PLoS ONE: FADS2 Funktion Tab på Cancer Hotspot 11q13 Locus viderestillet Lipid Signaling Precursor Synthesis til Usædvanlige eicosanoid fedtsyrer

abstrakt

Baggrund

Gener der koder for de fedtsyredesaturaser (FADS1, 2, 3) lokaliseret ved kræft genomiske hotspot 11q13-locus er nødvendige for biosyntesen af ​​20 carbon polyumættede fedtsyrer (PUFA), som er direkte eicosanoid forstadier. I flere cancer cellelinjer, FADS2 kodet Δ6 og Δ8 desaturering er ikke funktionel.

Metode /vigtigste resultater

Analyse MCF7 celle fedtsyrer med detaljeret strukturel massespektrometri, viser vi, at i mangel af FADS2 aktivitet, det FADS1 produkt Δ5-desaturase opererer at producere 5,11,14-20:3 og 5,11,14,17-20:4. Disse PUFA mangler den 8-9 dobbeltbindingen i eicosanoid signalering forstadier arachidonsyre (5,8,11,14-20:4) og eicosapentaensyre (5,8,11,14,17-20:5). Heterolog ekspression af FADS2 genskaber Δ6 og Δ8-desaturaseaktivitet og normal eicosanoid forløber syntese.

Konklusioner /Betydning

Tabet af FADS2-kodet aktiviteter i cancerceller lukker normal PUFA biosyntese, slette endogene levering af eicosanoid og nedstrøms docosanoid forstadier, og erstatte dem med usædvanlige butylen-afbrudt fedtsyrer. Hvis sammenfattet

in vivo

, den normale eicosanoid og docosanoid celle signalering miljø ville være udtømt, og ændret på grund af reduktion og substitution af normale substrater med usædvanlige substrater, med uforudsigelige konsekvenser for cellulær kommunikation.

Henvisning : Park WJ, Kothapalli KSD, Lawrence P, Brenna JT (2011) FADS2 Funktion Tab på Cancer Hotspot 11q13 Locus viderestillet Lipid Signaling Precursor Synthesis til Usædvanlige eicosanoid fedtsyrer. PLoS ONE 6 (11): e28186. doi: 10,1371 /journal.pone.0028186

Redaktør: Daniel Tomé, Paris Institute of Technology for Life, Mad og Environmental Sciences, Frankrig

Modtaget: September 16, 2011; Accepteret: November 2, 2011; Udgivet: November 30, 2011

Copyright: © 2011 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Flere menneskelig cytogenetiske og fine kortlægningsundersøgelser har PIN spidse HSA 11q13-locus som et stort hotspot for en række humane cancere [1], [2], [3], [4], [5]. Talrige genetiske mekanismer er blevet rapporteret, herunder 11q13 sletninger, tab af heterozygositet, translokationer og allel forstærkning [3], [5]. Den fedtsyredesaturase klynge (FADS), kodet af gener

FADS1

,

FADS2

, og

FADS3

, lokalisere inden for en 100 kb region på human kromosom 11q12-13.1 [ ,,,0],6], [7]. FADS2 og FADS1 koder for kritiske enzymer til langkædet polyumættet fedtsyre (LCPUFA) biosyntese, indføring dobbeltbindinger mellem specifikke carbonatomer. Omega-3 (ω3 eller n-3) og omega-6 (ω6 eller n-6) PUFA er vigtige næringsstoffer i forbindelse med de fleste af de sygdomme hos mennesker, især kardiovaskulære (CVD), kræft, diabetes og metabolisk syndrom, og de er nøglen strukturelle komponenter af neuralt væv [8], [9]. Den LCPUFA DGLA (20:3n-6), ARA (20:4n-6), EPA (20:5n-3) og DHA (22:6n-3) er prækursorer til cellesignalering eicosanoider og deres modifikation af biosyntetisk inhibering af downstream stofskifte er mål meget værdifulde stof, for eksempel, cyclooxygenase og lipoxygenaseinhibitorer, og for nylig docosanoids der er lægemiddelkandidater [10].

