PLoS ONE: Subtype Specifik Forhøjet Expression hyaluronidase-1 (HYAL-1) i Epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

Baggrund

Epithelial ovariecancer (EOC) er morfologisk heterogen væsen klassificeret som serøs, endometrioide, klar celle eller mucinøs. Molekylær genetisk analyse har foreslået en rolle for tumorsuppressorgener placeret på kromosom 3p i serøs EOC patogenese. Vores mål var at evaluere udtryk for

HYAL1

, placeret på kromosom 3p21.3, i disse EOC undertyper, og undersøge dens korrelation med ekspression af steroidhormonreceptorer.

Metode /Principal resultaterne

Vi bestemt mRNA ekspressionen af ​​

HYAL1

, østrogen receptor (ER) -α, ERP og progesteron receptor (PR) i EOC tumorprøver og cellelinjer hjælp kvantitativ RT-PCR. Vi undersøgte også udtryk for disse gener i en offentligt tilgængelig microarray datasæt. HYAL-1-enzymaktivitet blev målt i EOC cellelinier og i plasmaprøver fra patienter. Vi fandt, at

HYAL1

mRNA-ekspression var forhøjet i klar celle og mucinøse EOC vævsprøver, men ikke i serøse og endometrioide prøver, normale æggestokke eller benigne tumorer. Lignende resultater blev opnået ved to forskellige teknikker og med vævsprøve kohorter fra to uafhængige institutioner. Samstemmende,

HYAL1

mRNA niveauer og enzymatisk aktivitet var forhøjet kun i EOC cellelinjer afledt af klare celle og mucinous undertyper. Vi viste også, at

HYAL1

mRNA blev omvendt korreleret med den for ERa specifikt i klar celle og mucinous EOCs. Derudover ektopisk udtryk for ERa på en klar celle EOC cellelinje (ER- og PR-negativ) inducerede 50% reduktion af

HYAL1

mRNA-ekspression, understøtter en rolle ERa i

HYAL1

gen regulering. Betydeligt, HYAL-1-aktivitet var også høj i plasmaet af patienter med disse EOC undertyper.

Konklusioner /Betydning

Dette er den første rapport, der viser høje HYAL-1-niveauer i EOC og demonstrere

HYAL1

gen undertrykkelse af ERa. Vores resultater identificerer Hyaluronidase-1 som et potentielt mål /biomarkør for klare celle og mucinøse EOCs og især i tumorer med lave ERa- niveauer

Henvisning:. Yoffou PH, Edjekouane L, Meunier L, Tremblay A, Provencher DM, Mes-Masson AM, et al. (2011) Undertype Specifik Forhøjet Expression hyaluronidase-1 (HYAL-1) i Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 6 (6): e20705. doi: 10,1371 /journal.pone.0020705

Redaktør: Nai Sum Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 15. december, 2010; Accepteret: 8. maj 2011; Udgivet: 10 juni 2011

Copyright: © 2011 Yoffou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (tilskud # 262.142 til EF). Tumor banking blev støttet af Banque de væv et de données af Réseau de recherche sur le cancer i Fonds de la recherche en santé du Québec tilknyttet den canadiske Tumor Repository Network. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er den førende årsag til død fra gynækologisk cancer i de fleste vestlige lande [1]. På grund af sin asymptomatisk vækst og manglen på effektive screeningsmetoder, omkring 70% af alle tilfælde diagnosticeret i et fremskredent stadium, med kun beskedne forbedringer i overlevelse gennem de seneste 40 år [1]. Selv om de fleste patienter reagerer på kemoterapi oprindeligt, er tilbagefaldsrater meget høj hvilket resulterer i den generelle dårlig prognose ses i disse [2] patienter. Endvidere EOCs morfologisk heterogene, og forskellige histopatologiske undertyper har forskellige molekylære karakteristika og forskelligartet respons på behandling [3]. EOC kan klassificeres som serøs, endometrioide, klar celle eller mucinøs der svarer til de forskellige typer af epithel til stede i den kvindelige reproduktive tarmkanalen [4]. Forskelle i kemoterapi respons og patientresultater formentlig skyldes den molekylære heterogenitet af disse morfologisk distinkte EOCs [3]. Eksempelvis

