PLoS ONE: Systemisk sygdom-induceret spyt biomarkør Profiler i musemodeller af melanom og ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

Spyt (orale væsker) er en ny biovæske klar til påvisning af kliniske sygdomme. Selv om begrundelsen for orale sygdomme applikationer (f.eks oral cancer) er intuitiv, rationalet og forholdet mellem systemiske sygdomme og spyt biomarkører er uklare.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne undersøgelse brugte vi musemodeller for melanom og ikke-småcellet lungekræft og sammenlignede transkriptom biomarkør profiler af tumorbærende mus til dem i kontrolmus. Microarray analyse viste, at spyt transcriptomes blev ændret betydeligt i tumor-bærende mus vs. kontrol. Betydelig overlappende blandt transcriptomes af musetumorer, serum, spytkirtler og spyt tyder på, at spyt biomarkører har flere oprindelser. Desuden har vi identificeret, at ekspressionen af ​​to grupper af væsentligt ændrede transkriptionsfaktorer (TFS) Runx1, Mlxipl, Trim30 og EGR1, Tbx1, Nr1d1 i spytkirtel væv af melanom-bærende mus potentielt kan være ansvarlig for 82,6% af den opreguleret genekspression og 62,5% af nedreguleret genekspression henholdsvis i spyt hos melanom-bærende mus. Vi viste ligeledes, at ektopisk produktion af nervevækstfaktor (NGF) i melanom tumorvæv som et tumor-frigivet mediator kan inducere ekspression af TF Egr-1 i spytkirtlen.

Konklusioner

samlet set vores data understøtter den konklusion, at ved systemisk sygdomsudvikling kan forekomme væsentlige ændringer i spyt biomarkør profil. Selvom oprindelsen af ​​sygdommen-induceret spyt biomarkører kan være både systemisk og lokal, stimulering af spytkirtel af mediatorer frigivet fra fjerntliggende tumorer spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​spyt surrogat biomarkør profiler

Henvisning:. Gao K, Zhou H, Zhang L, Lee JW Zhou Q, Hu S, et al. (2009) systemisk sygdom-induceret spyt biomarkør Profiler i musemodeller af melanom og ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 4 (6): e5875. doi: 10,1371 /journal.pone.0005875

Redaktør: Benjamin Rich, Harvard Institute of Medicine, USA

Modtaget: Januar 5, 2009; Accepteret: 16 maj 2009; Udgivet: 11 jun 2009

Copyright: © 2009 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud RO1 DE017170 og R21 CA126733 til DTW de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret der findes ingen konkurrerende interesser.

Introduktion

Spyt huser et bredt spektrum af proteiner /peptider, nukleinsyrer, elektrolytter og hormoner, der stammer i multiple lokale og systemiske kilder. De biokemiske og fysisk-kemiske egenskaber spyt støtte sine vigtige funktioner i mundhygiejne, såsom fordøjelse, antibakteriel aktivitet, og vedligeholdelse af integriteten af ​​tænderne [1], [2]. For eksempel, xerostomi er en oral sygdom forårsaget af en dysfunktion af spytkirtlerne, som ledsages af reduceret eller fraværende sekretion af spyt og er årsag til grasserende karies og mucositis.

diagnostisk, en række fund i seneste årti har bedt interesse i anvendelse af spyt som en kilde til biomarkører. Det opløselige fragment af c-erbB-2 var detekterbar i spyt hos brystkræftpatienter, men ikke i raske kontroller eller patienter, der bærer godartede tumorer [3]. Niveauer af hormoner (fx cortisol, oxytocin) og lægemidler (fx cisplatin, nikotin, metadon) i spyt afspejler deres koncentration i serum [4], [5], [6]. I 2004 spyt-baserede HIV detektion blev godkendt af de amerikanske Food and Drug Administration (FDA).