FADS2 kodet Δ6-desaturase katalyserer det første og hastighedsbegrænsende trin i biosyntese af LCPUFA. I flere cancerceller betyder desaturering ikke forekomme, hvilket kan skyldes inaktivering af desaturase eller opstrøms (fx CoA produktion) eller nedstrøms (for eksempel acyl transferase) trin. Årsagen til denne mangel er blevet foreslået at skyldes omfattende kromosomale deletioner, men ingen molekylære beviser er tilgængelig [11], [12]. Den Δ8-desaturation substrater 20:2n-6 og 20:3n-3 er ofte detekteres, hvilket antyder, at forlængelsen skridt er funktionel [12], [13]. Indtil for nylig blev de Δ8-desaturation substrater 20:2n-6 og 20:3n-3 almindeligt anset dead-end produkter, selv om de findes i humant plasma og røde blodlegemer samt andre væv. Vi viste den første molekylære beviser, at FADS2 katalyserer Δ8-desaturering for begge disse substrater, som repræsenterer en alternativ rute til LCPUFA biosyntese i pattedyr, hvor de omdannes til eicosanoid precursor LCPUFA [14]. Denne vej kan være til rådighed, når Δ6-desaturaseaktivitet er kompromitteret.

Den usædvanlige tab af PUFA desaturaseaktivitet i flere cancerceller fik os til at hypotesen, at den primære defekt beror på selve desaturase, og ikke andre steder, såsom i aktiveringen af ​​PUFA ved CoA syntese eller syntese af phosphoglycerider som acceptorer af spirende LCPUFA. Vi bekræftede, at human brystcancer MCF7-celler ikke besidder nogen evne til biosyntese af LCPUFA grund af fravær af Δ6-desaturaseaktivitet [12]. Her viser vi genoprettelsen af ​​denne metaboliske defekt ved heterolog ekspression af FADS2, bevis for hidtil ukendte substratspecificitet for FADS1, og konkurrencen mellem FADS1 og FADS2 for de samme substrater, hvilket fører til produktion af usædvanlige LCPUFA som ikke substrater for eicosanoid produktion.

Resultater og diskussion

FADS2 og FADS1 forbigående transficerede MCF7-celler blev undersøgt for tegn på bioaktivitet mod 18:2n-6 og 18:3n-3. FADS2 transficerede celler udviste aktivitet over for både substraterne; gaskromatografi-kovalent addukt kemisk ionisering tandem-massespektrometri (GC-CACI-MS /MS) bekræftede de nye toppe, der skal 18:3n-6 og 18:4n-3 (fig 1). Som forventet blev der ikke produkter observeret, når enten 18:2n-6 eller 18:3n-3 blev inkuberet med FADS1 og de tomme vektor kontrol. Disse data giver den første entydige molekylære beviser, at den metaboliske defekt i disse celler kan genoprettes ved at erstatte det hastighedsbegrænsende Δ6-desaturase-enzym, der kodes af FADS2

A:. Intet produkt ses i FADS1-transficerede celler. B: FADS2 transficerede celler Δ6-Afmæt 18:2n-6 → 18:3n-6 (9,12-18:2 → 6,9,12-18:2) og 18:3n-3 → 18:4n-3 (9,12,15-18:3 → 6,9,12,15-18:4).

