PLoS ONE: Dybt Sekventering af kræftrelaterede gener Revealed Gnas Mutationer at være forbundet med intraduktal Papillær mucinøs Neoplasmer og dens vigtigste Bugspytkirtelkræft Duct Dilation

Abstrakt

Baggrund

For at klarlægge de genetiske mutationer forbundet med intraduktal papillære mucinøse neoplasmer (IPMN) og IPMN-relaterede pancreas tumorer, vi gennemførte cancerrelateret gen profilering analyser ved hjælp af ren bugspyt og resektion pancreas væv.

Metoder

Pure bugspyt blev indsamlet fra 152 patienter [ni med en normal bugspytkirtel, 22 med kronisk betændelse i bugspytkirtlen (CP), 39 med pancreas ductus adenocarcinom (PDAC), og 82 med IPMN], og resektion væv fra bugspytkirtlen blev indsamlet fra 48 patienter (seks IPMNs og 42 PDACs). Det ekstraherede DNA blev amplificeret ved multiplex polymerasekædereaktion (PCR) målretning 46 cancerrelaterede gener indeholdende 739 mutationsbegivenheder hotspots. De mutationer blev analyseret ved hjælp af en halvleder-baserede DNA-sequencer.

Resultater

Blandt de 46 cancer-relaterede gener,

KRAS

Gnas

mutationer var hyppigst påvist i både PDAC og IPMN tilfælde. I ren bugspyt,

Gnas

mutationer blev påvist i 7,7% af PDAC tilfælde og 41,5% af IPMN tilfælde (

s

0,001 vs. andre). Alle PDAC tilfælde med

Gnas

mutationer (n = 3), blev ledsaget af IPMN. Multivariat analyse viste, at

Gnas

mutationer i IPMN tilfælde var forbundet med dilaterede vigtigste pancreas kanaler (MPD,

s

= 0,016), mens der sås ingen statistisk uafhængige foreninger med kliniske variabler for

KRAS

mutationer. I de resektion pancreas væv,

Gnas

mutationer blev fundet i 50% af PDAC sager samtidig med IPMN, 33,3% af PDAC sager afledt af IPMN, og 66,7% af IPMN tilfælde, mens der ikke

Gnas

mutationer blev påvist i tilfælde af PDAC uden IPMN.

konklusioner

Gnas

mutation blev specifikt fundet i tilfælde med IPMN og det blev spekuleret på, at nogle PDACs kunne være påvirket ved samtidig men separat placeret IPMN i deres patogene mekanisme. Desuden

Gnas

mutation blev signifikant associeret med MPD dilatation i IPMN tilfælde, hvilket tyder på dens rolle i slimhypersekretion

Henvisning:. Takano S, Fukasawa M, Maekawa S, Kadokura M, Miura M , Shindo H, et al. (2014) Deep Sekventering af kræftrelaterede gener Revealed

Gnas

Mutationer at være forbundet med intraduktal Papillær mucinøs Neoplasmer og dens vigtigste Pancreas Duct Dilation. PLoS ONE 9 (6): e98718. doi: 10,1371 /journal.pone.0098718

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: 31 Januar 2014; Accepteret: Maj 2, 2014 Udgivet: 4 Jun 2014

Copyright: © 2014 Takano et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (25860527, https://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/) og ved tilskud fra Fonden for Advancement of International Science (https://www.fais.or.jp/grant/fy25/01_file/2013_01members.pdf). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

intraduktal papillære mucinøs neoplasme (IPMN) er en pancreas eksokrine tumor karakteriseret ved cystisk dilatation af de væsentligste og /eller filial pancreas kanaler; Kanalen er foret med et mucin-producerende atypisk epitel, som ofte prolifererer i en papillær fashion [1] – [3]. IPMN er forbundet med et spektrum af sygdomme lige fra adenom til invasive pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC). PDAC kan afledes fra IPMN eller kan samtidigt udvikle sig i andre regioner i et pancreas hvori IPMN har udviklet. De to IPMN-relaterede former af PDAC anses for at være forskellige sygdomstilstande enheder på grund af deres forskellige proximities til IPMN i pancreas. , Prognosen for disse IPMN-relaterede former for PDAC er dog ofte bedre end almindelig PDAC hvis tidlig diagnose stilles [4], [5]. I modsætning hertil er de genetiske kendetegn ved disse to IPMN-relaterede former af PDAC og årsagerne til deres forskellige prognoser ikke fuldt forstået.

