PLoS ONE: Induktion af tidlig Ældning af Hsp90 Hæmning i småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

Den molekylære chaperone Hsp90 er en lovende nyt mål i kræftbehandlingen og selektive Hsp90-hæmmere er i øjeblikket i kliniske forsøg. Tidligere disse inhibitorer er blevet rapporteret at inducere enten cellecyklusstandsning eller celledød i cancerceller. Hvorvidt cellecyklusstandsningen er reversibel eller irreversibel er generelt ikke blevet vurderet. Her har vi undersøgt i detaljer cellecyklusstandsningen og celledød reaktioner af human småcellet lungekræft-cellelinjer til Hsp90 hæmning.

Metode /vigtigste resultater

I MTT-analyser, småcellet lungekræft celler viste en bifasisk respons på Hsp90-hæmmere geldanamycin og radicicol, med lave koncentrationer forårsager spredning anholdelse og høje koncentrationer forårsager celledød. Vurdering af Hsp90 intracellulær aktivitet ved hjælp af tab af kundens protein-ekspression viste, at geldanamycinderivaterne koncentrationer, der hæmmede Hsp90 korreleret tæt sammen med dem, der forårsager spredning anholdelse men ikke celledød. Den proliferationsstandsning fremkaldt af lave koncentrationer af geldanamycin var ikke vendt i en periode på mere end tredive dage efter fjernelse narkotika og viste funktioner i ældning. Sjældne populationer af variant småcellet lungekræft celler kunne isoleres der havde yderligere genetiske ændringer og ikke længere gennemgik irreversibel proliferationsstandsning som reaktion på Hsp90 hæmmere

Konklusioner /Betydning

Vi konkluderer at:. ( 1) Hsp90 hæmning inducerer primært for tidlig ældning, snarere end celledød, i småcellet lungekræft celler; (2) småcellet kræftceller kan omgå denne ældning gennem yderligere genetiske ændringer; (3) Hsp90 hæmmer-induceret celledød i småcellet lungekræft celler skyldes hæmning af en anden end cytosolisk Hsp90 mål. Disse resultater har konsekvenser med hensyn til, hvordan disse inhibitorer vil opføre sig i kliniske forsøg og for udformningen af ​​fremtidige inhibitorer i denne klasse

Henvisning:. Restall IJ, Lorimer IAJ (2010) Induktion af tidlig Ældning af Hsp90 Hæmning i småcellet lungekræft. PLoS ONE 5 (6): e11076. doi: 10,1371 /journal.pone.0011076

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: December 7, 2009; Accepteret: 17. maj 2010; Udgivet: 11 juni 2010

Copyright: © 2010 Restall et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til IL fra den canadiske Institutes of Health Research (tilskud number62797) (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) og den canadiske Cancer Society (tilskud nummer 020.121) (http 😕 //www.cancer.ca/canada-wide.aspx sc_lang = en). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hsp90 fungerer som en chaperone i normale celler, fremme den korrekte foldning af begge nyligt syntetiserede proteiner og proteiner, der er blevet delvis denatureret på grund af stress [1]. Det synes at være primært involveret i sene stadier af folde, sandsynligvis ved at anerkende eksponerede hydrofobe overflader på delvist foldede proteiner. Den grundlæggende mekanisme Hsp90-induceret proteinfoldning indebærer konformationel skift mellem åbne og lukkede konformationer, der er reguleret af ATP-hydrolyse [2]. Satser for Hsp90 ATP hydrolyse styres på skift af sin tilknytning til forskellige cochaperones.

Selv om antallet af proteiner er kendt for at kræve Hsp90 for korrekt foldning fortsætter med at stige, Hsp90 er tydeligvis selektiv for en delmængde af cellulære proteiner. Disse omfatter en række proteiner med kendt onkogen aktivitet, herunder Her2, Raf1 og Cdk4 [3]. I nogle tilfælde viser Hsp90 præferentielle associering med mutanten, oncogene former af proteiner; dette er blevet påvist for både Src-kinase og EGF-receptoren [4] – [6]. Hsp90 viser også en øget tilknytning til cochaperones og højere ATPase aktivitet i kræftceller, både

in vitro

in vivo

[7]. Af disse grunde er der stor interesse i Hsp90 som et mål for cancerterapi.