Et markant løft til det videnskabelige grundlag og infrastruktur spyt diagnostik forskning kom seks år siden, da National Institute of Dental Kraniofaciale Research (NIDCR) foretaget en betydelig investering i retning udvikle brugen af ​​spyt som et diagnostisk værktøj. Spyt er siden blevet en biovæske der er klar til translationel og kliniske anvendelser. Af note er modningen af ​​spyt proteom, det første gennemføre i den diagnostiske værktøjskasse til spyt-baserede diagnostik. Vi ved nu, at der er 1166 proteiner i humant spyt, hvis funktioner, der spænder fra strukturel binding til deltagelse i forskellige biologiske processer [7]. En anden diagnostisk ressource i spyt har siden vist sig, spyt transkriptomet. Brug af spyt transkriptom som et diagnostisk redskab, blev et sæt af 185 mRNA er identificeret som “normal spyt core udskrifter” (NSCT) [8]. Desuden har spyt transkriptomet blevet påvist at være klinisk diskriminerende til påvisning oral cancer og Sjogrens syndrom (SS). Kombinationen af ​​syv spyt- udskrifter biomarkører (

IL8, IL1B, DUSP1, HA3, OAZ1, S100P, og SAT

) kan anvendes til at skelne mellem spyt hos patienter med orale pladecellecarcinom (OSCC), og at af kontroller med 91% sensitivitet og specificitet [9]; henviser fem spyt proteom markører (M2BP, CD59, catalase, MRP-14 og profilin) ​​kollektivt viser en 93% følsomhed og specificitet henholdsvis at detektere oral cancer under anvendelse spyt [10]. En anden undersøgelse viste, at 27 mRNA’er og 16 peptider i spytprøver fra SS-patienter var signifikant op- eller nedreguleret [11]. Teknologien til spyt transkriptom er for nylig blevet fremført af exon niveau med kapacitet til omfattende profilere spyt transkriptomet anvendelse af en exon-baseret teknologi [12].

Der er mange fordele ved at bruge spyt som en klinisk diagnostisk biovæske . Prøvetagningen er enkel, ikke-invasiv, og forårsager lidt angst hos patienter. Brugen af ​​spyt tilbyder også en omkostningseffektiv tilgang til store skærme [6].

Brugen af ​​spyt til påvisning af orale sygdomme er blevet bekræftet, men dens anvendelse til systemisk sygdom er stort set uklar. Mens rapporter har beskrevet påvisning af biomarkører for systemisk kræft i spyt (fx c-erb2 hos brystkræftpatienter), mekanismerne bag dette fænomen forbliver udokumenterede. Målet med denne undersøgelse var at udforske de videnskabelige beviser og give en begrundelse for brugen af ​​spyt for systemisk sygdom afsløring. Vi anvendte syngene musetumormodeller at udvikle tumorer fjernt fra mundhulen og bruges spyt transkriptom som biomarkør profil udlæsning (fig. 1). Den spyt transkriptom er valideret som et videnskabeligt troværdig og veldokumenteret biomarkør kilde i spyt [8], [9], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], som tillader high throughput analyser og udlæsning nødvendig for undersøgelserne

mus (enten C57BL /6 mus eller DBA /2 mus) blev tilfældigt opdelt i to grupper som følger:. kontrolgruppe (kontrol mus ) og tumor-gruppe (tumor-mus) (15 dyr per gruppe). PBS blev injiceret i kontrolmus, mens mus i tumor gruppe blev injiceret med tumorceller. Tumorer etablering tog ~ 3 uger. Spyt, spytkirtel, serum- og tumorvæv blev opsamlet fra hver mus. Fem mus hver blev samlet i én gruppe og behandles for at profilere deres transkriptom af udtrykket mikroarrays.