PDAC opstår som følge af ophobning af genetiske og epigenetiske mutationer, som giver en selektiv fordel for cancerceller [6], [7]. Mutationer i

KRAS

,

CDKN2A

,

TP53

, og

Smad4

er hyppigt rapporteret i tilfælde af PDAC bruger konventionelle metoder såsom direkte sekventering [ ,,,0],8]. For nylig er hel-exome analyse under anvendelse næste generation sekventering afslørede også højfrekvente ændringer i disse få gener [6], [7], [9].

I modsætning hertil somatiske onkogene mutationer i guaninnukleotid bindende protein, alpha stimulerende (

Gnas

) -kodende G-protein, er for nylig blevet identificeret i 41-66% af IPMN tilfælde [10] – [12].

Gnas

mutationer er også blevet identificeret i flere tumorer i det endokrine system [13], nogle hypofyseadenomer [14], og i McCune-Albright syndrom [15]. Disse mutationer opstår meget tidligt i den naturlige udvikling af IPMN [10] og er meget specifikke for IPMN [11], [12], [16]. Med undtagelse af en lille procentdel af pancreas intra-epitel neoplasier (PanINs),

har sjældent blevet opdaget Gnas

mutationer i de fleste tilfælde af PDAC eller andre cystiske neoplasmer [11], [12], [16]. Men det er uvist, hvor den kliniske præsentation af IPMN kan være påvirket af

Gnas

mutation. Desuden er det også ukendt, om IPMN-relaterede PDACs er forbundet med

Gnas

mutationer

Påvisningen af ​​disse mutationer i bugspyt [17] -. [21] eller i prøver opnået ved endoskopisk ultralyd fin-nål aspiration (EUS-FNA) [22] hjælpemidler i diagnosticering af tidlige fase sygdom. Men kun få almindeligt muterede gener kan analyseres i små prøver på grund af de begrænsninger i konventionel sekventering teknologi. At afhjælpe disse begrænsninger har halvleder-baserede næste generation sekventering nylig blevet udviklet og aktiveret hurtig, dyb, og omkostningseffektiv sekventering af en bred vifte af DNA fra små klinisk-opnåede prøver [23].

denne undersøgelse blev halvleder-baseret sekventering anvendes til at udføre cancerrelateret gen mutation analyse for pancreas neoplasmer med små vævsprøver. Brug ren bugspyt, vi undersøgte mutations profilering af pancreas neoplasmer og sammenslutningen af ​​denne profil med de kliniske variable. Desuden bruger resekterede væv, vi sammenlignet forskellene i mutations profilering af de to typer af PDACs der blev relateret til IPMN (PDAC afledt IPMN og PDAC samtidig med IPMN).

Materialer og metoder

Patienter og prøver

De rene bugspyt og tilhørende kliniske oplysninger blev indhentet fra 152 sager [CP (kronisk betændelse i bugspytkirtlen), n = 22; PDAC, n = 39; IPMN, n = 82; normale pancreas, n = 9], der blev behandlet ved Yamanashi University Hospital 2000-2012 (tabel 1). Grundige pancreas undersøgelser blev udført i alle tilfælde. Endoskopisk nasopancreatic dræning (ENPD) blev udført under endoskopisk retrograd cholangiopancreatography (ERCP) for at opnå bugspyt for cytologisk test. Det rene bugspyt opnået og umiddelbart opbevaret ved -80 ° indtil brug. I tilfælde med biliær sygdom og en normal pancreas blev ENPD udføres for at undgå post-ERCP pancreatitis, og de opsamlede bugspyt blev klassificeret som normale pancreas tilfælde i analysen. Resektion væv blev opnået på det samme hospital 2006-2012 fra sager med IPMN (n = 6) og PDAC (n = 42), som vist i tabel 2. Af de PDAC vævsprøver, 21 blev macrodissected frosne prøver og 21 blev mikrodissekeres formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) prøver, mens seks af de IPMN prøver var frosne prøver. Diagnosen og klassifikation af IPMN var baseret på de internationale konsensus retningslinjer for forvaltningen af ​​IPMN og mucinøse cystiske neoplasmer i bugspytkirtlen, der blev oprettet i 2006 [1]. Denne undersøgelse blev godkendt af Human Ethics Review Committee for Yamanashi Universitetshospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