Geldanamycin og radicicol er to strukturelt ubeslægtede naturlige produkter, som binder til ATP-bindingsstedet af Hsp90, blokering den konformationelle cykling, der er nødvendige for dens chaperonaktivitet. Disse forbindelser udviser god selektivitet for Hsp90, selv om de også binde til Hsp90 endoplasmatiske reticulum paralog Grp94 og Hsp90 mitokondrielle paralog Trap1 ved højere koncentrationer [8] – [10]. Mens disse forbindelser etablere i princippet, at Hsp90 er en “druggable” målet fra en farmakologi perspektiv, dårlig opløselighed og ikke-specifikke toksiciteter gør dem uegnede til anvendelse i mennesker. Derivatiserede versioner af geldanamycin er fremstillet, der har forbedret farmakologiske egenskaber, selv om de stadig har nogle af de begrænsninger af den oprindelige forbindelse [11]. På trods af dette, er der tegn fra nogle forsøg, at Hsp90 hæmning er opnåeligt, baseret på biomarkør analyse patientens lymfocytter [12], [13] og tumorprøver [14]. Der er også nogle tegn på anticanceraktivitet [15]. For nylig hidtil ukendte Hsp90 inhibitorer er blevet udviklet, som ikke har begrænsningerne ved de tidligere forbindelser, og disse er nu ind kliniske forsøg [11]. Med disse fremskridt i farmakologi Hsp90 hæmning, vil et kritisk nyt område af undersøgelsen være at identificere undergrupper af kræftpatienter, der er mest tilbøjelige til at drage fordel af Hsp90 hæmning.

Lungekræft er den største årsag til kræftdødsfald verdensplan. Ca. 15% af lungekræft er af subtype kendt som småcellet lungekræft. Denne kræft normalt præsenterer som metastatisk sygdom og er normalt ikke behandles med kirurgi. Småcellet lungekræft generelt reagerer meget godt til stråling og kemoterapi i første omgang, men de fleste patienter tilbagefald med resistent sygdom og dø inden for to år [16]. De fleste af småcellet lungekræft har neuroendokrine egenskaber og aktivt udskiller polypeptidhormoner [17]. Disse udskilles hormoner forårsage en række paraneoplastisk syndrom, der er fælles komplikationer af småcellet lungekræft.

Her har vi undersøgt respons småcellet lungekræft celler til Hsp90 hæmning. En tidligere undersøgelse havde vist, at Hsp90-inhibitorer inducere celledød i småcellet lungecancer-celler via aktivering af den indre vej af apoptose [18]. Vores resultater er i overensstemmelse med dette, men vi observeret, at celledød kun forekommer ved koncentrationer langt højere end dem, der kræves for hæmning af cytosolisk Hsp90. Vi observerer, at behandling af småcellet lungekræft celler med Hsp90-inhibitorer ved koncentrationer, der er tilstrækkelig til at hæmme cytosolisk Hsp90 inducerer tidlig ældning snarere end celledød.

Resultater

Reaktion af human småcellet lungecancer cellelinier til Hsp90 inhibering

Den humane småcellet lungecancer-cellelinie H69 viste en bifasisk respons på behandling med en række geldanamycinderivaterne koncentrationer (figur 1a). I et MTT-assay, en 48 h udsættelse af celler for 0,1 uM geldanamycin faldt antallet af levedygtige celler med ca. 40%. Forøgelse af koncentrationen af ​​geldanamycin til op til 3 uM forårsagede ikke et yderligere fald i antallet af levedygtige celler. Med koncentrationer af geldanamycin 4 uM, antal levedygtige H69 celler faldt til væsentlige nul. Radicicol, en anden Hsp90 inhibitor, der er strukturelt relateret til geldanamycin, gav også en bifasisk dosisresponskurve med H69-celler, om end med en mindre tydelig plateau fase (figur 1B). To andre småcellet lungecancer-cellelinjer (H187 og H889) også vise en tofaset reaktion på geldanamycin (figur 1C og D); men U87MG glioblastoma-cellelinien viste kun den første fase af denne reaktion (

dvs.

. fasen ses ved lave koncentrationer geldanamycinderivaterne) (figur 1E).