TP53

mutationer observeres ofte i serøse og endometrioide cancere, men er næppe påvises i klar celle og mucinous EOCs [3]. Det er også kendt, at frekvensen af ​​kromosomale ustabilitet er højere i serøs EOC end i de andre undertyper [3].

serøs EOC, molekylær genetisk analyse har foreslået en rolle for tumorsuppressorgener placeret på den korte arm af kromosom 3 (3p) i patogenesen af ​​denne sygdom [5]. Transkriptom analyse af kromosom 3 generne identificeret flere differentielt udtrykte gener i EOC cellelinjer og ovarietumorer sammenlignet med normal ovarie overflade epitel (næse) celler [6], [7]. Kromosomforandringer i 3p21.3 ofte findes i lunge, nyre og brystkræft, hvilket tyder på, at de nærer tumorsuppressorgener [8]. Placeret på kromosom 3p21.3 er en klynge af gener, navngivne hyaluronidaser (

HYAL1

,

HYAL2

HYAL3

), som er den hyppigste mål for homozygote bortfald i lungekræft [8].

pattedyr hyaluronidaser (EC 3.2.1.35) er endo-

N

-acetylhexosaminidases der hydrolyserer det glycosaminoglycan hyaluronan. De omfatter en familie af 6-7 gener med ca. 40% identitet blandt hinanden [9], [10]. Hos mennesker er de grupperet i grupper på tre på kromosomer 3p21.3 (

HYAL1

,

HYAL2

HYAL3

) og 7q31.3 (

HYAL4

,

PH20

/

SPAM1

HYALP1

), med

HYALP1

være en pseudogen og

HYAL4

koder for en chondroitinase enzym [9], [11]. Derfor, i mennesker, der er fire hyaluronidaser, HYAL-1, -2, -3 og PH20 /Spam1, idet sidstnævnte hovedsageligt udtrykt i de mandlige kønsorganer, og som har en vigtig rolle i befrugtning [12]. På den anden side er hyaluronidaser placeret på kromosom 3 ubikvitært. HYAL-1 og HYAL-2 er de vigtigste somatiske hyaluronidaser ansvarlige for hyaluronan omsætning og er kendt for at have flere fysiologiske og patologiske roller [9], [13], såsom sårheling, inflammation og osteoarthritis. I modsætning hertil har Hyal-3 blevet beskrevet at være blottet for hyaluronan enzymatisk aktivitet [14] og dets fysiologiske rolle stadig mangler at blive fastlagt.

I ovariecancer, allel ubalance af disse tre gener (

HYAL1

,

HYAL2

HYAL3

) er blevet vist i tumor og stroma væv [15]. Især

HYAL-1

mRNA-ekspression viste sig at blive reduceret betydeligt i serøs EOC sammenlignet med normale ovarier [16], mens uændret eller en tendens til nedsat HYAL-1-aktivitet blev rapporteret i EOC vævsekstrakter [ ,,,0],16], [17]. I overensstemmelse med denne observation er ekstracellulær akkumulering af hyaluronan ofte observeret i ovarietumor stroma og pericellulære matrix, og er forbundet med dårlig sygdom udfald [17], [18]. Desuden har flere rapporter påvist interaktioner mellem hyaluronanbindende og membranreceptorer, såsom CD44, som fremmer associering af CD44 med visse cytoskeletproteiner (f.eks ankyrin, RhoGTPases, Cdc42) generering specifikke signaleringsbegivenheder fremmer ovariecancer celleadhæsion, migrering og overlevelse [ ,,,0],19]

i modsætning hertil niveauer af både hyaluronan og HYAL-1 er blevet rapporteret at blive forøget i blære, prostata og hoved og hals kræft, og for at være impliceret i tumorprogression og metastase [20] -. [ ,,,0],22]. Interessant er forhøjet ekstracellulær hyaluronan hovedsageligt findes i tumor stroma mens opdages forhøjede HYAL-1-niveauer i tumorvæv, hvilket tyder på en cross-talk mellem disse to vævstyper. Høje niveauer af HYAL-1 ekspression, er også fundet i brystkræft og glioblastomer, og er korreleret med metastatiske tumorer [22], [23]. Interessant østrogenreceptor (ER) negative brystcancercellelinier, som har tendens til at være mere aggressiv, har forøget hyaluronidaseaktivitet sammenlignet med ER-positive cellelinier [24]. Ved en mekanisme endnu ukendt, HYAL-1 inducerer cellecyklus overgang og opregulerer niveauerne af positive regulatorer af G2-M overgang (f.eks Cdc25C, cyclin B1, cdk10) i blære, prostata og orale skællede cancercellelinier [25] – [27]. HYAL-1 øger også angiogenese, sandsynligvis ved at generere hyaluronanbindende fragmenter af forskellige størrelser, som besidder evnen til at stimulere endotelcelleproliferation og kapillærdannelse [28].

