PLoS ONE: Kombination af sulindac og dichloracetat dræbe cancerceller via oxidative skader

Abstrakt

Sulindac er en FDA-godkendt non-steroide anti-inflammatorisk lægemiddel med dokumenteret anticancer aktiviteter. Vore nylige undersøgelser viste, at sulindac selektivt forøgede drab af cancerceller udsat for oxidationsmidler via produktion af reaktive oxygenarter (ROS) resulterer i mitokondriel dysfunktion. Denne virkning af sulindac og oxidativt stress på cancerceller kunne relateres til defekten i respiration i cancerceller, først beskrevet af Warburg 50 år siden, kendt som Warburg virkning. Vi postulerede, at sulindac kan forbedre den selektive drab af cancerceller, når det kombineres med enhver forbindelse, der ændrer mitokondriel respiration. For at teste denne hypotese har vi brugt dichloracetat (DCA), der er kendt for at skifte pyruvat-metabolisme væk fra mælkesyre dannelse til respiration. Man kunne forvente, at DCA, da det stimulerer aerob metabolisme, kunne understrege mitokondrielle respiration i cancerceller, hvilket ville resultere i forøget drab i nærvær af sulindac. I denne undersøgelse har vi vist, at kombinationen af ​​sulindac og DCA forbedrer selektivt drab af A549 og SCC25 cancerceller under de anvendte betingelser. Som forudsagt, mekanismen for drab involverer ROS produktion, mitokondriel dysfunktion, JNK signalering og død ved apoptose. Vores resultater tyder på, at sulindac-DCA Lægemiddelkombinationen kan give en effektiv kræftbehandling

Henvisning:. Ayyanathan K, Kesaraju S, Dawson-Scully K, Weissbach H (2012) Kombination af sulindac og dichloracetat dræbe cancerceller via oxidative skader. PLoS ONE 7 (7): e39949. doi: 10,1371 /journal.pone.0039949

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: August 12, 2011; Accepteret: 4 Jun 2012; Udgivet: 17 Juli 2012

Copyright: © 2012 Ayyanathan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding bistand fra National Institutes of Health til KA (tilskud 5K01CA95620) og HW (tilskud R15 CA122001), og fra staten Florida til HW (SURECAG tilskud R94007) at udføre dette arbejde er taknemmeligt anerkendt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sulindac er en FDA-godkendt non-steroidt antiinflammatorisk lægemiddel (NSAID), som også er blevet vist at have anti-cancer-aktivitet [1] – [6]. Nylige undersøgelser fra vores laboratorium har vist, at RKO, A549 og SCC25 cancercellelinier udviste følsomhed over for en kombination af sulindac og et oxidationsmiddel, såsom TBHP eller H

2O

2 [7]. Dataene viste, at sulindac effekten ikke var relateret til dets NSAID aktivitet, men at sulindac gjort kræftceller mere følsomme over for oxidativt stress resulterer i mitokondriel dysfunktion og tab af levedygtighed. I modsætning hertil normale celler ikke viser forøget drab under tilsvarende betingelser [7]. I de seneste 10 år har der været spredte rapporter om forøget cancer drab ved hjælp sulindac i kombination med en række forskellige forbindelser, herunder arsentrioxid, bortezomib, difluormethylornithin (DFMO) og suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA) [8] – [14]. Selv om disse forbindelser har forskellige steder i handling, kan en fælles mekanisme for sulindac /stof kombination forbedret drab involverer oxidative skader, som blev klart demonstreret i vores tidligere undersøgelser ved hjælp sulindac og en oxiderende agent [7], [15]. Faktisk har ROS blevet impliceret i undersøgelser under anvendelse af sulindac i kombination med arsentrioxid, bortezomib og SAHA [10], [12], [14].