Resultater

Væsentlige sygdom-induceret forskelle mellem spyt transkriptom biomarkør profiler i tumor-bærende og kontrolmus Salg

for at vurdere, om de spyt transkriptom biomarkør profilændringer upon udvikling af en fjern tumor, udførte vi microarray analyse at sammenligne transkriptom biomarkør profiler i spyt fra kontrolmus (tre grupper, 5 mus i hver gruppe) med tumorbærende (melanom eller lunge) mus (tre grupper, 5 mus i hver gruppe) (fig. 1). Det er nødvendigt at have fem mus i hver tumor eller kontrolgruppe for at samle tilstrækkeligt spyt for RNA-isolering. udvælgelseskriterier biomarkør blev fastsat som gange ændring 2 og

P

0,05. Vi identificerede 152 signifikant opreguleret kendte gener og 359 betydeligt nedreguleret kendte gener (Fig. 2A, tabel S3 og S4) i spyt fra melanom-bærende mus sammenlignet med kontrolmus. Ligeledes fandt vi 290 markant opreguleret udskrifter og 784 betydeligt nedreguleret udskrifter (fig. 2B, .table S5 og S6) i spyt hos lungecancerrelaterede bærende mus sammenlignet med kontrol mus.

A

, Cluster analyse af 152 opreguleret kendte gener (der repræsenterer 225 probsets, venstre panel) og 359 nedreguleret kendte gener (der repræsenterer 403 probsets, højre panel) differentielt udtrykte i spyt af melanom mus vs. kontrol mus (P-værdi 0,05; fold ændring ≥2). De udtryk profiler blev standardiseret til at have nul middelværdi og enhed standardafvigelse. Rød og grøn repræsenterer høje og lave ekspressionsniveauer efter standardisering, hhv.

B

, Cluster analyse af 290 opreguleret og 784 ned-regulerede probesets udtrykkes forskelligt i spyt for lungekræft mus vs. kontrol mus (P-værdi 0,05; fold ændring ≥2).

C

D

, Sammenfald af differentieret genekspression mellem melanom model og lungekræft model.

C

, overlapning af 225 up-regulerede gener i melanom-modellen og 290 up-regulerede gener i lungekræft model.

D

, overlappende af 403 ned-regulerede gener i melanom modellen og 784 ned-regulerede gener i lungekræft model.

Vi overlappede også den differentierede genekspression i spyt af melanom mus med den for lungekræft mus. Sammenligning opreguleret eller nedreguleret spyt gener i to modeller, henholdsvis fandt vi 11 opreguleret (Fig. 2C) og 17 nedreguleret (fig. 2D) findes udskrifter i begge modeller. Men i betragtning af de forskellige genetiske baggrunde og cancercellelinier i de to mus tilstande, er det ikke overrasket over, at kun en brøkdel af den samlede ændrede gener blev overlappet (4,8% (11/225) eller 3,8% (11/290) opreguleres gener i melanom model eller lungekræft model, henholdsvis;. 4.2% (17/403) eller 2,1% (17/784) ned-regulerede udskrifter i de to modeller, henholdsvis)

Flere kilder bidrager til tumoren -induceret spyt mRNA profil ændring

for at undersøge de mulige kilder, der bidrager til spyt transkriptom ændringer i mus som reaktion på systemisk sygdom, filtreret vi udtrykket profilering data for melanom-bærende mus (tumor, serum, spytkirtel og spyt) for at vælge “nuværende” mRNA med en

P

værdi 0,001 og en intensitet værdi 200. I melanom-modellen, 20175, 5493, 19904, og 306 transkripter blev identificeret i tumoren, serum, spytkirtel og spyt, (fig. 3A). Efter overlappende samtlige tilstedeværende gener fra tumor, serum, spytkirtel og spyt, fig. 3B viste, at af de 306 transkripter til stede i spyt, 67,6% er også til stede i melanom-tumorvæv, 51,6% er også til stede i serum og 69,6% er også til stede i spytkirtel. Disse data indikerer, at oprindelsen af ​​den nuværende transkriptom i spyt kan være forbundet med forskellige rum i hele kroppen udgør totalt ~75.2% af de 306 spyt udskrifter. Desuden har 24,8% af de 306 udskrifter ikke overlappe gener i tumor, spytkirtel og serum, hvilket tyder på, at de kan stamme fra mundhulen.

En

, Overlappende udskrifter stede i spyt, spytkirtel, serum og tumor i melanom-bærende mus.

B

, Af de 306 spyt udskrifter, 69,6% var til stede i spytkirtel, 51,6% til stede i serum, 67,6% til stede i tumor (melanom), og 24,8% kan stamme fra mundhulen (lokal).

