller præ-mIR-ctrl ved 15 nM. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler inkuberet med 2 pM etoposid eller DMSO i 1 time, opsamles og podes (500-1000 /brønd) i en frisk 24-brønds plade i 9 dage. Kolonier blev talt efter farvning med

Harris hematoxylin

løsning. Cellelevedygtighed blev bestemt ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (Promega) ifølge producentens vejledning. Kort beskrevet MTT-opløsning blev tilsat til hver brønd ved en slutkoncentration på 1 mg /ml per brønd, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 3 timer. Efter inkubering blev 200 pi DMSO tilsat til hver brønd for at opløse formazan dannet, og absorbansen blev aflæst ved 570 nm med et spektrofotometer. Alle eksperimenter blev triplikerede.

Annexin V Apoptose Assay

Celler (1 x 10

5 per brønd) blev podet i en 24-brønds plade og transfekteret med præ-MIR-18a eller præ-mIR-ctrl ved 15 nM. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler inkuberet med 2 pM etoposid eller DMSO i 1 time. Apoptose blev vurderet ved flowcytometri efter farvning med Annexin V (FITC-konjugeret) (BD Biosciences, Erembodegem, Belgien) og 7-amino-actinomycin (7-AAD, BD Biosciences)

Statistik

associering mellem mIR-18a og ATM-ekspression blev analyseret ved Spearman R korrelation test. Forskel mellem to grupper i luciferase reporter assay blev comet assay og kolonidannelse assayet bestemt ved student t-test. Sammenslutninger af miR-18a ekspressionsniveauet med klinisk-patologiske træk blev analyseret ved Fisher eksakt test. Regressionsanalyse blev analyseret ved SPSS (IBM, New York, USA). Forskel i celle vækstkurver blev bestemt ved gentagne målinger ANOVA. Progressionsfri overlevelse analyse blev udført af Kaplan-Meier-metoden, og resultaterne blev testet under anvendelse af log-rank test. p 0,05 blev taget som statistisk signifikans. Alle statistiske tests undtagen regressionsanalyse blev udført af Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

Resultater

miR-18a er opreguleret i Rektal Tumor

Blandt de 45 par af rektale cancer vævsprøver, 44 par havde højere mIR-18a ekspression i tumor end i det tilstødende normale væv (p 0,0001, figur 1A), med en median forskel på 11,46 gange stigning (IQR 4.73- 26,00). En høj ekspression af miR-18a i tumor var forbundet med højere recidivraten, hvoraf 9 ud af 15 tilfælde med høj tumor miR-18a gentog sig i forhold til kun 6 ud af 29 tilfælde med lav tumor miR-18a gentog sig efter kirurgisk resektion (p 0,0001, figur 3C). Den relative luciferase aktivitet af vildtype-konstruktionen ifølge ATM 3’UTR i HCT-116 blev signifikant reduceret i nærvær af MIR-18a (p 0,001; Mann-Whitney-test), mens en sådan undertrykkende virkning af MIR-18a på luciferaseaktiviteten blev ikke observeret i tilstedeværelse af mutant ATM 3’UTR (figur 3D), hvilket indikerer en direkte og specifik interaktion af miR-18a på ATM 3’UTR. Interaktionen blev yderligere bekræftet af den iagttagelse, at overekspression af miR-18a var i stand til at reducere ATM proteinniveau og phosphorylering af Checkpoint kinase (CHK-2), en direkte downstream fosforylering mål for ATM

in vitro

(figur 3E). Under etoposid behandling i 1 time, pCHK-2-niveau var signifikant opreguleret uanset miR-18a overekspression.