Derfor niveauer af hyaluronidase ekspression kan variere afhængigt af tumortype og på dens aggressive adfærd. I det foreliggende arbejde udførte vi en detaljeret undersøgelse af ekspressionen af ​​HYAL-1 i æggestokkene kræft vævsprøver, der repræsenterer fire forskellige histopatologiske undertyper og viste forhøjede niveauer af dette enzym i klare celle- og mucinøse EOCs, men ikke i serøs eller endometrioide. Vi viste også, at niveauet af

HYAL1

mRNA i klar celle og mucinøse EOCs omvendt blev korreleret med de ERa. Betydeligt, viste vi, at ektopisk ekspression af ERa inducerede et fald på 50% i

HYAL1

mRNA-ekspression i en klar celle EOC cellelinie. Til vores viden, dette er den første rapport: i) demonstrere øget HYAL-1-ekspression i specifikke morfologiske EOC undertyper, ii), der viser en omvendt korrelation mellem

HYAL1

steroidhormoner i vævsprøver, og iii) implicerer

HYAL1

gen som en ERa mål for gen undertrykkelse. Endelig viste vi et 2,1-2,8 gange stigning i plasmaniveauerne af dette enzym hos patienter med klar celle og mucinous EOC, men ikke i dem med serøse eller endometrioide tumorer, sammenlignet med patienter med godartede cyster. Vores nuværende resultater identificerer HYAL-1 som en potentiel biomarkør til påvisning af disse to distinkte EOC undertyper.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

Tissue tumor prøver og EDTA- indsamlet plasma blev opnået, med informeret samtykke fra deltagerne gennemgår indgreb udføres på Centre hospitalier de l’Université de Montréal (KAMMERAT) Hôpital Notre-Dame. De politikker for indsamling og anvendelse af væv og blodprøver blev godkendt af Research Ethics Committee of kammerat. Kun tumorer fra kemoterapi naive patienter blev anvendt. Histopatologi, kvalitet og stadium af tumorer blev tildelt i henhold til den internationale sammenslutning af Gynækologi og Obstetrik (Figo) kriterier. Som normalt ovarie har ringe epitel indhold blev benigne serøse ovarietumorer anvendt som kontrol. Oplysninger om de anvendte prøver i den foreliggende undersøgelse er sammenfattet i tabel 1.

cellelinier

Primære kulturer af normal ovarie overflade epitel (næse) celler blev afledt, som tidligere beskrevet [ ,,,0],29], fra ovarier af tre deltagere uden forudgående historie af kræft i æggestokkene, efter profilactic ooforektomi på kammerat Hôpital Notre-Dame og informeret samtykke. EOC cellelinier blev etableret som tidligere beskrevet [29] – [31], og blev afledt af serøse epiteliale ovarietumorer (TOV81D, TOV2223, TOV1946) eller ascitesvæske (OV1946, OV866), fra en endometrioide ovarietumor (TOV112D), en clear cell carcinoma (TOV21G), og en mucinøs epitelial ovariecancer (TOV2444). Celler blev dyrket i OSE medium (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Canada) indeholdende 2,5 ug /ml amphotericin B og 50 pg /ml gentamicin (begge fra Invitrogen, Burlington, ON, Canada). Dyrkningsmedier blev suppleret med 15% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen) for næsen kulturer og 10% FBS for EOC cellelinier.