ændret udtryk for transkriptionsfaktorer (TFS) i spytkirtler af melanom-bærende mus korrelerer med ændret transskription faktor-medieret genekspression ændringer i mus spyt

Siden spyt transkriptomet var klart ændret i tumorbærende vs. kontrolmus, vi hypotese, at tumorerne opfører sig som endokrine organer, idet de udskiller mediatorer (hormoner, lymfokiner, cytokiner), der kan påvirke aktiviteten af ​​TF i spytkirtler og derved inducerer op eller ned-regulering af transkripter niveauer i spyt.

Selv om de to mus kræftmodeller i denne undersøgelse er veletablerede [34], [35], den melanom musemodel simulerer menneskelig melanom bedre end lungekræft model teoretisk og patologisk fordi både human melanom og denne mus melanom forekomme subkutant. Derfor brugte vi melanom-bærende C57BL /6 mus som en arbejdsmodel for at teste vores hypotese.

Vi først sammenlignet genekspressionsprofilerne af spytkirtel væv i melanom-bærende mus med kontrol mus og identificeret en liste af 46 markant opreguleret TF’er (fold forandring 2 og

P

0,05) (tabel S1). Vi derefter beregnede korrelationskoefficienter mellem udtrykket profiler af disse signifikant ændret TF’er og differentielt udtrykte gener (både op- og ned-reguleret) i spyt af melanom-bærende mus. TFS blev derefter sorteret efter antallet af højt co-udtrykte gener, hvis sammenhæng med TF udtryk er 0,5. De 6 opreguleret TF’er med højeste placering var RunX1 (runt relaterede transskription faktor 1), MLXIPL (musculus MLX interagerende protein-lignende) og TRIM30 (treparts motiv protein 30) til opreguleret spyt gener og EGR1 (Tidlig vækstfaktor-1), Tbx1 (T-box 1) og Nr1d1 (musculus nuklear receptor underfamilie 1, gruppe D, medlem 1) til ned reguleret spyt gener (fig. 4A, E, F).

A

, de 6 TF’er (

Runx1, Trim30, Mlxipl, EGR1, Nr1d1, TBX1

) er signifikant udtryk højere i spytkirtel af melanom-bærende mus vs. kontrol mus (P 0,05, tabel S1).

B

, mRNA ekspressionsniveauer af disse 6 TF’er (

Runx1, Trim30, Mlxipl, EGR1, Nr1d1, TBX1

) i spytkirtel af melanom mus vs. at af normale mus valideret af qRCR . Den vandrette stiplede linje indikerer niveauerne af genekspression i kontrolmus, der vilkårligt sat til 1. Søjlerne repræsenterer genekspressionsniveauer i spytkirtel af melanom mus i forhold til kontrolmus. Eksperimenter blev udført i triplikater; barer, SD.

C

, Expression niveauer af fem TF’er (Runx1, Mlxipl, EGR1, Nr1d1, og TBX1) i spytkirtel væv af kontrol mus og melanom mus blev målt ved immunoblotting. (C1, C2, C3 og T1, T2, T3 er den samme batch af væv, der anvendes i microarray assay). Bemærk, at kommerciel antistof ikke var tilgængelige for murine Trim30.

D

, Relative protein udtryk niveauer af de ovennævnte fem TF’er i melanom mus vs. kontrol mus. Signal intensitet af blottet i figur 4

C

blev kvantificeret af Image J software (NIH). Den vandrette stiplede linje indikerer ekspressionsniveauerne af disse 5 TF’er i kontrolmus, der vilkårligt sat til 1. Søjler viser, at de relative proteinniveauer af de 5 TF’er i tumorbærende mus sammenligne med kontrolmus; barer, SD.

E

F

, Udtrykket af 6 TF’er (

Runx1, Trim30, Mlxipl, EGR1, Nr1d1, TBX1

) i spytkirtel af melanom mus blev korreleret med differentieret genekspression i mus spyt. Tre af dem (Runx1, Trim30 og

Mlxipl

) kan være potentielt ansvarlig for 180, 35 og 16 af de up-regulerede spyt udskrifter i melanom mus (

P

0,05), henholdsvis , mens de øvrige 3 TF’er (

EGR1, Tbx1 og Nr1d1

) potentielt korreleret med 119, 116 og 77 ned-reguleret spyt udskrifter (

P

0,05).