(A) miR-18a tilpasning (understreget) i ATM 3’UTR forskellige arter er konserveret. (B) Modent humant MIR-18a sekvens og region af 3′-UTR af human ATM indeholdende genkendelsesstedet, som blev klonet i en konstruktion med

Renilla

luciferase. Mutanten 3′-UTR indeholder et frø region med 5 muterede nucleotider (understreget). (C) Ekspression af MIR-18a i HCT-116-celler transficeret med miRNA precursor kontrol (præ-MIR-ctrl) eller MIR-18a precursor (pre-MIR-18a) ved 15 nM. (D) Luciferaseaktivitet i HCT-116-celler co-transficeret med

Renilla

luciferase-konstruktion (indeholdende vildtype eller mutant MIR-18a frø region),

Firefly

luciferase-konstruktion og præ-miR- ctrl eller præ-mIR-18a på 15 nM. Niveau af aktivitet blev beregnet ved at normalisere

Renilla

luciferase til

Firefly

luciferase. NS angiver ingen statistisk signifikans. p-værdien blev bestemt ved Student t-test. Middelværdi og standardafvigelse (SD) blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg. (E) Immunoblot af endogen ATM ekspression i HCT-116-celler 48 timer efter transfektion af præ-MIR-ctrl og præ-MIR-18a. (F) Immunoblot af den phosphorylerede form af CHK-2-protein, en direkte nedstrøms target i ATM, i HCT-116-celler, efter transfektion af præ-MIR-ctrl eller præ-MIR-18a under behandling med DMSO eller 2 pM etoposid i 1 time.

ATM nedreguleres i rektal tumor og CRC cellelinier

ATM udtryk blev evalueret i 45 par af rektal tumor og tilstødende normale væv. I modsætning til MIR-18a, ekspression af ATM var signifikant lavere i tumorer end i ikke-tumorvæv (p lt; 0,0001; figur 1b), med en median forskel på 0,369-fold (IQR 0,127-0,575). Ekspression af MIR-18a og af ATM blev omvendt korreleret med en spearman r = -0,4562 (p 0,01, figur 1C). Den afvigende nedregulering af ATM blev også observeret i CRC cellelinjer sammenlignet med de normale colon biopsier (p 0,05, figur 1D).

miR-18a Regulerer Dobbelt-DNA Damage Recovery

ATM aktivering repræsenterer en tidlig og vigtig begivenhed for DNA-reparation i respons til DNA DSBs [24]. Som miR-18a er i stand til at undertrykke ATM udtryk, hypotesen vi overekspression af miR-18a i celler ville hæmme opsvinget mekanisme. Niveauet af DSB’er blev undersøgt ved komet assay. Uden induktion af DNA-skader, HCT-116 celler havde en baseline hale øjeblik af 7,75 ± 4,37 enheder. Udsættelse for 2 pM etoposid i 1 time resulterede i en signifikant højere hale øjeblik (15,46 ± 6,07 enheder, s 0,0001), hvilket indikerer induktionen af ​​DNA DSB’er ved etoposid. Når tilladt for 2 timer i normal medium suppleret med 10% FBS til nyttiggørelse, hale øjeblik af etoposid behandlet HCT-116 celler gendannet til baseline niveau (7,69 ± 5,14 enheder), mens hale øjeblik af HCT116 celler overudtrykker miR-18a forblev signifikant højere end baseline niveau (p 0,001), hvilket indikerer miR-18a inducerede en effekt af at forbyde DNA-reparation (figur 4)

(A) tidslinjen i størrelsesordenen behandling (B) prøver af komet haler fra. hver gruppe, fra venstre mod højre, celler transficeret med miRNA kontrol precursor (pre-mIR-ctrl) og uden lægemiddelbehandling, celler transficeret med præ-mIR-ctrl og behandlet med 2 pM etoposid, celler transficeret med præ-mIR-ctrl og behandlet med 2 pM etoposid, og celler transficeret med præ-mIR-18a og behandlet med 2 pM etoposid, blev to sidste grupper af celler tilladt i to timer i normalt medium efter lægemiddelbehandling. (C) Box plot af hale øjeblik af celler under forskellige behandling baseret på analyse af 50 celler fra tilfældige mikroskopiske felter. Boksen repræsenterer interkvartile interval, linje på tværs af rubrik anføres de medianværdier og whiskers repræsenterer 5-95 percentilværdierne. p-værdier blev evalueret ved ikke-parametrisk t-test.