A, MTT assay af H69-celler behandlet med geldanamycin i 48 timer; B, MTT assay af H69-celler behandlet med radicicol i 48 timer; C, MTT assay af H187 småcellet cancerceller med geldanamycin for 12, 36 og 60 timer; D, MTT assay af H889-celler behandlet med geldanamycin i 48 timer; E, MTT assay af U87MG glioblastom-celler behandlet med geldanamycin i 48 timer; F, H69 celler behandlet med geldanamycin i 48 timer og analyseret for levedygtige (○) og total (•) celletal under anvendelse af en Vi-celle XR cellernes levedygtighed analysator. Fejlbjælker viser middelværdien ± SE for tre gentagelser.

Som den første fase kunne være potentielt skyldes enten inhibering af celleproliferation eller selektivt drab af en delmængde af SCLC celler, yderligere assays blev udført for at skelne mellem disse muligheder. Svaret fra H69-celler til behandling med en række geldanamycinderivaterne koncentrationer blev analyseret ved celletællinger ved anvendelse trypanblåteksklusion at skelne levende celler fra døde celler (figur 1F). De levende celletal viste også en bifasisk respons, når analyseret ved denne metode. Totale celletal lignede leve celletal i den første fase af den tofasede respons kurve, men afveg i den anden fase. Disse data viser, at geldanamycin primært inducerer proliferationsstandsning i H69-celler ved lave koncentrationer, men inducerer celledød ved høje koncentrationer. Dataene i figur 1C, som viser MTT assays på H187 celler behandlet for forskellige tidsperioder (12, 36 og 60 h) med geldanamycin, er i overensstemmelse med denne konklusion, da den første fase er kun tydelig med længere behandlinger, hvor der er tid for signifikant celleproliferation at finde sted i kontrollen. Dette viser også, at celledød ved høje geldanamycinderivaterne koncentrationer sker relativt hurtigt (

dvs.

i mindre end 12 timer).

Reaktion på H69 celler efter tilbagetrækningen af ​​Hsp90 hæmning

Proliferation anholdelse fremkaldt af lægemidler kan være reversibel eller irreversibel (

dvs.

ældning-lignende). For at skelne mellem disse muligheder blev H69-celler behandlet med forskellige koncentrationer af geldanamycin i to dage. Lægemiddel blev derefter fjernet og levedygtige celletal blev overvåget. Celleproliferation genvundet fra behandling med geldanamycinderivaterne koncentrationer på 50 nm eller mindre. efter behandling med 100 nM geldanamycin, en population af levedygtige celler forblev imidlertid, at ikke øget over en periode på mere end tredive dage efter fjernelse af lægemiddel (figur 2A). Lignende resultater blev opnået med H187 og H889 småcellet lungekræft cellelinier (figur 2B og figur S1A) og i H69 celler behandlet med klinisk relevante Hsp90 inhibitor 17-AAG (Figur 2C). H69-celler krævede mindst 24 timers udsættelse for geldanamycin at inducere irreversible proliferationsstandsning (figur 2D) og induktion af irreversibel proliferationsstandsning var upåvirket af caspase inhibering (fig 2E). Til sammenligning det samme forsøg blev udført på U87MG humane glioblastom-cellelinje (figur 2F). Disse celler genvinde vækst efter behandling med 100 nM geldanamycin og også komme ud af en behandling med en ti gange højere koncentration af geldanamycin. Den vedvarende proliferationsstandsning induceret af geldanamycin er derfor ikke en universel respons af cancerceller, men snarere er cancer celle- typespecifikke. Salg

Celler blev behandlet i 48 timer med den angivne koncentration af inhibitor, som derefter blev fjernet. Levedygtige celler blev derefter bestemt på de angivne tidspunkter efter inhibitor fjernelse. A, H69 celler behandlet med geldanamycin; B, H187 celler behandlet med geldanamycin; C, H69-celler behandlet med 17-AAG. D, H69-celler behandlet med 100 nM geldanamycin for 4, 12 eller 24 timer. E, H69-celler blev behandlet i 48 timer med 100 nM geldanamycin i fravær eller nærvær af 100 uM Z-VAD-FMK, en generel caspaseinhibitor. Z-VAD-FMK behandling blev påbegyndt 1 time før tilsætning af geldanamycin. F, U87MG celler behandlet med geldanamycin.