Når FADS1-transficerede celler blev inkuberet med 20:2n-6 og 20:3n -3, CACI-MS /MS viser forstærkningen af ​​syntetisk funktion til at generere to nye butylen-afbrudt PUFA toppe: 5,11,14-20:3 og 5,11,14,17-20:4 henholdsvis (figur 2) . Disse to LCPUFA er analoger til arachidonsyre (5,8,11,14-20, 4) og eicosapentaensyre (5,8,11,14,17-20:5) hhv. Vore data viser, at i det væsentlige fravær af Δ8-desaturaseaktivitet (FADS2), den Δ5-desaturase (FADS1) opererer på 20:2n-6 og 20:3n-3. Δ6-desaturering (FADS2) er normalt ca. 10 gange mere aktiv end Δ5-desaturering (FADS1), det er således sandsynligt, at transformation under celle FADS1 aktivitet ville vedvare når FADS2 er inaktiv. Men de foretrukne substrater for FADS1 er ikke essentielle fedtsyrer (18:2n-6 og 18:3n-3), men deres forlængelse produkter 20:2n-6 og 20:3n-3. FADS1 virke på disse substrater genererer usædvanlige butylen-afbrudte carbon produkter og vores resultater viser, at disse sjældne fedtsyrer kan produceres i cancerceller. Dette er den første molekylære beviser hidtil ukendt FADS1 substratspecificitet for 20:2n-6 og 20:3n-3 fedtsyrer. Desuden FADS2-transfekterede celler demonstrerer endegyldigt, at

FADS2

gen produkt Δ8-Afmætter 20:2n-6 og 20:3n-3 til 20:3n-6 (DGLA) og 20:4n-3 (ETA ) henholdsvis svarende til vores resultater i heterologt transformeret gær [14]

A:. FADS1-transficerede celler Δ5-Afmæt 20:2n-6 → 5,11,14-20:3 og 20:3n- 3 → 5,11,14,17-20:4. B: FADS2 transficerede celler Δ8-Afmæt 20:2n-6 → 20:3n-6 og 20:3n-3 → 20:4n-3

Selv om det er velkendt, at begge. n-3- og n-6 PUFA substrater konkurrerer om samme enzymer, vores nuværende data viser FADS1 og FADS2 konkurrerer om de samme substrater (figur 2). Nettet konsekvens er substitution af de inaktive 5,11,14-20:3 og 5,11,14,17-20:4 for ARA (5,8,11,14-20:4) og EPA (5, 8,11,14,17-20 5), henholdsvis med uforudsigelige konsekvenser for eicosanoid-medieret celle-celle parakrin signalering. Dysregulering af eicosanoid signalering er knyttet til tumorudvikling, angiogenese og metastase i dyremodeller [15]. En dobbeltbinding ved stilling 8 er påkrævet for cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LOX) og thromboxan-biosyntese, og dermed fraværet af dobbeltbindingen i stilling 8 gør 5,11,14-20:3 og 5,11,14, 17-20:4 inaktiv som substrater til biosyntese af de fleste eicosanoider [16], [17], [18]. Desuden mulige virkning af butylen-afbrudt PUFA som kompetitive inhibitorer af eicosanoid biosyntetiske enzymer er ukendt, da er aktiviteten for andre centrale eicosanoid syntetiske enzymer (f.eks cytochrom P450) hvis handlinger på normale dele af usædvanlige fedtsyrer ville resultere i produkter med ukendt Aktivitet (er).

modeluner gener, der koder for enzymer, der er nødvendige for PUFA biosyntese opstod evolutionært ved gen dobbeltarbejde begivenheder. Trods central betydning FADS2 og tabet af sin funktion i flere kræftceller, har de molekylære detaljer og konsekvenser af FADS2 tab ikke beskrevet eller undersøgt. FADS2 vides at have aktivitet over mindst syv substrater (18:2n-6, 18:3n-3, 20:2n-6, 20:3n-3, 24:4n-6, 24:5n-3, 16: 0). Tabet af FADS2-kodet aktiviteter i cancerceller fuldstændig lukker de klassiske og alternative PUFA pathways, fjerne eicosanoid og docosanoid precursor biosyntese fra plantebaserede PUFA linolsyre og linolensyre og således begrænse celle-cellesignalering (figur 3). Mange undersøgelser har fundet stærke associationer mellem enkelte nukleotid polymorfier i FADS genklynge og komplekse fænotyper relateret til kronisk sygdom, samt til lang kæde PUFA niveauer [19], [20]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for fuldt ud at forstå konsekvenserne af FADS genfunktion tab og /eller modulation baseret på SNP’er i neoplasma. Tidlige undersøgelser viste, at mikro-celle medieret overførsel af HSA11 i MCF7-celler reducerede tumorgenicitet, der tyder på potentielle tumorsuppressorgener på dette kromosom [21].