DNA-ekstraktion

DNA fra resektion væv blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) for de frosne prøver og QIAamp DNA FFPE Kit (Qiagen) for FFPE prøver. DNA fra den rene bugspyt blev ekstraheret under anvendelse af DNeasy Blood Mini Kit (Qiagen) i henhold til fabrikantens anvisninger. I gennemsnit 1,4 ug og 0,3 ug DNA blev ekstraheret fra de frosne prøver og FFPE prøver henholdsvis og ca. 3-4 ug DNA blev ekstraheret fra 400 pi ren bugspyt.

Fremstilling af amplicon biblioteker

Ion AmpliSeq Cancer Panel (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt til at generere målamplicon biblioteker, som tidligere [23] beskrevne. Kort fortalt blev 10 ng DNA amplificeret ved PCR under anvendelse af forblandede Ion AmpliSeq Cancer Primer Pools indeholdende 190 primerpar og AmpliSeq HiFi Master Mix (Ion AmpliSeq Library Kit, Life Technologies). De 190 multipleksede amplikoner blev behandlet med FUPA Reagent (Life Technologies) for delvis fordøjelse af primersekvenserne og phosphorylering. Amplikonerne blev derefter ligeret til adaptorer fra Ion Xpress Barcode adaptere 1-16 Kit (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Efter ligering amplikonnerne undergik nick-translation og yderligere bibliotek amplifikation ved PCR for at fuldføre forbindelsen mellem adapterne og amplikoner. Den BioAnalyser høj følsomhed DNA Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) blev anvendt til at visualisere størrelse og rækkevidde og at bestemme bibliotekets koncentrationer.

Emulsion PCR og sekventering

Multiplexed stregkodede biblioteker blev amplificeret ved emulsion PCR på Ion Sphere partikler (ISP) ved hjælp af Ion One Touch 200 Template Kit v2 (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Efter den skabelon internetudbydere blev udvundet fra emulsionen blev de positive skabelon internetudbydere biotinyleret under emulsionen processen og beriget med Dynabeads MyOne Streptavidin C1 perler (Life Technologies). Sekventering blev udført på en personlig Genome Machine-sekventeringsapparat (Life Technologies) under anvendelse af Ion PGM 200 Sequencing Kit (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Da DNA-muterede tumorceller kan eksistere som mindre populationer i prøverne på grund af de små andele blandt de hele tumorvæv og /eller kontaminering med ikke-tumorceller, blev dyb sekventering analyse gennemført i denne undersøgelse for at detektere mutationer ved en hastighed så lav som 1%. Torrent Suite v2.2 software (Life Technologies) blev brugt til at parse barkode læser, at tilpasse læser til reference genom, og at køre målinger, herunder chip-loading effektivitet og total Læs tæller og kvalitet. Varianter blev identificeret med Variant Caller v2.0 software (Life Technologies). Kvaliteten værdi af det målrettede base blev sat til 21, hvilket svarer til 0,79% af sandsynligheden for fejl i mutationsdetektering. Tærsklen af ​​mutationen afsløring forholdet blev fastsat til ≥1%. Den Ion AmpliSeq Cancer Panel (Life Technologies), der blev brugt i biblioteket forstærkning målretter 739 mutation steder af 46 cancer-relaterede gener, der blev rapporteret i Katalog over somatiske mutationer i Cancer (COSMIC; hotspot mutationer) [24]; disse detekterede hotspot mutationer blev analyseret i kombination med de kliniske variable. De 46 cancerrelaterede gener er angivet på den vandrette akse af grafen i figur 1 og figur 2.