For at bekræfte vedvarende vækst anholdelse af en anden metode, inkorporering af BrdU i H69 celler, der havde været udsat for 100 nM geldanamycin blev også vurderet. I overensstemmelse med levedygtige celler, viste denne analyse, at H69 celler undladt at inddrive deres proliferative kapacitet efter geldanamycin fjernelse (figur 3A).

A. H69-celler blev behandlet i 48 timer med 100 nM geldanamycin. Geldanamycin blev derefter fjernet. Seks eller otte dage efter fjernelse lægemiddel blev 25.000 behandlede celler (GA) per brønd udpladet i seksoghalvfems brønds plader sammen med det samme antal ubehandlede H69-celler til sammenligning (ingen GA). Celler lodes optagelse BrdU i 16 timer og BrdU-inkorporering blev derefter analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultater blev normaliseret til værdierne for ubehandlede celler. De viste data er gennemsnittet ± SD af seks replikater. B. Celler blev behandlet i 48 timer med geldanamycin. Totale cellelysater blev derefter opsamlet og analyseret ved Western blotting under anvendelse af antistoffer mod de angivne proteiner. Det nederste panel viser et blot farvet for totalt protein med amidosort forud for antistof inkubation. Lige store mængder DMSO blev tilsat til cellerne for hver behandling, undtagen i yderste venstre bane, hvor DMSO blev udeladt.

Ændringer i Hsp90 klient proteiner og varmechokproteiner i respons til Hsp90 inhibering

virkningerne af forskellige koncentrationer af geldanamycin på kendte Hsp90 klienter blev også vurderet i H69-celler (figur 3B, højre fire baner af blot). Omfattende tømning af Hsp90 klient proteiner CDK4 og Raf1 blev set ved geldanamycinderivaterne koncentrationer så lave som 50 nM. En anden velbeskrevne respons af celler til Hsp90 inhibering er induktionen af ​​andre varmechokproteiner, der opstår via aktivering af Hsf1 [19]. Som med klient protein responser, geldanamycinderivater koncentrationer så lave som 50 nM forårsagede forøgelser i Hsp70, Hsp27 og Hsp90α /β. Disse geldanamycinderivaterne koncentrationer parallelt dem, der forårsager proliferationsstandsning, men er omkring 100 gange mindre end de koncentrationer, der forårsager betydelig celledød.

U87MG og H69 celler viste meget ens følsomheder til geldanamycin med hensyn til fald klient protein og varmechok protein stigninger (figur 3b). Dette indikerer, at forskellen i adfærd mellem H69 og U87MG celler efter fjernelse af geldanamycin er ikke en konsekvens af forskelle i lægemiddelmetabolisme (

f.eks

multilægemiddeltransportøren aktivitet eller diaphorase aktivitet, som begge påvirker geldanamycin aktivitet [20], [21]). det viser snarere, at de forskellige reaktioner af disse celler efter tilbagetrækning af geldanamycin skyldes forskelle, der er nedstrøms for Hsp90 inhibition. Western blot-analyse bekræftede, at H69 celler manglede påviselig p53 (figur 3B) efter aftale med Smith

et al

., Som viste, at der er et stop mutation i

P53

exon 5 i denne celle line [22]. p16INK4a var til stede i H69 celler og dets niveauer var upåvirket af behandling med geldanamycin i 48 h (figur 3B).