Kvantitativ real-time RT-PCR (Q-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret med Trizol-reagens (Invitrogen) fra frosne tumorprøver eller direkte fra celler dyrket til 80% konfluens som tidligere [32] beskrevne. RNA kvalitet blev rutinemæssigt overvåget ved agarosegelelektroforese og med 2100 Bioanalyzer, ved hjælp af RNA 6000 Nano LabChip kit (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland). CDNA-syntese blev udført ifølge protokollen af ​​QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Canada) under anvendelse af 1 ug totalt RNA. Den opnåede cDNA-opløsning blev fortyndet ti gange og 5 pi prøver blev anvendt i hver Q-PCR-reaktion. Kvantitative amplifikationer blev opnået ved anvendelse af Platinum® SYBR® Green Q-PCR Supermix UDG (Invitrogen) og følgende par primere: 5′-AAGCCCTCCTCCTCCTTAACC-3 ‘og 5′-AGCCAGGGTAGCATCGAC-3’ for

HYAL1

, 5′-CGCGCTCTACCCTGCACTC-3 ‘og 5′-TGAATCCGGCCTCAGGTAGTT-3′ for ERa, 5’-TGGGCTTACTGACCAACCTG-3 ‘og 5′-CCTGATCATGGAGGGTCAAA-3′ for ERp, 5’-AGAGTCCCTGGTGTGAAGCAA-3 ‘og 5’-GACAGCGCAGAAGTGAGCATC-3 ‘for progesteron receptor (PR), 5′-GCGCTGGCTCACCCCTACCT-3′ og 5’-GCCCCAGGGTGCAGAGATGTC-3 ‘for

ERK1

. De ovennævnte ERa, ERp og PR primersekvenser blev opnået fra en tidligere publikation [33].

ERK1

blev valgt som kontrol-genet baseret på dens stabil ekspression i æggestokkene prøver, bestående af normale og forskellige EOC undertyper [34], [35], og som tidligere beskrevet [34]. Fluorescens blev taget med iCycler iQ realtid detektionssystem (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Amplifikationer blev udført ved 50 ° C i 2 minutter (UDG inkubation), 95 ° C i 3 minutter (denaturerende) og 50 cykler ved 95 ° C /30 sek, 58 ° C /30 sek og 72 ° C /45 sek efterfulgt af en smeltekurve af 70 cykler af 0,5 ° C stigning /cyklus begyndende ved 60 ° C. Positive og negative kontroller blev indført i alle forsøg, og renhed og specificitet af PCR-produkterne blev sporadisk overvåget ved agarosegelelektroforese. PCR reaktioner blev udført mindst tre gange for hver cDNA prøve i separate forsøg. Relative ekspression værdi blev opnået ved 1/2

ACt fremgangsmåde under anvendelse af

ERK1

som kontrol-genet. I denne fremgangsmåde forskellen i C

T (ΔC

T) mellem målet og styre- gener blev anvendt til bestemmelse af genekspression med formlen 2

ACt. En normaliseret værdi af ekspression for målgenet med henvisning til kontrollen genet blev derefter opnået ved beregningen 1/2

ACt. Alle mRNA udtryk værdier var nøgletal i forhold til kontrolgruppen

ERK1

gen.

For at overvåge den biologiske respons ERa ektopisk udtryk på TOV21G celler (se nedenfor), Q-PCR blev udført for at måle mRNA niveauer af mål kendte ERa-, fx

GREB1

(vækstregulering af østrogen i brystkræft 1) og

TFF1

(trefoil faktor 1, også kendt som pS2 gen) [36], [37]. PCR-reaktioner blev udført som ovenfor beskrevet ved anvendelse af de følgende par af primere: 5′-TTCCCCGAAGTGCCAACAAC-3 ‘og 5′-ATGGAGATTCTGGAGACCACCC-3’ for

GREB1

, og 5′-TGGAGAACAAGGTGATCTGCG-3 ‘og 5’- CGAAACAGCAGCCCTTATTTGC-3 ‘for

TFF1

.

GEO Dataset Analyse

Gene udtryk profiler af flere vævsprøver fra de fire morfologisk distinkte ovariecancer og normal æggestokke er blevet udført ved hjælp af Affymetrix HG_U133A array [35] og blev gjort tilgængelige gennem National center for Biotechnology Information (NCBI) (GEO datasæt GSE6008). I den foreliggende undersøgelse, uploadet vi den rå tabel for hver tumorprøve og valgt de normaliserede værdier [fraktil-normaliseret trimmet middelværdi, log-transformeret med log (max (x + 50,0) +50] for hybridisering af proberne af interesse. i tilfælde af