Y-aksen af ​​figuren repræsenterer procentdelen af ​​sager med mutationer i hvert gen. A. Ingen mutation blev påvist i den rene bugspyt fra tilfælde med normal pancreas væv. B.

Gnas

mutation blev påvist i et tilfælde (4,5%) med CP (kronisk betændelse i bugspytkirtlen) og en lille cystisk læsion. C.

Gnas

blev opdaget KRAS

mutationer i 7,7% (tre af 39 tilfælde) og 20,5% (otte af 39 sager), henholdsvis som havde bugspytkirtlen ductal adenocarcinom (PDAC).

Gnas

mutation blev påvist i alle tilfælde med intraduktal papillære mucinøs neoplasme (IPMN, n = 3). D.

Gnas

blev opdaget KRAS

mutationer i 41,5% (34 af 82 tilfælde) og 39,0% (32 ud af 82 tilfælde), henholdsvis med IPMN.

Y-aksen af ​​figuren repræsenterer procentdelen af ​​sager med mutationer i hvert gen. A. I resekterede væv,

KRAS

mutation blev påvist i 84,6% (22 af 26 tilfælde) af de pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) tilfælde, der ikke har intraduktal papillære mucinøs neoplasme (IPMN). B.

KRAS

blev opdaget Gnas

mutationer i 80% (otte af 10 tilfælde) og 50% (fem af 10 tilfælde), henholdsvis PDAC sager samtidig med IPMN. C.

KRAS

blev opdaget Gnas

mutationer i 66,7% (fire af seks tilfælde) og 33,3% (to af seks sager), henholdsvis PDAC sager afledt af IPMN. D.

KRAS

blev opdaget Gnas

mutationer i 100% (n = 6) og 66,7% (fire af seks sager), henholdsvis af invasive IPMN tilfælde.

Statistisk analyse

Foreningerne mellem genmutationer og kliniske variabler blev evalueret ved brug Fishers eksakte test eller χ

2 test og variabler med en

s

værdi 0,2 var inkluderet i den multivariate analyse. Kontinuerlige data såsom cystestørrelse og tilstedeværelsen af ​​vægmaleri knuder blev kategoriseret efter receiver operating characteristic (ROC) analyse (data ikke vist). For den multivariate analyse blev en multipel logistisk regressionsmodel anvendes, og en

s

-værdi. 0,05 blev anset for at være betydelige

Resultater

Deep sekvensanalyse af 46 cancer-relaterede gener i rene bugspyt

de kræftrelaterede mutationer i de 46 gener blev analyseret i den rene bugspyt af de 152 sager, med et gennemsnit på 2114 læser pr amplikon. De udtrukne varianter med listen over ændrede gener, variant frekvens, læse dybde, og tilsvarende COSMIC id’er fra dybe sekventering data i hvert enkelt tilfælde er blevet knyttet som underbyggende oplysninger til dette papir som Microsoft Excel-formaterede filer (File S1-S4) . Ingen mutation blev påvist i bugspyt af de ni tilfælde med normal pancreasvæv (fig. 1A). En

Gnas

mutation blev påvist i et tilfælde med CP, der blev ledsaget af en lille cyste (5 mm); dette kan have været repræsentant for en tidlig IPMN læsion (fig. 1B og fig. 3A).

KRAS

,

Gnas

, og

blev opdaget TP53

mutationer i både PDAC og IPMN tilfælde (Fig. 1).

KRAS

mutationer blev fundet i 20,5% af PDAC tilfælde (

s

= 0,0074 vs. normal og CP), og 39,0% af IPMN tilfælde (

s

0,001 vs . normal og CP).

Gnas

mutationer blev påvist i 7,7% af PDAC tilfælde og 41,5% af IPMN tilfælde (

s

0,001 vs. andre). IPMN var til stede i alle PDAC sager, der indeholdt

Gnas

mutation (n = 3).