ældning markører i vækst-anholdt småcellet lungekræft celler

Den irreversible proliferationsstandsning induceret af Hsp90 hæmning i småcellet lungekræft celler foreslået, at disse celler var blevet senescent. For at vurdere dette yderligere, blev yderligere markører for ældning vurderet. Figur 4A viser morfologien af ​​suspensionskulturer af ubehandlede H69 celler otte dage efter geldanamycin fjernelse. Behandlede celler vise nogle udvidelsen og øget cytoplasmatisk granularitet, karakteristiske træk ved senescentceller. Et andet fælles træk ved senescentceller er tilstedeværelsen af ​​senescens-associerede heterochromatin foci (SAHF) [23]. I overensstemmelse med senescens induktion, inhibering af Hsp90 med geldanamycin førte til dannelsen af ​​SAHF i H69-celler som vist ved DAPI-farvning (figur 4B). SAHF blev opretholdt efter fjernelse af geldanamycin, som forventet for en ældning markør og blev beriget i histon H3 trimethyleret på lysin 9, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser (Figur S1B) [24]. Aktivering af en DNA-skader reaktion er et vigtigt træk ved både replikativ og for tidlig aldring, som bidrager til vækststandsning fænotype af senescentceller [25]. Et centralt træk ved DNA-skade responset er dannelsen af ​​phosphoryleret histon H2AX (γH2AX) på steder støder op til DNA-skader. Både geldanamycinderivaterne og radicicol behandlinger forøgede niveauer af γH2AX i H69-celler (Figur S1c). γH2AX niveauer forblev forhøjede i op til seks dage efter geldanamycin fjernet, den længste tidspunkt vurderes (figur 4C). Dette er i overensstemmelse med rapporter om, at senescentceller opretholde en aktiveret DNA skade responset i en længere periode efter induktion af ældning [25], [26].

A. H69-celler blev behandlet med DMSO alene eller 100 nM geldanamycin i 48 timer. Geldanamycin blev derefter fjernet. Otte dage senere blev celler lov til at bundfælde på poly-L-lysin-coatede dækglas, fikseret med paraformaldehyd og fotograferet under fase kontrast ved anvendelse af en 63X objektiv. B. SAHF dannelse efter behandling af celler med Hsp90-inhibitorer. H69-celler blev behandlet med DMSO eller 100 nM geldanamycin i 48 timer. Celler blev derefter fikseret, farvet med DAPI og undersøgt ved fluorescensmikroskopi. C. H69-celler blev behandlet med DMSO (kontrol) eller 100 nM geldanamycin. DMSO og geldnamycin blev derefter fjernet på dag 0. Total cellelysater blev indsamlet på de angivne dage efter geldanamycin fjernelse og analyseret for γH2AX og H2AX niveauer ved Western blotting. Grafen viser densitometri for Western blot analyser af tre biologiske gentagelser. Data, blev normaliseret til vehikelbehandlede kontrol- celler og er vist som gennemsnit ± SE.

Isolering af variant H69 celler, der omgår geldanamycin-induceret ældning

Mens H69 celler opretholdt en spredning arresteret i mere end tredive dage efter fjernelse af geldanamycin, efter ca. 40 dage en population af celler gjorde begynde at formere sig i et eksperiment. Vi har udpeget denne population som H69 /41d celler. H69 /41d celler har en distinkt morfologi: mens H69-celler er ikke-adhærente celler, der danner ujævne aggregater varianten celler, samtidig med ikke-klæbende, danner tætte kugler, der minder om dem, der ses med stilk cellepopulationer (figur 5A). Ved efterprøvning, disse celler stadig undergik proliferationsstandsning som respons på 100 nM geldanamycin, men var i stand til at inddrive proliferativ kapacitet efter fjernelse af lægemiddel, svarende til hvad vi har observeret i glioblastomceller (figur 5B). H69 /41d-celler var også i stand til at inddrive proliferativ kapacitet efter behandling med Hsp90 inhibitor radicicol (figur 5C). Sammenlignet med den forælder H69-cellelinje, udviste H69 /41d-celler lignende reaktioner på Hsp90 inhibering med hensyn til proliferation inhibering i nærvær af lægemiddel, selvom celledød havde tendens til at forekomme ved lidt lavere koncentrationer end set med H69-celler (figur 5D). Nedbrydning af kunders proteiner og induktion af andre varmechokproteiner var også ens i de to cellelinier (figur 6A). Som ovenfor er dette udelukker forskelle i narkotika behandling mellem de to cellepopulationer, og indikerer, at forskellene skyldes begivenheder nedstrøms for Hsp90 hæmning, der specifikt berører, om celler undergår reversibel eller irreversibel proliferationsstandsning. SAHF dannelse blev også forringet i H69 /41d celler (Figur 6B). I H69-celler, blev SAHF detekteret maksimalt hos ca. 35% af cellerne (figur 6C). I modsætning hertil kun geldanamycin behandling forårsagede en beskeden stigning i SAHF i H69 /41d-celler og SAHF blev påvist i 4,5% af celler maksimalt (figur 6C).