HYAL1

og PR, Affymetrix HG_U133A arrayet indeholdt kun én probe for hver af disse gener (210619_s_at og 208305_at henholdsvis). Derfor er disse værdier blev anvendt som sådan i vores analyse til . evaluere udtrykket af disse gener i de enkelte vævsprøver Men for ERa- og ERp flere sonder var til rådighed (205225_at, 211233_x_at, 211234_x_at, 211235_s_at, 211627_x_at, 215551_at, 215552_s_at, 217163_at, 217190_x_at for ERa og 210780_at, 211117_x_at, 211118_x_at, 211119_at , 211120_x_at for ERp), og gennemsnittet af de normaliserede værdier af proberne hvert gen blev anvendt i vores arbejde til at analysere ekspressionen af ​​disse gener i de individuelle vævsprøver. oplysninger om histologi, grad og fase af disse prøver blev opnået fra tilgængelig supplerende materiale [35] og er sammenfattet i tabel 1.

hyaluronan zymografi

for at overvåge hyaluronidaseaktivitet af cellelysater fra æggestokkene kræft cellelinjer, hyaluronan zymografi blev udført som beskrevet tidligere [38] . Celler høstet fra 80% konfluente kulturer blev resuspenderet i lysepuffer (10 mM imidazol, 0,25 M saccharose), kortvarigt sonikeret og et proteinindhold på bestemt af BioRad Protein Reagent. Prøver (indeholdende 30 ug protein) blev separeret ved nativ PAGE (20 mA, 4 ° C) på en 8% gel indeholdende 0,25 mg /ml humant navlestreng hyaluronsyre (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canada). Gelen blev derefter kortvarigt ækvilibreret i assaypufferen specifikt for hyaluronidase-1 påvisning (100 mM natriumformiat, 150 mM NaCl, pH 3,7) og efterfølgende inkuberet natten over i samme puffer ved 37 ° C. Efter inkubation blev gelerne behandlet med 0,01 mg /ml pronase (Sigma-Aldrich) i en 20 mM Tris-buffer (pH 8,0) i 4 timer, skyllet med destilleret vand og farvet successivt med 0,5% Alcian blå og 0,1% Coomassie blue R både i 30% methanol:10% eddikesyre. Geler blev de-farvet indtil clearing bånd af fordøjet hyaluronan var tydelige. Gelzymografi blev gentaget tre gange for hver cellelinie ved anvendelse celleekstrakter fra forskellige kulturer.

HYAL-1 enzymatisk aktivitet af plasmaprøver Salg

Kvantificering af HYAL-1-aktivitet i plasma prøve blev analyseret ved en kolorimetrisk metode til vurdering af

N

acetyl-D-glucosamin (NADG) løsladt efter hyaluronan fordøjelse [39], [40]. Kort fortalt portioner af EDTA-behandlede plasma (ca. 4 pi indeholdende 30 ug proteiner som bestemt ved BioRad Protein Reagent) blev inkuberet med 40 ug af hyaluronan fra human navlestreng (Sigma-Aldrich) i 200 pi slutvolumen på reaktionsbuffer (79 mM natriumformiat, 150 mM NaCl, 0,2 mg /ml BSA, pH 3,9) ved 37 ° C i 24 timer. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 40 pi 1,2 M kaliumtetraborat pH 9,1 og kogt i 3 min. Farve-dannelse er afsløret ved tilsætning af 1,2 ml

s

-dimethylaminobenzaldehyde reagens (fremstillet som tidligere beskrevet [39], [40]) og inkubering ved 37 ° C i 20 minutter i det sure miljø af dette reagens . Prøver blev straks aflæst ved 585 nm. Hyaluronidaseaktivitet blev estimeret ud fra en NADG (Sigma-Aldrich) standardkurve (1 til 10 nmol), og blev udtrykt som nmol /ug protein. Plasma proteinindhold blev bestemt ved BioRad Protein Assay. Blindprøver blev opnået ved at udelade plasmaprøver. Hver plasmaprøve blev målt mindst tre gange i separate forsøg.