Vores tidligere resultater antydede, at den forøgede drab af cancerceller ved kombinationen af ​​sulindac og et oxidationsmiddel kan skyldes en defekt i respiration i cancerceller, som først beskrevet af Warburg mere end 50 år siden [16], som bemærkede, at cancerceller favorisere glycolyse, ikke respiration, til energiudvinding, modsætning til normale celler. Nogle cancerceller opnået så meget som 50% af deres energi fra glycolyse, hvorimod glykolyse i normale celler udgør mindre end 5% af energibehovet [16]. For at opnå yderligere bevis for de mulige roller ændret respiration og ROS i drabet af kræftceller ved sulindac og oxidativ stress, vi igangsat undersøgelser med natrium dichloreddikesyre (DCA). DCA er en ideel kandidat som det er kendt for at inhibere en kinase, som nedregulerer aktiviteten af ​​pyruvatdehydrogenase, hvilket resulterer i en forskydning af pyruvat metabolisme væk fra mælkesyre dannelse, i retning respiration [17], [18]. DCA er blevet anvendt klinisk til behandling af patienter med laktisk acidose [19], og baseret på dens biokemiske egenskaber DCA er også blevet testet som et anticancermiddel. Bonnet et al. 2007 har vist, at DCA vender Warburg effekten i kræftceller ved at omdirigere kræft cellens stofskifte fra glykolysen til oxidativ fosforylering. I disse tidligere undersøgelser blev det vist, at DCA øger niveauer af ROS fra komplekse I. Denne igen udløser “remodeling” mitochondriel stofskifte (reducerer ATm, åbner mitokondriel overgang pore) i cancerceller skubbe dem mod apoptose. Endvidere har flere nylige undersøgelser bekræftet, at DCA kan forøge ROS-niveauer i cancerceller og depolarisere mitokondrier membran i lunge, endometrial, og glioblastoma-cellelinier resulterer i apoptose både

in vitro

in vivo

[18], [20] – [22]. Af interesse var den observation, at de betingelser, der anvendes DCA ikke synes at væsentlig indflydelse mitokondrie metabolisme eller levedygtighed i normale celler [18], [23].

Baseret på vores tidligere bemærkninger om kræft drab effekt af sulindac og en oxiderende agent, der påvirkede mitokondrie stofskifte [7], vi postulerede, at kombinationen af ​​sulindac og DCA synergistisk kan øge kræft drab og har vigtige terapeutisk værdi. I nærværende undersøgelse har vi undersøgt effekten af ​​at bruge sulindac i kombination med DCA om levedygtigheden af ​​A549 og SCC25 kræft cellelinjer. Vi har også studeret rolle mitokondriefunktionen og apoptose i kræft drab observeret med dette lægemiddel kombination.

Materialer og metoder

Materialer

Sulindac, N-acetylcystein og Tiron blev købt fra Sigma (St.Louis, MO). DCA natriumsalt blev opnået fra Acros Organics (Geel, Belgien). H2DCFDA og JC-1 blev erhvervet fra Molecular Probes (Eugene, OR). MTS assayreagens og Deadend Tunel Kit blev opnået fra Promega (Madison, WI). Cytosol /mitokondrier fraktionering kit og CBA077 InnoCyte ™ Flowcytometrisk cytochrom

c

Frigivelse kit var fra Calbiochem, Gibbstown, NJ. Alle celledyrkningsmedier, føtalt bovint serum og andre kosttilskud, såsom penicillin /streptomycin, glutamin, etc. blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). Salg

A549 og SCC25 cancerceller, normale lungeceller og humane epidermale keratinocytter blev behandlet med de angivne koncentrationer af DCA i nærvær eller fravær af sulindac (Sul) i 48 timer. Cellelevedygtigheden blev overvåget ved MTS-assay som nævnt i fremgangsmåderne. Cellelevedygtigheden er udtrykt som% af kontrol (celler, der ikke er behandlet med sulindac). Fejlsøjler er standard på middelværdien (SEM) udtrykt som% af middelværdien af ​​firdobbelte fra et repræsentativt eksperiment. Cell levedygtighed er illustreret for A549 cancerceller (A), SCC25 kræftceller (B), normale lungeceller (C) og normale humane epidermale keratinocytter (D). ♦, -Sul; ▪, + Sul. * P 0,05, ** p 0,005, *** p. 0,0005

Cell Culture

En ikke-småcellet carcinom cellelinje (NSCLC), A549, den normal human lunge cellelinie MRC-5, og en tunge-afledt pladecellekarcinom linje, SCC25 blev indkøbt fra ATCC (Rockville, MD) og opretholdt i F12-K-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fugtig, 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C. Normale humane epidermale keratinocytter blev opnået fra Promocell GmbH (Heidelberg, Tyskland) og holdt i den anbefalede dyrkningsmedium. Tidlig passage, blev ikke-immortaliserede normale celler anvendt til forsøgene.