A. Fotografier af H69 og H69 /41d celler under fase mikroskopi, ved lave (top paneler) og høje (nederst paneler) forstørrelse; B. H69 og H69 /41d-celler blev behandlet med 100 nM geldanamycin i 48 timer. Geldanamycin blev derefter fjernet og antallet af levedygtige celler blev vurderet på de angivne tidspunkter efter fjernelse lægemiddel. C. H69 og H69 /41d-celler blev behandlet med 5 pM radicicol i 48 timer. Radicicol blev derefter fjernet og antallet af levedygtige celler blev vurderet på de angivne tidspunkter efter fjernelse lægemiddel. D. MTT assay af H69 /41d celler behandlet i 48 h med geldanamycin.

H69 og H69 /41d celler blev behandlet i 48 timer med geldanamycin eller DMSO som kontrol køretøj. A. Totale cellelysater blev opsamlet efter 48 h behandling og analyseret ved Western blotting som i figur 3. B. DMSO-behandlede celler blev farvet for SAHF 2 dage efter fjernelse af DMSO. Geldanamycin-behandlede celler blev farvet for SAHF 2, 4 og 6 dage efter fjernelse lægemiddel. Repræsentative fluorescens mikroskopi billeder af H69 og H69 /41d cellekerner, seks dage efter fjernelse af geldanamycin, er vist. C. SAHF i H69 (lysegrå) og H69 /41d-celler (mørkegrå) blev talt på de angivne tidspunkter efter fjernelse lægemiddel. Data er udtrykt som procentdelen af ​​kerner, der er SAHF positive. Barer viser den gennemsnitlige procentdel ± SE. D. Total celleekstrakter af ubehandlet H69 og H69 /41d celler blev analyseret for ekspression af p21 protein ved Western blotting.

For at direkte vurdere den genetiske forhold H69 celler med H69 /41d celler, DNA var isoleret fra begge cellelinier og analyseret under anvendelse Affymetrix Genome-Wide Humant SNP Array 6.0 chips, der indeholder prober til 900.000 enkelt-nukleotid polymorfisme og et tilsvarende antal prober til vurdering kopital variation. Figur S2 viser karyotyper af de to cellelinier rekonstrueret fra disse data (hver sammenlignes med en Affymetrix henvisning karyotype). H69 celler viser omfattende kromosomafvigelser som forventes for kræftceller. Disse tab, gevinster og regioner forstærkning /kopi nummer variation er meget ens mellem H69 og H69 /41d celler, viser utvetydigt, at de er klonbeslægtede. Nogle forskelle var tydelig mellem de to cellelinjer. Disse omfatter en 4,8 Mbp sletning på enkelt kopi af kromosom 2, som indeholder ca. nitten gener og en 9,6 Mbp sletning på en kopi af kromosom 11, der indeholder ca. 83 gener. Der er også en gevinst på den lange arm af kromosom 3 og et tab af en delvis lange arm af kromosom 15. Men SNP /kopital analyse ikke pege på en enkelt defineret genetisk sted, der kan forklare, hvorfor H69 /41d celler er i stand til at unddrage sig Hsp90 hæmmer-induceret ældning. Som en anden fremgangsmåde til at bestemme den mekanisme, ved hvilken disse celler unddrage Hsp90 inhibitor-induceret senescens, blev celler screenet for en række proteiner, der tidligere er vist at have vigtige roller i senescens. p21 (CDKN1A, p21Waf1 /Cip1) er et sådant protein, der er af særlig interesse, da det er blevet vist at inducere senescens i cancerceller, der mangler p53 [27]. p21 udtrykkes i H69-celler, men kan ikke påvises i H69 /41d-celler (Figur 6d). På grund af dens kendte rolle i induktion og vedligeholdelse af degeneration [26], tab af p21-ekspression giver en plausibel forklaring på den manglende af H69 /41d celler til at undergå aldring som reaktion på Hsp90-hæmmere.