A. Et tilfælde af CP med en lille cyste (blå pil), der havde den

Gnas

mutation (fig. 1B) i ren bugspyt på magnetisk resonans cholangiopancreatography (MRCP) billeddannelse. B-D. PDAC med

Gnas

mutationer adskilt fra samtidig IPMN. I tilfælde 30 (B) og 31 (C), MRCP imaging afslørede stenose i MPD i bugspytkirtlen hovedet nær PDAC (gul pilespids). Den IPMN var placeret i pancreas legeme (blå pil). CT-billeddannelse i tilfælde 28 (D) viste, at PDAC blev placeret i pancreas legeme (gul pilespids), hvorimod IPMN blev placeret i pancreas hoved (blå pil). En liste over tilfælde B-D er vist i tabel 4.

Da vores analyse viste, at

Gnas

mutation var specifikke for IPMN, sammenhængen mellem de udvalgte kliniske variable og

Gnas

status i de 82 IPMN sager blev statistisk analyseret for at afklare den kliniske relevans og betydning

Gnas

mutation i bugspyt. Den univariate analyse viste en sammenhæng mellem

Gnas

mutation og IPMN type (hovedkanal type) og mængden af ​​dilatation (≥6 mm) i MPD (tabel 3). I den multivariate analyse blev kun MPD dilatation uafhængigt forbundet med

Gnas

mutation (tabel 3). På den anden side,

KRAS

mutation var forbundet med placeringen (bugspytkirtlen krop og hale,

s

= 0,044) og mængden af ​​dilatation (≥6 mm) i MPD (

s

= 0,01) ved univariat analyse; men der var ingen uafhængig klinisk sammenhæng med denne mutation efter den multivariate analyse (data ikke vist).

Deep sekvensanalyse af 46 kræftrelaterede gener i opereret bugspytkirtlen tumorvæv

efter vi fandt

Gnas

mutation i sager, der havde PDAC samtidig med IPMN samt i sager, der kun havde IPMN fra analysen af ​​bugspyt, vi næste sekventeret vævsprøver at bestemme de mulige mutationsmønstre i IPMN , PDAC afledt IPMN, PDAC der var med samtidig IPMN, og PDAC alene. Sekventeringen blev udført i 48 operativt fjernede pancreas tumorer (PDAC uden IPMN, n = 26; PDAC samtidig med IPMN, n = 10; PDAC afledt af IPMN, n = 6; noninvasive IPMN, n = 6;. Figur 2). Det gennemsnitlige antal læser pr amplikon var 2582. De udtrukne varianter med listen over ændrede gener, variant frekvens, læse dybde, og tilsvarende COSMIC ID fra dybe sekventering data i hvert enkelt tilfælde er blevet knyttet til dette papir som underbyggende oplysninger i Microsoft Excel-formaterede filer (File S5-S8) .

KRAS

mutationer blev fundet i 84,6% af PDAC sager uden IPMN, 80% af PDAC sager, der var samtidig med IPMN, 66,7% af PDAC sager, der blev afledt af IPMN, og 100% af IPMN tilfælde.

blev opdaget Gnas

mutationer i 50% af PDAC sager, der var samtidig med IPMN (

s

= 0,0007 vs. PDAC uden IPMN), 33,3% af PDAC sager, der blev afledt af IPMN (

s

= 0,03 vs. PDAC uden IPMN), og 66,7% af IPMN tilfælde (

s

= 0,0004 vs. PDAC uden IPMN), mens der ikke

Gnas

mutationer blev påvist i tilfælde af PDAC uden IPMN.

Gnas

mutationer blev således kun fundet i IPMN og IPMN-associeret PDAC (PDAC samtidig med IPMN og PDAC afledt IPMN). En detaljeret liste over genmutationer er angivet i tabel 4. Således blev lignende karakteristika i genmutationer observeres for disse tre sygdomskategorier (tabel 4).

radiologiske billeder af PDAC samtidig med IPMN

De radiologiske billeder til sager 28, 30, og 31 i tabel 4 er vist i figur 3 som repræsentative billeder, der demonstrerede PDAC samtidig med IPMN. I disse tilfælde,

Gnas

mutationer blev påvist i PDAC og samtidig IPMN var placeret i en separat pancreas region. For eksempel, pankreatiske duktale strikturer som følge af PDAC var tydeligt i pancreas hovedet i hylsteret 30 (fig. 3B) og sag 31 (fig. 3C), mens IPMN var synlig i pancreas kroppen. I tilfælde 28 (fig. 3D), en lav-densitet masse læsion af PDAC og de multiple cystiske læsioner af IPMN tilsyneladende adskilt i bugspytkirtlen.