A549 og SCC25 cancerceller blev behandlet med de angivne koncentrationer af DCA i nærvær eller fravær af sulindac sulfon (SulS) i 48 timer. SulS blev anvendt ved en slutkoncentration på 250 pM for A549 cancerceller og 75 uM for SCC25 cancerceller. Cellelevedygtigheden blev overvåget ved MTS assay som beskrevet i Methods. Cellelevedygtigheden er udtrykt som% af kontrol (celler, der ikke er behandlet med sulindac sulfon). Fejlsøjler er standard på middelværdien (SEM) udtrykt som% af gennemsnitsværdien af ​​triplikater fra et repræsentativt eksperiment. Cell levedygtighed er illustreret for A549 cancerceller (A) og SCC25 cancerceller (B). ♦, -SulS; ▪, + SulS. * P 0,05, ** p 0,005, *** p. 0,0005

Cell Levedygtighed Assay

A549 kræft og lunge normale celler blev udsået ved 3 × 10

3 celler per brønd mens SCC25 cancerceller og normale keratinocytter blev udpladet med 7,5 x 10

3 celler per brønd i en 96-brønds plade. Cellerne blev dyrket i 18-20 timer, mediet kasseret i aseptiske betingelser og erstattet med frisk dyrkningsmedium indeholdende de indikerede lægemiddelkombinationer. Hvor det er angivet 500 pM sulindac blev anvendt med A549 kræft og lunge normale celler og 100 uM sulindac blev anvendt med SCC25 cancer og normale keratinocytceller. Pladerne blev inkuberet i 48 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Dyrkningsmediet blev kasseret, og cellerne blev grundigt skyllet i 1 × PBS. Cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse af CellTiter 96 Aqueous One celleproliferationsassay (Promega) ifølge producentens instruktioner. Assayet udnytter en tetrazoliumforbindelse, der omdannes til en vandopløselig formazan under indvirkning af cellulære dehydrogenaser stede i metabolisk aktive celler [24]. Den formazan blev kvantificeret ved måling af absorbansen ved 490 nm under anvendelse af en kolorimetrisk mikrotiterpladelæser (SpectraMax Plus; Molecular Devices). Baggrund absorbans blev trukket fra hver prøve.

Intracellulær Måling af ROS

A549 og SCC25 cancer cellelinjer blev belagt som ovenfor. Efter 48 timers lægemiddelbehandling blev cellerne inkuberet med 50 pM af dichlorodihydrofluorescein diacetat (H

2DCFDA, Molecular Probes) i indikator medium i 30 min ved 37 ° C. Celler blev skyllet med PBS og ROS-niveauer blev visualiseret ved fluorescensmikroskopi. Billederne blev taget med Qcapture software og forarbejdet i Adobe Photoshop. Billedanalyse blev udført ved anvendelse af slidebook software. Data fra et repræsentativt forsøg blev anvendt til kvantificering af DCF-positive celler som målt ved grøn fluorescens på grund af oxideret DCF.

Top paneler (A) illustrerer resultaterne for A549 cancerceller, mens bundpanelerne ( B) afbilder resultaterne for SCC25 cancerceller. Cellerne blev behandlet med de angivne koncentrationer af lægemidler og forarbejdet til fluorescensmikroskopi som beskrevet i fremgangsmåderne. Omfanget af intracellulære ROS niveauer er illustreret som intensiteten af ​​grøn fluorescens observeret i celler behandlet med ingen medicin (sub-paneler A1 og B1), sulindac alene (sub-paneler A2 og B2), DCA alene (sub-paneler A3 og B3) og sulindac og DCA kombinationsbehandling (sub-paneler A4 og B4). Flere uafhængige felter blev photomicrographed og repræsentative felter for hver tilstand vises.

JC-1 Farvning til Monitor mitokondriemembranen Potential

mitochondriemembranpotential blev bestemt ved anvendelse af JC-1 farvestof ( Molecular Probes). A549 og SCC25 cancercellelinier blev udpladet som ovenfor. Efter 48 timers lægemiddelbehandling blev cellerne inkuberet med 5 ng /ml JC-1 farvestof i indikator medium i 30 min ved 37 ° C. Celler blev skyllet med PBS og visualiseret ved fluorescensmikroskopi. Normale mitokondrier aktivt tage op JC-1 farvestof i en potentiel afhængig måde og danner J-aggregater, hvilket giver en rød fluorescens. Forstyrrelser og efterfølgende tab af mitokondriel membranpotentialet fører til øget grøn fluorescens i cytosolen grund monomert JC-1, som bestemmes ved at følge forekomsten af ​​grøn fluorescens under anvendelse af et FITC-filter (Zeiss inverteret mikroskop-Axiovert 40 CFL). Billedoptagelse, behandling, og analyse blev udført som ovenfor. Data fra et repræsentativt forsøg blev anvendt til kvantificering af JC-1-grøn-positive celler.