Diskussion

i tidligere undersøgelser, har den mest almindeligt beskrevne reaktion af kræftceller til Hsp90 hæmning været cellecyklusstop. Denne cellecyklusstop har generelt været antaget at være reversible i naturen, selv om de fleste undersøgelser ikke løse dette direkte. Vækststandsning kan forekomme ved enten G1 /S eller G2 /M overgang [28], [29] og er sandsynligvis en konsekvens af Hsp90 afhængighed af proteiner, såsom CDK4, cdc2 og polo-lignende kinase [30] – [ ,,,0],32]. I en undergruppe af cancer celletyper, er Hsp90-inhibitorer vist sig at inducere apoptose. Disse omfatter småcellet lungekræft celler og myelomatose celler [18], [33].

Bortset fra forbigående cellecyklusstop og celledød, en tredje cellulær skæbne for cancerceller er ældning. For kræftceller, er denne undertiden benævnt “forhastet” eller “accelereret” cellulær aldring at skelne det fra den replikative aldring, at normale celler undergår efter at have nået deres Hayflick grænse [34], [35]. Ældning i cancer er blevet undersøgt i to sammenhænge: den første af disse er den degeneration ses som reaktion på onkogen aktivering, hvor det kan spille en rolle i at beskytte organismer fra at udvikle kræft; den anden af ​​disse er som en reaktion på kræftbehandling [36]. Kemoterapeutiske stoffer, der skader DNA synes at inducere senescens i langt højere grad end midler, der er målrettet mikrotubuli [37]. Dette er mere sandsynligt at forekomme med eksponering for lavere doser af lægemiddel, med højere doser forårsager apoptose. Kemoterapi-induceret aldring er blevet observeret både i cellekultur og i dyremodeller [38].

Nøglen, afgørende træk af senescentceller er, at de forbliver metabolisk aktive, men undergår en vedvarende tilbagetrækning fra cellen cyklus, der er ikke vendes ved standard mitogene stimuli. Efter forbigående eksponering for lave koncentrationer af geldanamycin, småcellet lungekræft celler forblev levende og metabolisk aktive (som angivet ved trypanblåteksklusion og MTT-assays). Men disse celler gennemgik en proliferationsstandsning der blev opretholdt i mere end tredive dage, til trods for den regelmæssige tilsætning af frisk medium indeholdende føtalt kalveserum, en rig kilde til mitogener. Spredningen anholdelse var tydeligt både fra levende celletal og fra BrdU-inkorporering assays.

Ud over permanent proliferationsstandsning, har yderligere markører for ældning blevet udviklet, selv om ingen af ​​disse er i øjeblikket ses som værende en endelig markør for den aldrende tilstand [39]. Et karakteristisk sæt af morfologiske ændringer er blevet beskrevet til senescentceller der omfatter celle udvidelsen og en forøget granularitet af cytoplasmaet [40]. Disse funktioner var tydelige i H69 småcellet kræftceller, hvor vedvarende proliferationsstandsning var blevet fremkaldt af Hsp90-hæmmere. (De viser ikke udfladningen beskrevet for adhærente celler, da de småcellet lungecancer-celler anvendt i denne undersøgelse vokse i suspension.) SAHF er en anden markør, som det normalt er tilfældet i aldrende celler, og som menes at have en rolle i bevarelsen af senescent fænotype. SAHF var til stede i småcellet lungekræft celler, hvor vedvarende proliferationsstandsning var blevet fremkaldt af Hsp90-hæmmere. Ekspression af SAHF blev opretholdt i op til seks dage efter fjernelse af Hsp90 inhibitor (den længste tidspunkt undersøgte) og tidsforløbet for deres udseende svarede til tidligere studier på induktion af tidlig ældning af forskellige agenter [41], [42] . Aktivering af DNA beskadigelse respons er også almindeligt observeret i senescens, hvor den har en rolle i både initieringen og opretholdelsen af ​​aldrende fænotype [25], [26]. Hsp90-hæmmere (både geldanamycinderivaterne og radicicol) aktiveret en DNA-skader reaktion, der blev opretholdt efter inhibitor fjernelse. Dette resultat er også i overensstemmelse med en senescens fænotype og tilvejebringer en mekanisme, ved hvilken disse inhibitorer aktiverer senescens.