TOV21G celletransfektion

pCDNA plasmid (Invitrogen) indeholdende den humane østrogenreceptor alfa-sekvens (opkaldt pERα) er blevet beskrevet [41] , [42]. TOV21G celler blev dyrket i komplet OSE (Wisent) medium som beskrevet ovenfor, indtil cellerne var omkring 60% sammenflydende. Celler blev transient transficeret med 1 ug pERα i DMEM-F12-medium (Wisent) uden tillæg vha GeneJuice transfektionsreagens (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), ifølge producentens anvisninger. Efter en nats transfektion blev mediet erstattet med komplet OSE medium, og cellerne blev dyrket i en ekstra 24 timer til proteinekspression. Ved slutningen af ​​forsøget blev cellerne høstet ved trypsin-EDTA-behandling (0,25% trypsin med 1 mM EDTA; Invitrogen), vasket i PBS og anvendt til RNA-ekstraktion og Q-PCR eller for protein ekstraktion og immunblotting. Transfektionsforsøg blev gentaget mindst tre gange.

immunblotting

Celler blev lyseret i Tris-saltvand (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,4) (TBS) indeholdende 0,1% Triton X-100, 1 mM orthovanadat, 1 mM NaF, 0,1 mM PMSF og 1 × proteasehæmmer cocktail (Complete-mini, Roche Diagnostics Canada, Laval, QC, Canada). Proteinindhold blev bestemt ved BioRad Protein Reagent under anvendelse af en BSA-standardkurve. Prøver (lysater af ca. 30 ug protein) blev underkastet 12% SDS-PAGE, under reducerende betingelser, og elektrooverført på nitrocellulosemembraner. Ikke-specifik binding til membranen blev blokeret med 5% dehydratiseret skummetmælk i TBS. Membraner blev derefter inkuberet med primære antistoffer (4 ° C, natten over), vasket i TBS indeholdende 0,1% Tween og inkuberet med peberrod peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer. De primære IgG-antistoffer, der anvendes i vores arbejde var anti-ERa (H-184, 1:1000, kanin antistof; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og anti-actin (pan Ab-5, 1:1500, muse-antistof; Lab Vision Corp., Fremont, CA). Disse antistoffer blev testet i vore betingelser at være specifikke for deres målproteiner. Peroxidase-konjugeret anti-muse-IgG (1:1000, ged antistof; Sigma) og anti-kanin IgG (1:3000, ged antistof; Bio-Rad) blev anvendt som sekundære antistoffer. Protein-antistofgenkendelse blev påvist ved Western Lightning Kemiluminescens Reagent Plus (PerkinElmer, Boston, MA) i overensstemmelse med producentens instruktioner.

Statistisk analyse

Fordi niveauerne af HYAL-1 og hormonreceptorer blev ikke altid normalfordelt, blev parametriske tests anvendt til at analysere genekspression i vævsprøver og enzymatisk aktivitet i plasmaprøver. Vi først udføres en ikke-parametrisk Kruskal-Wallis-analyse af varians og når signifikante forskelle blev observeret, gennemførte vi Mann Whitney tests sammenligne gruppen af ​​normale (for microarray) eller godartede (for Q-PCR og aktivitet) prøver med hver af tumor undertyper separat . Statistisk signifikans blev behandlet på

P

0,05. Spearman rang korrelationskoefficienter blev beregnet og blev betragtet som statistisk signifikant, når

P

0,05. Forskelle i genekspression af transficerede og ikke-transficerede TOV21G celler blev analyseret af Students

t

-test (to-halet, lige-varians) og blev betragtet som signifikante, når

P

0,05 . Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp Prism4 til Windows version 4 (GraphPad Software, Inc.).

Resultater

Hyaluronidase-1-ekspression er forhøjet i klar celle og mucinøs men ikke i serøs og endometrioide EOC

tidligere har ekspressionen af ​​hyaluronidase-1 i ovariecancer blevet beskrevet specifikt i serøse tumorer [16], [17], sandsynligvis fordi dette er den hyppigste EOC subtype [4]. I den foreliggende undersøgelse analyserede vi mRNA ekspression af dette enzym med Q-PCR i ovariecancer vævsprøver opnået fra patienter med forskellige morfologiske subtyper af denne sygdom, f.eks serøse (11 prøver), endometrioide (9 prøver), klar celle (11 prøver) og mucinøse (8 prøver). Ekspressionsniveauer blev derefter sammenlignet med de for 15 benigne ovarietumorer. Godartede tumorer blev valgt til sammenligning på grund af deres rigelige indhold af overfladeepitelet som er meget få i normale ovarier. Derudover ønskede vi at undgå mulig interferens af HYAL-1-ekspression i andre æggestokkene celletyper. For eksempel har vi vist, at dette enzym udtrykkes i muse æggestokkene granulosaceller [38]. Som vist i figur 1A, er niveauer af