G

, Udtrykket af de 3 TF’er (Runx1, Trim30 og Mlxipl) helt korreleret med 82,6% ((180 + 5 + 1) /225 = 82,6%) opreguleret genekspression i melanom mus spyt af overlappende alle spyt gener, som korrelerede med disse 3 TF’er fra fig. 4

E

.

H

, Udtrykket af de andre 3 TF’er (EGR1, TBX1 og Nr1d1) helt korreleret med 62,5% ((119 + 58 + 2 + 73) /403 = 62,5%) nedreguleret genekspression i spyt af melanoma mus ved at overlappe alle spyt gener, som korrelerede med disse 3 TF’er fra fig. 4

F

.

Næste, de ændrede ekspressionsmønstre for disse spytkirtel TF’er blev valideret på både transskription og protein niveauer ved qPCR og immunblotting. Figur 4

B

viser, at mRNA-niveauer i de seks TF’er forøges fra 3- til 16- fold i spytkirtlerne af melanom-bærende mus sammenlignet med kontrolmus. Immunoblotting påvisning ved 5 kommercielt tilgængelige murine TFS antistoffer afslørede 1,5 til 3,5 gange højere niveauer af disse TF’er ekspression i spytkirtlerne af melanom-bærende mus end i kontrolmus (Figur 4

C og 4D

). Så Figur 4

E og F

vise, at de ovennævnte 6 TF’er var forbundet med en række differentierede gen udtryk i mus spyt. Efter overlapper de forbundne gener i hver TF, kan det ses, at de ændrede aktiviteterne i de tre TF’er (RunX1, MLXIPL og TRIM30) kan være potentielt ansvarlige for 83% af de opregulerede mRNA’er i spyt (fig. 4

G

), mens de kollektive ændrede aktiviteter EGR1, Tbx1 og Nr1d1 potentielt kan tegne sig for 63% af nedreguleret udtryk for spyt mRNA (fig. 4

H

).

Egr-1 signalvej og detektion af nervevækstfaktor (NGF) i melanom tumorvæv og serum

for at undersøge om de udviklede tumorer kan mediere ændret ekspression af TF’er i spytkirtlerne af tumorbærende mus, undersøgte vi NGF /EGR1 signalvej fordi EGR1 blev identificeret som en opreguleret TF i spytkirtlen af ​​melanom-tumor-mus. Det er velkendt, at Egr-1 er en TF i NGF-signalvejen [18], [19] (fig. 5A). Vi hypotese derfor, at NGF udskilles i omløb af melanom, cirkulerer til spytkirtlen, hvor det aktiverer receptormedieret signalering kaskade, der fører til Egr-1-opregulering og induktion af specifik gentranskription og proteintranslation. Figur 5B viser, at NGF produceres i melanom væv på et betydeligt højere niveauer end i normal hud (

P

0,001). Figur 5C viser, at NGF er også signifikant højere i serum fra melanom-bærende mus sammenlignet med kontrolmus (

P

0,05). Kollektivt antyder disse data, at melanom kan producere NGF og secerneres det ind i blodbanen. Efter at have nået spytkirtlerne, kunne de øgede NGF i blodet derefter stimulere øget ekspression af TF’er såsom Egr-1 fører til ændret genekspression og protein profiler i spyt hos melanom-bærende mus.

A

, en vej der involverer transskription faktor EGR1. Nervevækstfaktor (NGF) kan være en opstrøms faktor EGR1.

B

, Ekspression af NGF i mus hud og melanomvæv målt ved ELISA. Kolonner er absolutte gennemsnitsværdier af NGF-koncentration i væv fra fem melanom mus. ***,

P

0,001.