MIR-18a Øger Sensibilisering af CRC-celler til Genotoxin

Uden hurtigt svar og reparation, DNA skader akkumuleres og reducerer cellevækst og cellelevedygtighed. Vi undersøgte virkningen af ​​MIR-18a på CRC cellevæksten med kolonidannelse assayet i to CRC cellelinier (HT-29 og HCT116). Uden induktionen af ​​DNA-skade, havde overekspression af MIR-18a ikke signifikant virkning på cellevækst sammenlignet med celler transficeret med precursor kontrol både i HT-29 (figur 5A) og i HCT-116 (figur 5C). Udsat for 2 pM etoposid, blev de dannede kolonier signifikant reduceret i HT-29 (figur 5A) og i HCT-116 (figur 5C). Konsekvent, ektopisk udtryk for miR-18a betydeligt undertrykt cellelevedygtighed sammenlignet prækursorer kontrol over-udtrykkende HT-29 (p 0,001; figur 5B) og HCT-116 (p 0,05, figur 5D).

virkningen af ​​ektopisk ekspression af mIR-18a på cellevækst af (A) HT-29-celler eller (C) HCT-116-celler, med eller uden behandling af 2 uM etoposid. Middelværdi ± SD blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Signifikant forskel blev bestemt ved Student t-test. NS angiver ingen statistisk signifikans. Virkning af MIR-18a på (B) HT-29 og (D) HCT-116 cellelevedygtighed efter behandling med 2 pM etoposid. Middelværdi ± SD blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Signifikant forskel blev bestemt ved gentagne foranstaltning ANOVA.

miR-18a Fremmer Genotoxin induceret apoptose

Uden induktion af DNA-skader, overekspression af miR-18a inducerede ikke signifikant effekt i celle apoptose i HT-29 og i HCT-116 (figur 6). Udsættelse for 2 pM etoposid signifikant inducerede mængden af ​​apoptotiske celler i begge HT-29 og HCT-116-celler (både P 0,001; Figur 6A2 og 6B2). Over-ekspression af MIR-18a yderligere induceret apoptose synergistisk med etoposid i både HT-29 (p 0,0001) og HCT-116 (p 0,01). Celler Salg

(A) HT-29-celler eller (B ) HCT-116-celler, med eller uden behandling af 2 uM etoposid. Middelværdi ± SD blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Signifikant forskel blev bestemt ved Student t-test. NS angiver ingen statistisk signifikans.

Diskussion

I denne undersøgelse blev en klar sammenhæng mellem miR-18a og genet ATM etableret. Luciferase reporter assay og western blot analyse bekræftede interaktion, som var gennem bindingen af ​​MIR-18a til den 3 ‘utranslaterede region af ATM-mRNA og efterfølgende undertrykt sin proteintranslation og dets aktivitet. Denne forening var mest tydeligt fra den inverse korrelation mellem MIR-18a og ATM i rectum tumorvæv (p 0,01).

ATM er et højmolekylært protein kinase, som spiller en central og tidlig rolle for at fremme reparation af DNA DSBs, som er en form for de mest cytotoksiske DNA-læsioner, der opstår gennem både endogene (f.eks oxidativ stress) og eksogene (fx ioniserende stråling og genotoksiske stoffer) kilder. I ustimuleret celle, ATM eksisterer hovedsagelig som et inaktivt homodimer eller multimer, med kinasedomænet af en ATM-protein bundet til det indre domæne af en anden ATM protein indeholdende serin 1981-phosphoryleringssted [24]. Denne struktur er vigtigt at holde ATM protein inaktiv og stabile, når der ikke er nogen DNA-beskadigelse. Derfor under ingen ekstern stimulus, der fører til DNA-skader, miR-18a overekspression inducerede ingen signifikant fænotypiske ændringer i HT-29 og HCT-116 celler som indlysende ved cellelevedygtighed, proliferation og apoptose analyse sammenlignet med kontrolgrupper. som reaktion på DNA skader fremkaldt af etoposid, et genotoksisk stof, som specifikt inducerer DSBs, Vi fandt imidlertid, at celler over-udtrykkende miR-18a var mindre i stand til at gendanne fra skade i forhold til celler transficeret med miRNA kontrol forløber, hvilket afspejler en kompromitteret DNA DSBs reparation mekanisme. Under DNA beskadigelse stimulus, kinasedomænet af en ATM-protein phosphoryleres 1981-domænet af det interagerende ATM protein, hvilket resulterer i aktiv kinase i monomer form [24]. Aktiveret ATM befries og kan phosphorylere et mangfoldigt array af downstream mål, der deltager i arrangementer til at reparere DNA beskadigelse [25]. Over-ekspression af MIR-18a reduceret ATM proteinmængder og således tilgængeligheden af ​​aktiveret ATM for DNA-reparation. Derfor, som DNA-beskadigelse akkumuleres uden reparation umiddelbart, MIR-18a over-udtrykkende celler var mere tilbøjelige til at begå apoptose, reduceret klonogen overlevelse og proliferationshastighed, som tydeligt i begge HT-29 og HCT-116 celler.