HYAL1

mRNA signifikant forhøjet i klar celle og mucinøse carcinomer (Mann Whitney test,

P

0,05). Men ikke i serøse og endometrioide tumorer

A) Q-PCR for

HYAL1

mRNA ekspression i godartet tumor (hvid bar), og i serøs (punkteret bar), endometrioide (skraveret bar), klar celle (skraveret bar) og mucinøs (sort bjælke) EOC vævsprøver fra patienter. Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± SEM af den relative

HYAL1

ekspression normaliseret til at styre gen

ERK1

fra forskellige patienter i hver gruppe. Værdien for hver enkelt cDNA prøve er gennemsnittet af 3-4 separate Q-PCR-målinger. * Betegner

P

0,05 på Mann Whitney test. B) normaliserede værdier af

HYAL1

probe hybridisering af Affymetrix HG_U133A array (GEO datasæt GSE6008) på RNA-prøver af normale ovariale væv (hvid søjle), og af serøs (prikket søjle), endometrioide (skraveret søjle), klar celle (skraveret bar) og mucinøse (sort bar) EOCs. Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± SEM af rå værdier normaliseret

HYAL1

hybridisering. * Betegner

P

0,05 på Mann Whitney test. C) Q-PCR for

HYAL1

mRNA ekspression i cellelinjer afledt fra normal æggestokkene epitel (NOV2667D, NOV2809D, NOV2206D, hvide søjler), og fra serøs (TOV81D, TOV2223, TOV1946, OV1946, OV866; stiplede søjler ), endometrioide (TOV112D, skraveret bar), klar celle (TOV21G, skraveret bar) og mucinøs (TOV2444, sort bar) EOCs. Barer repræsenterer middelværdien af ​​den relative

HYAL1

udtryk normaliseret til at styre gen

ERK1

for hver cellelinje. Q-PCR-målinger blev gentaget mindst tre gange for hver cellelinje cDNA. Cellelinier afledt fra forskellige EOC undertyper er repræsenteret i separate søjler følgelig ingen fejl barer er repræsenteret. Lodrette pile angiver klart celle og mucinøse cellelinier med høj

HYAL1

mRNA-ekspression. D) Hyaluronan zymogram af cellelysater fra ovennævnte serøs, endometrioide, klar celle og mucinøse ovarian cancer cellelinjer. Den vandrette pil markerer klare bånd af fordøjet hyaluronan. Det billede repræsenterer tre uafhængige zymogram eksperimenter.

Da størrelsen af ​​vores prøve kohorte kunne anses lille, besluttede vi at validere vores resultater ved at analysere

HYAL1

mRNA-ekspression i en offentligt tilgængelige microarray datasæt [35] (GEO datasæt GSE6008) indeholdende 41 serøs, 37 endometrioide, 8 klar celle og 13 mucinøse EOC prøver, og 4 normale æggestokkene vævsprøver. Figur 1B viser de normaliserede værdier [fraktil-normaliseret trimmet middelværdi, log-transformeret med log (max (x + 50,0) 50] for hybridisering af hver prøve med

HYAL1

sonde (210619_s_at) af Affymetrix HG_U133A array. i overensstemmelse med vores Q-PCR resultater blev observeret nogen signifikant forskel for

HYAL1

mRNA-ekspression mellem normale æggestokkene væv og som af serøse eller endometrioide tumorprøver (Figur 1B). klare celle carcinomer havde en tendens til at udtrykke højere niveauer af

HYAL1

mRNA end normalt ovarievæv, men ingen statistisk signifikans blev nået. I overensstemmelse med vores resultater, mucinøse prøver havde statistisk signifikant højere niveauer af

HYAL1

end normalt væv (Mann Whitney test,

P

0,05). (Figur 1B)

Ovariecancerpatienter cellelinjer afledt tumor prøver af disse forskellige morfologiske undertyper tidligere er blevet karakteriseret og viste adfærd svarende til tumor prøve, de hidrører fra [29] – [31] de giver effektive værktøjer til at undersøge de molekylære begivenheder relateret til hver morfologisk distinkt kræft i æggestokkene.. Derfor er vores næste skridt var at analysere niveauet af ekspression af