C

, Ekspression af NGF i serum fra kontrolmus og tumor mus. Kolonner er absolutte gennemsnitsværdier af NGF-koncentration i serum fra fem kontrolmus og fem melanom mus. Bar, SD. **,

P

0,05

Diskussion

Undersøgelser har vist potentiale for brug af spyt som diagnostisk biovæske i translationel og kliniske anvendelser. Som en biologisk prøve, spyt er billig og lettilgængelig med ikke-invasive midler. Den omfattende vidensgrundlag af spyt diagnostiske sammensætning giver en værdifuld og informativ ressource for biomarkør opdagelse (www.skb.ucla.edu). Meget diskriminerende spyt biomarkører for to mundtlige sygdomme: kræft oral og Sjögrens syndrom er blevet identificeret og valideret [9], [11]. Men forbindelsen mellem systemiske sygdomme og spyt biomarkører er stadig uklart. I denne undersøgelse anvendte vi musemodeller for kræft at afgøre, om spyt biomarkør profiler påvirkes af distal sygdomsudvikling. Vores data viste, at spyt transkriptom profiler er signifikant ændret hos mus, der bærer en af ​​to tumorer: melanom og lungecarcinom (fig. 2). Hver tumor-typen blev tilknyttet en anden spyt transkriptom profil. Desuden er vores analyse af NGF produktion og TF EGR1 tyder på, at produktionen af ​​vækstfaktorer i tumorvævet repræsenterer en mekanisme, hvorved en fjern tumor kan ændre transkriptomet af spytkirtel og dermed spyt. Disse resultater viser også, at spytkirtlerne kan spille en central rolle ved mediering tumorinduceret ændringer i spyt transkriptom biomarkør profil. Ud over at vise, at sygdommen induceret cirkulerende biomarkører kan finde vej ind i spyt, disse resultater tyder på, at sygdom-induceret spytkirtel surrogat biomarkører kan have diagnostisk værdi til påvisning eller overvågning af systemiske sygdomme.

Da vores første rapport om spyt transkriptomet [8], [9], har vi været at undersøge oprindelsen af ​​spyt mRNA, der synes at være forskellige fra mRNA findes i andre kropsvæsker. Nukleinsyrerne i serum fra cancerpatienter menes at være kastet direkte fra cancercellerne eller at blive frigivet som følge af cellelysis i beskadigede organer mens nukleinsyrerne i urinen kan komme fra blod mRNA eller DNA [20], [21 ]. I en undersøgelse af menneskets spyt, kan påvises udskrifter i spyt transkriptomet på alle kilder til spyt, herunder ørespytkirtlen, submandibulære og sublinguale kirtler, gingival creviculære væsker og mundtlige epitelceller [16]. Det er for nylig blevet påvist, at størstedelen af ​​mRNA’er i spyt transkriptomet har et AU-rigt element (ARE) i deres 3’UTR som giver stabilitet ved kompleksdannelse med ARE-bindende proteiner [17]. I den foreliggende undersøgelse, sammenlignede vi transcriptomes af tumoren, serum, spytkirtler og spyt og fundet spyt transkriptomet i tumorbærende mus stærkt overlappede i høj grad med transcriptomes af spytkirtel, serum og tumor. Disse analyser tyder på, at der kan være flere oprindelse spyt mRNA og /eller at en kompleks systemisk forhold kan eksistere mellem mundhulen og systemisk sundhed.