Association of mutationsmønstre mellem bugspyt og reseceret pancreas tumorvæv

Nogle gener såsom

ATM

,

BRAF

,

IDH1

, og

RB1 ​​

blev opdaget kun i bugspyt (Fig . 1), men ikke i de operativt fjernede væv (fig. 2). I modsætning hertil andelen af ​​sager med mutationer af

KRAS

eller

Gnas

var højere i de resektion væv end i bugspyt (fig. 1, 2). For at undersøge, om de mutationsvarianter profiler af bugspyt ordentligt repræsenteret de af de pankreatiske tumorer blev de Mutationprofilen mellem bugspyt og reseceret pancreatiske tumorvæv sammenlignet i 21 tilfælde, hvor begge prøver var tilgængelige. Blandt de

KRAS

(n = 17) og

Gnas Hotel (n = 7) mutationer findes i de 21 resektion pancreas tumorvæv,

KRAS

Gnas Salg mutationer blev påvist i bugspyt i 41,2% (7/17) og 71,4% (5/7) af tilfældene (tabel 5), hvilket viser, at følsomheden af ​​bugspyt til påvisning af mutationer af pankreatiske tumorer kan nå op på omkring 50%. Hvis vi ser på detaljerne blandt

KRAS

(n = 11) og

Gnas Hotel (n = 4) mutationer findes i resektion pancreas væv af the15 PDAC sager,

KRAS

og

påvistes Gnas

mutationer i bugspyt på 27,3% (3/11) og 50% (2/4) af tilfældene hhv. Blandt de

KRAS

(n = 6) og

Gnas Hotel (n = 3) mutationer findes i resektion pancreas væv af de seks IPMN tilfælde,

KRAS

og

Gnas

mutationer blev påvist i bugspyt i 66,7% (4/6) og 100% (3/3) af tilfældene hhv. Andelen af ​​tilfælde med mutationer var højere i IPMN end i PDAC; derfor, vi troede, at de påviste i bugspyt mutationer kan være alternativ måde at måle mutationer i dem fra væv i hvert fald i de tilfælde med IPMN Ifølge denne analyse. Som et resultat, vi analyserede sammenhængen mellem de kliniske variable og

Gnas

status med bugspyt i de tilfælde med IPMN.

Diskussion

I denne undersøgelse , halvleder-baserede DNA-sekventering blev udført i klinisk opnåede prøver af ren bugspyt og reseceret pancreasvæv, der fokuserer på IPMN og IPMN-associerede tumorer. Analysen af ​​bugspyt afslørede, at

Gnas

mutation var specifik for IPMN og at

Gnas

mutation blev specifikt forbundet med IPMN med MPD dilatation. Analysen af ​​de resektion væv med hensyn til

Gnas

mutationsstatus viste, at IPMN-associeret PDAC (begge PDAC samtidig med IPMN og PDAC afledt IPMN) delte lignende mutationsmønstre egenskaber og at disse egenskaber afveg fra de almindelige PDAC.

Blandt de 46 cancer-relaterede gener sekventeret i vores undersøgelse,

KRAS

Gnas

mutationer blev påvist med høj frekvens, mens andre, herunder

TP53

,

Smad4

, og

blev opdaget CDKN2A

mutationer i nogle få tilfælde som nævnt før. Da der har været flere tidligere rapporter, der har analyseret

KRAS

mutationer i PDAC eller IPMN fokuserede vi vores analyse af

Gnas

mutation. Nylige fremskridt i næste generation sekventering har afsløret detaljerede genetiske ændringer i sager med PDAC [6], [7], [9] og IPMN [12], [16]. Jones et al [7], Biankin et al [9], og Wang et al [6] gennemført hel-exome sekventering analyse af pancreas PDAC og afslørede, at