HYAL1

mRNA og protein i disse cellelinier. Primære cellekulturer af normal ovarie overflade epitel (næse) [29] blev anvendt som kontroller. Figur 1C viser, at som forventet, mRNA-ekspression af

HYAL1

var særligt høj i cellelinier TOV21G (afledt fra en klar cellecarcinom) og TOV2444 (afledt af en mucinøs EOC). Et mellemliggende niveau af

HYAL1

mRNA-ekspression blev observeret i cellelinjen TOV112D, som blev afledt af en endometrioide ovarietumor. Cellelinier afledt af serøs epitelial ovariekræft på det primære sted (TOV81D, TOV2223, TOV1946) eller fra ascitesvæsken (OV1946, OV866) viste lave niveauer af

HYAL1

udtryk, der kan sammenlignes med dem, der i næse cellelinjer. For at påvise, at mRNA-ekspressionsniveauer, målt kvantitativt ved vores sæt primere, afspejles størrelsen af ​​HYAL-1-protein i disse prøver, målte vi HYAL-1 enzymatisk aktivitet af et substrat-gel zymogram. Dette er en konventionel metode til at måle hyaluronidaseaktivitet og er specifik for Hyaluronidase-1 når analyseret ved sur pH [38]. Figur 1D viser en klar bånd af spaltet substrat (hyaluronan) kun i cellelysater af TOV21G og TOV2444 cellelinier. Den HYAL-1 enzymatisk aktivitet i serøse og endometrioide prøver var under detektionsgrænsen for vores analyse.

Da forhøjede HYAL-1 niveauer er blevet tidligere korreleret med højere kvalitet blære og prostata tumorer [21], [22 ], besluttede vi at kontrollere, om niveauet af

HYAL1

mRNA i klar celle og mucinøse ovarietumorer ville korrelere med sygdom lønklasse eller stadie (se tabel 1 for patienternes information). Men Spearman korrelation analyser afslørede ikke en signifikant positiv sammenhæng mellem niveauer af

HYAL1

mRNA og enten kvalitet eller stadie i klar celle (r = 0,262 og -0,322 for kvalitet og scene henholdsvis i vores datasæt, og r = 0,055 for trin i microarray data, alle

P

0,05) eller mucinøse tumor prøver (r = -0.655 og -0.577 for kvalitet og scene henholdsvis i vores datasæt, og r = -0.094 og – 0,378 for kvalitet og scene i microarray data, alle

P

0,05). Global analyse herunder alle undertyper ikke udviste en signifikant positiv sammenhæng enten (r = -0,234 og -0,251 for kvalitet og scene henholdsvis i vores datasæt, og r = 0,185 og 0,042 for lønklasse og trin i microarray data, alle

P

0,05). Disse resultater antyder, HYAL-1-ekspression kan være en iboende fænotypisk karakteristisk for klar celle og mucinous EOCs og at det kan anvendes som diagnostiske /påvisning markør for disse ovariecancer undertyper.

kan detekteres Hyaluronidase-1-aktivitet i konditioneret dyrkningsmedium af TOV21G cellelinje og en potentiel serum /plasma biomarkør for klar celle og mucinøs EOC

det er vist, at HYAL-1 er til stede i dyrkningsmediet af prostata og blære kræft cellelinjer samt i urinen fra patienter med blærecancer [21], [26], [27]. I det foreliggende arbejde, vi ønskede at kontrollere, om HYAL-1 også blev udskilt af EOC-cellelinjer, og om det kunne bruges som en serum /plasma markør for de to morfologiske undertyper, hvor dens udtryk niveauet er forhøjet, f.eks klar celle og mucinøs EOC. Figur 2A viser tilstedeværelsen af ​​HYAL-1-aktivitet (klar bånd af fordøjet hyaluronan) i den koncentrerede serumfrit konditioneret medium af TOV21G cellekultur og i dens cellelysat. I modsætning hertil kan der ikke påvises noget enzymatisk aktivitet i koncentreret konditioneret medium og cellelysatet fra TOV1946 cellelinie (afledt af en serøs EOC). Efter at have fastslået, at HYAL-1 udskilles af ovariecancerceller udtrykker dette enzym, undersøgte vi, om denne enzymatiske aktivitet kunne differentielt detekteret i plasmaet hos patienter med forskellige morfologiske EOC undertyper.