Δ6- og Δ8-desaturation trin er fraværende i MCF7, hvilket fører til Δ5-desaturering af 11,14-20:2 til 5,11,14-20:3 når FADS1 er funktionel. De analoge veje til n-3 LCPUFA konvertere 11,14,17-20:3 → 5,11,14,17-20:4 (ikke vist). FADS2 menes også at være involveret i C22 LCPUFA biosyntese (ikke vist).

Vores resultater viser, at en primær molekylær defekt i MCF7-celler ligger inden for FADS2 genet forårsager tab af FADS2-kodet Δ6-desaturase aktivitet. Kompensation for FADS2 funktion ved FADS1 fører til produktion af 5,11,14-20:3 og 5,11,14,17-20:4 begge primært blindgyde fedtsyre-produkter, der ikke kan være precursorer for de fleste eicosanoider og er sandsynligvis være kompetitive inhibitorer. Den fysiologiske betydning af butylen afbrudt PUFA i cancerceller opfordrer til yderligere detaljeret undersøgelse. Vores nuværende resultater giver et skub til bedre at forstå den rolle, fedtsyredesaturaser, især FADS2 som en tumor suppressor i neoplastiske lidelser.

Materialer og metoder

Plasmid vektor konstruktion

den proteinkodende sekvenser af FADS1 (GenBank Accession # EF531577) og FADS2 (GenBank Accession # EU780003) blev klonet i pcDNA3.1 ekspressionsvektor under anvendelse cDNA fra neonatal bavian levervæv. CDNA blev opnået fra opsparede prøver udtaget fra en undersøgelse godkendt af Cornell University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, protokol # 02-105). Analyse og sammenligning af aminosyresekvens af bavian FADS1 viste 95% identiteter og 97% positive med human FADS1 (AF084558), hvorimod viste bavian FADS2 98% identiteter og 99% positive med human FADS2 (NM_004265). Tidligere har vi vist hidtil ukendt Δ8-desaturering funktion ved hjælp af bavian FADS2 [14].

MCF7 cellekultur og fedtsyrer tilskud

I transfektionsforsøg MCF7-celler blev dyrket i MEM-α medier med 10 % Lipid-reduceret FBS (medier og serum opnået fra HyClone) ved 37 ° C i en fugtig miljø med 5% CO

2. Humane brystkræft MCF7-celler (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) var den slags gave fra Dr. Rui Hai Liu, Cornell University. De FADS1 og FADS2 konstruktioner blev transficeret i MCF7-celler under anvendelse af Lipofectamine LTX (Invitrogen, USA) i henhold til fabrikantens anbefalinger. Fireogtyve timer efter transfektion blev MCF7-celler suppleret med 100 uM af albumin bundet 18:2n-6, 18:3n-3, 20:2n-6 og 20:3n-3 fedtsyrer og blev inkuberet i yderligere 24 timer. Salg

Fedtsyreanalyse

efter inkubation med fedtsyrer, blev cellerne vasket to gange med 1X PBS og fjernes ved trypsinisering. Cellerne blev høstet ved centrifugering, og cellepelleten blev forarbejdet til lipid ekstraktion. Fedtsyremethylestere præparat blev udført under anvendelse af en modificeret ettrins fremgangsmåde til Garces og Mancha [22]. Analyse var ved gaskromatografi-flamme ionisering detektion (GC-FID) [8] og peak identifikation blev bekræftet ved GC-kovalent addukt kemisk ionisering tandem massespektrometri (GC-CACI-MS /MS) [14], [23].