KRAS

,

TP53

,

Smad4

og

CDKN2A

var de hyppigst ændret gener, som tidligere rapporteret [8]. Af disse fire gener, mutationer for

TP53

,

Smad4

, og

CDKN2A

gener blev påvist i kun et par tilfælde med PDAC i vores undersøgelse. Selvom homozygot deletion er blevet rapporteret i

Smad4

CDKN2A

gener i tidligere undersøgelser [8], præcis identifikation af den homozygot deletion i kliniske prøver har været vanskelig på grund af DNA-kontaminering fra normale celler . Imidlertid vellykket påvisning af homozygot DNA deletion var muligt for disse gener i analysen af ​​rene pancreascancer cellelinier (data ikke vist). Fordi kun den 73

TP53

hot spot mutationer blandt mere end 1000 mutation sites anført i COSMIC database var rettet af Ion AmpliSeq Cancer Primer Pools [24], og desuden lave tumor-cellularitet prøver blev anvendt,

TP53

ændringer kan have været undervurderet i vores undersøgelse. Disse genændringer kunne have opdaget andre metoder, såsom immunhistokemi eller kopiere-nummer variation analyse. Det virkede underligt, at nogle mutationer som

ATM, BRAF, IDH1

, og

RB1 ​​

kun blev påvist i bugspyt og ikke i de resektion prøver. Eftersom alle væv anvendes til analysen var kun en del af hele tumoren, var det muligt, at bugspyt kan være mere repræsentative for mutationer fra hele tumoren i visse betingelser.

Wu et al [16 ] og Furukawa et al [12] udførte hel-exome sekventering af IPMN fra resektion væv og fandt, at

KRAS

,

Gnas

, og

RNF43

var ofte muterede gener. I denne undersøgelse,

KRAS

Gnas

mutationer blev også påvist i bugspyt og resektion væv fra sager med IPMN.

Der er rapporteret Gnas

mutationer i flere neoplasmer i det endokrine system [13], [24], nogle hypofyseadenomer [14], og i McCune-Albright syndrom [15].

Gnas

mutationer er også tidligere blevet rapporteret i IPMN [11], [12] sager, der havde pancreas cyster [10], [12], [16] med en påvisning på 41-66% fra resektion væv , pancreas cyster fluider eller sekretin-stimuleret bugspyt indsamlet fra duodenum. For nylig er det blevet rapporteret, at intraduktal papillære neoplasmer i galdegangen [25], [26], pylorus kirtel adenom i maven og duodenum [27], og lav kvalitet appendiceal mucinous neoplasmer [28] lignede IPMN histologisk og at disse neoplasmer havde en høj frekvens af

Gnas

mutationer.

Gnas

koder for α-underenheden af ​​en stimulatorisk G-protein (Gαs) og en mutation i

Gnas

forårsager konstitutiv aktivering af adenylylcyclase og en forhøjet cAMP niveau [29], [30 ]. Selv roller /funktioner

Gnas

mutationer i IPMN eller PDAC ikke er blevet belyst, kan disse mutationer være forbundet mere med tumorinitiering end med tumorudvikling fordi mutationen også er blevet observeret i lav kvalitet tumorer [ ,,,0],10], [12]. I vores undersøgelse

Gnas

mutationer blev påvist i 41,5% af det rene bugspyt og i 66,7% af de resektion vævsprøver fra tilfælde med IPMN; disse mutationsrater var næsten lig med dem i tidligere rapporter. I modsætning hertil

KRAS

mutationer er blevet rapporteret i resektion væv fra både IPMN og PDAC, med respektive afsløring sats intervaller af 48-81% [12], [16] og 78-100% [7], [ ,,,0],9], [12], hvilket indikerer, at

KRAS

mutationer kan være forbundet med begge sygdomme; imidlertid har mutationen ligget noget højere i PDAC.

KRAS

mutation afsløring satser i vores undersøgelse svarede til de undersøgelser af resektion væv i både IPMN og PDAC tilfælde.