kompromitteret DNA-reparation mekanisme skyldes tab af ATM-funktion er et kendt disposition til forskellige sygdomme. Det mest indlysende eksempel er nedarvet autosomal recessiv sygdom, ataksi-telangiectasia (A-T), som resulterer fra tab af ATM-proteinekspression eller funktionelt proteinprodukt. Sygdommen er karakteriseret ved progressiv cerebellar ataksi, neurodegenerering, radiosensitivitet, celle-cyklus checkpoint defekter, genom ustabilitet, og en prædisposition for forskellige former for cancer [26], [27], [28]. Kromosomal gevinst i region 13q31.1, hvor MIR-17-92 er placeret, er en tidlig begivenhed i adenom-carcinom-sekvensen. Konsekvent, opregulering af miR-18a findes da præcancer fase af CRC [13]. Den undertrykte DNA-reparation mekanisme induceret af opreguleret MIR-18a kunne muligvis tjene en katalyserende rolle i dannelsen af ​​carcinom.

I øjeblikket tumor fase er den vigtigste prognostiske indikator for CRC patienter. Ikke desto mindre er mange patienter udviklede recidiv efter kirurgisk resektion uanset stadie eller levering af adjuverende kemoterapi. Yderligere prognostiske biomarkører er nødvendig for at give en bedre vurdering tilbagefald risiko så patienter kan få gavn af tæt opfølgning. Vi fandt høj miR-18a niveau er forbundet med højere recidiv rate og hurtigere tilbagefald. Det er endnu ikke klarlagt, om dette fænomen er medieret gennem ATM eller andre MIR-18a målgener. Ikke desto mindre forbliver rolle ATM forudsige kemo- /radio-terapi resistens i en klinisk indstilling ikke klart fastlagt. Roossink et al. rapporterede, at ATM-aktivering induceret beskyttende rolle at kemo- /radio-terapi i en kohorte af livmoderhalskræft kræftpatienter [29]. Jiang et al., Viste imidlertid, at ATM kunne sensibilisere og beskytte mod doxorubicin-induceret cytotoksicitet, afhængigt færdighedsniveauet andre DNA reparation gener, såsom p53 og CHK-2 [30]. Huehls et al. viste, at udtømning af ATM ikke sensibilisere cellerne til 5-FU, som er den vigtigste regimen anvendt i CRC [31]. Admansen et al. viste også, at ved klinisk relevante dosis på 5-FU, er ATM-pathway ikke er aktiveret for DNA-reparation i CRC celler [32]. Derfor, selvom vores

in vitro

data tydeligt vist undertrykkelsen af ​​ATM af miR-18a sensibiliserede cancerceller til etoposid, kan betydningen af ​​ATM rolle på kemo-resistens varierer i et kemoterapeutisk-specifikke og tumor-specifikke måde

in vivo

. Desuden kan MIR-18a-associeret gentagelser også være medieret gennem andre potentielle målgener der inducerer dets onkogene karakter

in vivo

. Denne hypotese er imidlertid behov for yderligere undersøgelse og validering. Etableringen af ​​miR-18a som tilbagefald markør skal også valideres i en kohorte af større stikprøve.

Som konklusion, identificerede vi ATM, et protein afgørende for DNA-reparation, som målet for miR-18a. I rektal cancer væv, ekspressionen af ​​miR-18a og ATM korrelerede omvendt. Ektopisk ekspression MIR-18a undertrykker ATM ekspression og dæmper DNA DSB-reparation. miR-18a, en ofte opreguleret miRNA i CRC, inducerer sin onkogene effekt i det mindste delvist gennem undertrykke ATM. Desuden tumor miR-18a-niveau er en potentiel markør for endetarmskræft tilbagefald.