DNA-skader, enten telomert eller ikke-telomere, er den mest udbredte kendetegnet inducer af senescens. Samt at det er en markør for senescens, aktivering af DNA-skade respons af Hsp90-inhibitorer tilvejebringer også en mekanisme, hvormed de fremkalder senescens i småcellet lungecancer-celler. Tidligere undersøgelser har også peget på en sammenhæng mellem Hsp90 og DNA-skader:. Både telomerase og Fanconi anæmi DNA skade responset pathway er afhængige af Hsp90 for deres aktivitet [43], [44]

Ældning-associeret β- galactosidase (SAβgal) er også blevet meget anvendt som en senescens markør [35]. SAβgal aktivitet opdages som en konsekvens af udvidelsen af ​​det lysosomale rum i senescentceller, men er ikke påkrævet for ældning induktion eller vedligeholdelse [45]. Småcellet lungekræft celler behandlet med Hsp90-hæmmere var ikke positive for SAβgal. Adriamycin heller ikke fremkalde SAβgal i småcellet lungekræft celler, når de anvendes i koncentrationer, der inducerede denne markør i andre cancer celletyper. Dette antyder, at SAβgal ikke kan være en nyttig markør for senescens i småcellet lungecancer. En mulig forklaring er, at disse celler har ringe cytoplasmaet og er specialiserede sekretoriske celler, som kan have en relativt lille lysosomale rum.

Taget sammen ovennævnte data viser, at Hsp90-inhibitorer inducerer en vedvarende proliferationsstandsning der har funktioner i overensstemmelse med tidlig ældning. Denne tidlig ældning forekom ved koncentrationer af geldanamycin som korrelerede tæt med koncentrationerne, der er nødvendige for at inducere nedbrydningen af ​​veletablerede Hsp90 klient proteiner og at inducere ekspressionen af ​​andre varmechokproteiner (et almindeligt anvendt markør for Hsp90 inhibering). For tidlig ældning blev også induceret af 17-AAG (tanespimycin; 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin), en geldanamycinderivat der er blevet testet i kliniske forsøg [46]. 17-AAG induceret fremadskridende alderdom i en koncentration, der ligner de koncentrationer, der opnås i plasmaet hos patienter behandlet ved den maksimalt tolererede dosis af denne forbindelse [12], hvilket antyder, at denne reaktion er klinisk relevant. Senescens induktion af Hsp90-inhibitorer kræver hverken p53 eller Rb, som begge disse tumorsuppressorer vides at være muteret i H69-cellelinje anvendt i denne undersøgelse.

I nogle forsøg populationer af celler gjorde begynde at vokse efter langtidsdyrkning af senescente H69-celler. En af disse cellepopulationer, betegnet H69 /41d, blev karakteriseret i detaljer. SNP og kopiantal analyse af disse celler viser, at mens de klart er afledt fra H69-celler, de har en distinkt sæt af genetiske ændringer. Disse celler udviser lignende reaktioner på Hsp90 inhibering som overordnet H69-celler med hensyn til proliferation inhibering i nærvær af lægemiddel og induktion af celledød ved høje geldanamycinderivater koncentrationer. Men de undergår en reversibel, snarere end irreversibel proliferationsstandsning som reaktion på Hsp90 hæmning. H69 /41d celler viser også identiske reaktioner på den forælder cellelinje med hensyn til nedbrydning af Hsp90 klient proteiner og induktion af andre varmeshockproteiner. Således denne form for “modstand” til Hsp90 hæmning adskiller sig klart fra, der er beskrevet i tidligere undersøgelser, hvor modstanden var på grund af ændringer i narkotika enzymer og blev afspejlet i et krav om højere doser for at se cellulære virkninger [47]. Isoleringen af ​​disse celler viser, at i princippet kan småcellet lungecancer-celler med yderligere genetiske ændringer unddrage Hsp90-induceret for tidlig ældning. p21 (CDKN1A) har tidligere vist sig at være en vigtig regulator af senescens, en egenskab, der synes at være uafhængig af dens inhiberende aktivitet over cyclinafhængige kinaser [48]. p21 er reguleret af både p53 og p53-uafhængige mekanismer, og kan inducere sensescence i celler, som mangler p53 (som det er tilfældet for H69-celler) [27].