Vi undersøgte potentielle mekanismer, hvormed de distale tumorer medierer ændringer i spyt biomarkør profiler i tumorbærende mus. Tidligere undersøgelser har vist, at systemiske sygdomme eller behandlinger kan påvirke funktionen af ​​spytkirtlerne kan medføre ændringer i sammensætningen af ​​spyt [22], [23], [24]. Spyt natrium- og proteinniveauer blev forhøjet efter interleukin-2 (IL-2) behandling af patienter. En undersøgelse med en musemodel viste også, at niveauet af inflammatoriske faktorer såsom IL-1beta steg i spyt efter remote betændelse i kroppen [24]. Som spytkirtlen er den største kilde til spyt, vi hypotese, at spytkirtlerne kan være ansvarlig for spyt specifikke biomarkør ændringer relateret til distale tumorer. Da vores forsøg blev udført i tre eksemplarer, kan Bayesian metode anvendes. Men denne metode kræver specifikke model forudsætninger for dataene. Endelig Expression konsol (Affymetrix, Inc.) og Dchip (https://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/) software blev anvendt i denne undersøgelse. For melanom syngen model, der er konstateret vi 46 TF’er er signifikant opreguleret i spytkirtlerne af melanom-bærende mus, som kan føre til direkte induktion eller undertrykkelse af genekspression. De relative fold ændringer i TF udtryk som EGR1 og Nr1d1 er forskellige mellem mRNA-niveauer og protein niveauer, som kan afspejle translationel ændring eller proteasomalaktivitet nedbrydning [25]. Vi fandt derefter, at disse ændrede ekspression af TF’er er forbundet med melanom-induceret transkriptom i spyt. Vi fandt, at ca. 83% af de markant opreguleret udskrifter i spyt kan forklares ved tre TF’er (Runx1, Trim30 og Mlxipl) (fig. 4G) og 63% af de væsentligt nedreguleret spyt udskrifter kan forklares med yderligere tre TF’er (EGR1, TBX1 og Nr1d1) (fig. 4H). Kollektivt disse resultater tillade os at konkludere, at spytkirtlerne tjene en tidligere unappreciated rolle som et organ overvåger systemisk sygdom ved at inducere sygdomsspecifikke TF’er og ændre ekspression af specifikke gener og oversættelse af de tilsvarende proteiner. Disse ændrede spyt mRNA’er og proteiner er sygdomsassocierede surrogat biomarkører, der udskilles i glandular væsker og ind i mundhulen hele spyt.

Da induktion af TF’er ekspression i spytkirtlerne hos mus med en distal tumor har vi yderligere hypotese der er tumorspecifikke mediatorer, der kan påvirke det ændrede TG ekspression i spytkirtlerne. Det er velkendt, at tumorer ektopisk udtrykker mediatorer, der har systemiske virkninger på distale organer og letter metastaser af cancerceller [26], [27]. Melanomer er kendt for at ektopisk express TGF-beta [28], mens lungetumorer ektopisk udtrykkelige gonadotropiner og andre hormoner [29], [30]. Vi undersøgte, om en sådan signaleringsvej kan forbundet med en af ​​de identificerede TF’er, der kan være ansvarlig for induktion eller undertrykkelse af spyt transkriptomet i musen melanom-model. Faktisk er NGF vides at stimulere ekspression af TF Egr-1 til en velundersøgte signalvejen (fig. 5A). Ved anvendelse af en NGF ELISA-assay, observerede vi, at koncentrationen af ​​NGF i melanom væv og serum er signifikant højere end i modpart kontrol væv (fig. 5B, C). Disse data antyder en biologisk scenario og rationale, hvori den udviklende muse tumor udskiller NGF i kredsløbet, hvor det cirkulerer i blodet til spytkirtlerne og binder til NGF-receptorer udtrykt af spyt acinære celler, aktivering af en signalvej, der fører til opregulering af Egr-1-mRNA og protein niveauer. Det skal bemærkes, at melanomceller er afledt fra melanocytter, der vandrer fra crista neuralis under fosterudviklingen. NGF kan stimulere proliferation og metastase af melanom celler [31]. På den anden side har NGF og dets receptor (TrkA IR og TrkC IR) blevet fundet i spytkirtlen [32], [33]. Derfor er det rimeligt at foreslå, at NGF udskilles af melanom tumor blev overført via blod og bundet til sine beslægtede receptorer i spytkirtlen, i sidste ende resulterer i stimulering af flere TF’er udtryk herunder Egr-1 (fig. 6).

mediatorer såsom NGF udskilles af fjerntliggende tumorer overføres til spytkirtlen gennem blod for at stimulere TF’er udtryk og ændre spyt mRNA profil.