Gnas

mutationer var forbundet med MPD dilatation i IPMN tilfælde gennem den multivariate analyse. Kanda et al rapporterede en uafhængig sammenslutning af

Gnas

mutationer med udviklingen af ​​flere cyster i tilfælde med pancreas cyster og Marco et al rapporterede, at IPMN med en tarm fænotype altid har været forbundet med

Gnas

mutationer [10], [31]. Vores data bekræftede specificitet

Gnas

mutationer til IPMN og foreslog en funktionel rolle

Gnas

mutationer i dannelsen af ​​IPMN. Især da MPD dilatation uden obstruktion i IPMN er generelt blevet anset for at være resultatet af mucus-hypersekretion,

Gnas

mutationer kan have en rolle i opregulering af mucus-hypersekretion. Faktisk er det blevet nylig rapporteret, at indførelsen af ​​

Gnas

mutation i dyrkede celler resulterer i opregulering af mucin gener, der understøtter vores hypotese [32]. En nylig undersøgelse rapporterer den høje frekvens af

Gnas

mutation, især i tarm typen IPMN der har iøjnefaldende slim produktion, støttet vores resultater samt [31]. Yderligere undersøgelser af en mulig årsagssammenhæng mellem

Gnas

mutationer og MPD dilatation er berettiget.

Lignende mutation mønstre af cancer-relaterede gener blev observeret mellem PDAC der var samtidig med IPMN og PDAC afledt fra IPMN i denne undersøgelse. I tidligere undersøgelser,

ikke er blevet opdaget Gnas

mutationer i almindeligt PDAC med få undtagelser [12], [33]. Konventionelt har disse tumorer blevet klassificeret i tre grupper: almindelig PDAC, PDAC samtidig med IPMN og PDAC afledt IPMN [4], [5]. En skematisk klassificering af PDAC hvad angår forholdet til IPMN er tilvejebragt i figur 4. I almindelig PDAC, er ingen IPMN identificeret i bugspytkirtlen (fig. 4A). PDAC afledt fra IPMN er en invasiv cancer, hvor en histologisk overgang fra IPMN til PDAC kan observeres (fig. 4C) [4]. På den anden side, PDAC samtidig med IPMN er et duktalt adenocarcinom, der anses for at være en anden sygdom enhed fra PDAC afledt af IPMN (Fig 4D.); de PDAC læsioner er adskilt og forskellig fra de samtidige IPMN læsioner i bugspytkirtlen på radiologisk billeddannelse og histologisk undersøgelse. En årlig incidens af en uafhængig PDAC udvikling af 0,8-4,1% er blevet rapporteret i tilfælde med IPMN under opfølgning [5], [34] – [36]. Selvom PDAC samtidig med IPMN kan udvikle sig uafhængigt af IPMN, dets biologiske opførsel ligner PDAC afledt IPMN fordi dens resultat er mere gunstig i forhold til resultaterne af almindelig PDAC. Selvom en anden rapport studere

Gnas

status i PDAC samtidig med IPMN viste ingen mutation i seks PDAC samtidig med IPMN tilfælde kan deres afsløring følsomhed har været lavere end forventet, fordi de kun opdaget

Gnas

mutationer i 1 af 6 IPMN sager [37]. Fra mutations mønster af

Gnas

observeret i denne undersøgelse, vi spekuleret på, at PDAC samtidig med IPMN og PDAC afledt IPMN kan dele nogle lignende molekylære mekanismer med patogenesen af ​​PDAC.

A.

KRAS

mutation blev påvist i almindelig PDAC uden IPMN. B.

KRAS

Gnas

mutationer blev fundet i IPMN. C.

KRAS

Gnas

mutationer blev påvist i PDAC stammer fra primær IPMN. D.

KRAS

Gnas

mutationer blev påvist ikke kun i IPMN men også i PDAC der udviklede adskilt fra IPMN.

Vores forskning vist, at kræft-relaterede gen profilering af halvleder-baserede sekventering er mulig ved hjælp af små kliniske prøver. På den anden side, detekteringsfølsomheden var noget lavere i vores analyse dels på grund af utilstrækkelig sekventering dybde for hvert gen for et stort antal gener målrettede i en enkelt analyse.