Vi målte også NGF niveauer i tumoren lysat af musen lunge kræft model. Mens NGF var påviselig, det var på et væsentligt lavere niveau end melanom tumor lysat (20,9 ± 4,3 pg /mg i lunge tumor vs. 75,73 ± 24 pg /mg i melanom væv, P 0,05, data ikke vist). Desuden blev kun 11 opreguleret og 17 nedreguleres transkripter overlappede, når vi sammenlignet spyt mRNA profil af melanom-modellen til lungekræft model (225 opreguleret eller 403 ned-regulerede gener i melanom-model vs. 290 opreguleret eller 784 nedreguleres transkripter i lungekræft model henholdsvis fig. 2C og D). Og 2 af disse 17 overlappede nedreguleret gener blev korreleret med EGR1-ekspression (data ikke vist). Kollektivt disse data tillade os at konkludere, at melanom-afledt NGF er en potentielt vigtig mediator i nedregulering af specifikke spyt transkriptom kun i melanom-bærende mus.

Mens vores rapport ikke omfattende demonstrere mekanistiske sammenhæng mellem systemisk sygdomsudvikling og spyt biomarkør ombygninger, det begynder at male billedet for konceptet, at systemiske netværk findes i vores krop, der danner forbindelse mellem distale sygdomme og spytkirtlerne. Signaler transmitteret gennem sådanne netværk kan inducere relaterede signalveje, som resulterer i ændret genekspression og proteintranslation og derved fremkalde sygdom-induceret spyt biomarkør profiler. Vi hypotesen, at sådanne sygdom-induceret spytkirtel-medierede transcriptomes og translationelle produkter kan tjene som værdifulde indikatorer for sygdomsdebut og /eller progression. Derfor spytkirtlerne kan betragtes, som et reaktivt orgel overvågning systemiske sygdomme og spyt kan undersøges som biomarkør-beriget sygdom-reflekterende biovæske. Den lokale produktion og sekretion af spyt fra en enkelt anatomisk kilde (spytkirtlerne), og det faktum, at det kan udnyttes enkelt og ikke-invasivt samt med relativt lidt ubehag for patienter, giver et stærkt incitament til fortsat undersøgelse af salvia som en potentiel diagnostisk indikator for systemiske sygdomme.

Materialer og metoder Salg

Dyr

Seks til otte uger gamle DBA /2 mus og C57BL /6-mus var indkøbt fra Jackson laboratorium (Bar Harbor, ME) og har til huse i afdelingen for Laboratory Animal Medicine (DLAM) ved University of California i Los Angeles. De eksperimentelle protokoller blev godkendt af Udvalget for kansler Animal Research (ARC) ved University of California i Los Angeles (UCLA).

Cellelinjer

Murine cellelinier KLN-205 og B16-F1 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). KLN-205 er en ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinie oprindeligt etableret i en DBA /2-mus. Celler blev dyrket i MEM (GIBCO). Og B16-F1, en C57BL /6-afledt melanom cellelinie blev opretholdt i DMEM (GIBCO) [34]. Alle celler blev holdt i en atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C.

In vivo Salg tumormodeller

Melanom musemodel blev induceret ved subkutan (sc) injektion af 1 × 10

5 B16-F1-celler i 0,1 ml PBS i nederste højre flanke af C57BL /6 mus. Den lungekræft model blev oprettet ved subkutan injektion af 2 × 10

5 KLN-205 celler i DBA /2 mus [34], [35]. Kontroldyr blev injiceret med PBS alene. Etablerede tumorer blev observeret efter 2-3 uger (fig. 1).

Samling af muse spyt, blod og tumorvæv

Når tumorerne nåede 15 mm i spyt diameter blev opsamlet og musene var aflivet. Mild anæstesi blev induceret ved intramuskulær (IM) injektion af 1 ul /kg legemsvægt af en opløsning indeholdende 60 mg /ml ketamin (Phoenix Scientific, St. Joseph, MO) og 8 mg /ml xylazin (Phoenix Scientific). Mus blev subkutant injiceret med pilocarpin (0,05 mg pilocarpin /100 g legemsvægt) mellem ørerne til stimuleret spyt sekretion. Spyt blev opnået fra mundhulen ved mikropipette og øjeblikkeligt anbragt i præ-kølet 1,5 ml mikrocentrifugerør.