Top paneler (A) illustrerer resultaterne for A549 cancerceller, mens bundpanelerne (B) afbilder resultaterne for SCC25 cancerceller. Mitokondrielle membranpotentiale tab blev påvist ved en ændring i JC-1 fordeling resulterer i en stigning i grøn fluorescens (se fremgangsmåder). De eksperimentelle betingelser for JC-1-farvning og fluorescensmikroskopi er forklaret detaljeret under Metoder og lægemidlet behandlingsregimer er afbildet nedenfor panelerne. Ubehandlede celler (sub-paneler A1 og B1), celler behandlet med sulindac (sub-paneler A2 og B2), celler behandlet med DCA (sub-paneler A3 og B3), og celler behandlet med sulindac og DCA (sub-paneler A4 og B4). Flere uafhængige felter blev photomicrographed og repræsentative felter for hver tilstand vises.

Effekt af ROS skyllevæsker på Cell levedygtighed i overværelse af Sulindac og DCA

A549 og SCC25 kræft cellelinjer blev udpladet som beskrevet ovenfor. Til at fjerne ROS, enten 2 mM N-acetylcystein (NAC) eller 2 mM Tiron (4,5-dihydroxy-1,3-benzendisulfonsyredinatriumsalt) blev tilsat sammen med sulindac og DCA i 48 timer ved 37 ° C. Cellelevedygtighed blev overvåget ved MTS assay og statistisk analyse udført som nævnt ovenfor.

TUNEL farvning til Monitor Celler undergår apoptose

TUNEL-assayet blev udført i plader med 96 brønde under anvendelse af deadend kolorimetriske tunel assaykit (Promega) ved at følge fabrikantens protokol. A549 og SCC25 cancercellelinier blev udpladet som ovenfor og behandlet i 48 timer med intet lægemiddel, sulindac, DCA, eller lægemiddelkombination. Efter lægemiddelbehandling blev cellerne fikseret med formalin og permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i PBS. Celler blev inkuberet med rekombinant terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) og biotinylerede nucleotider. Endogene peroxidaser blev blokeret med 0,3% H

2O

2 forud for inkubation med peberrodsperoxidase-streptavidin (HRP-streptavidin), som binder til de biotinylerede nukleotider inkorporeret i det nicked ender stede i celler, der undergår apoptose. HRP-streptavidin mærkede celler blev påvist ved hydrogenperoxid og diaminobenzidin (DAB). Celler, der viser mørkebrun nuklear farvning indikerer apoptose.

A549 og SCC25 cancerceller blev behandlet med de angivne koncentrationer af DCA i fravær (grå søjler) eller nærvær af sulindac (sort søjle) eller tilstedeværelse af sulindac og N-acetylcystein (skraveret søjle) i 48 timer. Cellelevedygtigheden blev overvåget ved MTS-assay som nævnt i fremgangsmåderne. Cellelevedygtigheden er udtrykt som% af kontrol (celler, der ikke er behandlet med sulindac). Fejlsøjler er standard på middelværdien (SEM) udtrykt som% af middelværdien af ​​firdobbelte fra et repræsentativt eksperiment. Inhibering af cancercellevækst forekom på en dosisafhængig måde under kombinationsbehandling af DCA og sulindac (sorte søjler) i både A549 cancer (A) og SCC25 cancerceller (B). Dette blev imidlertid forbedret drab undgås, når N-acetylcystein var til stede med stoffet kombinationsbehandlingen (stribede søjler i A og B).

Western blot analyse

Celler blev dyrket til 70 % sammenflydning, behandlet med bestemte lægemidler til de angivne varigheder, og cytosoliske fraktioner blev isoleret under anvendelse cytosolen /mitokondrier fraktionering kit (Calbiochem, Gibbstown, NJ) ved at følge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev celler høstet på forskellige tidspunkter og blev derefter centrifugeret ved 600 x g i 5 minutter ved 4 ° C. De pelleterede celler blev suspenderet i den medfølgende buffer og inkuberet i 10 minutter på is. Cellerne blev derefter homogeniseret under anvendelse af et glas douncer og homogenatet centrifugeret ved 700 x g i 10 minutter ved 4 ° C for at sedimentere kerner og celledebris. Supernatanten blev centrifugeret ved 10, 000 x g i 30 minutter ved 4 ° C for at opnå det mitokondrielle pellet, og supernatanten blev betragtet som den cytosoliske fraktion. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af en standard Bradford assay.

Tres mikrogram totalt protein blev påsat og separeret på en 4-12% NuPage Bis-Tris-geler (Invitrogen, Eugene, OR) og overført til en PVDF membran, blev probet ved de primære antistoffer. De primære antistoffer, JNK, pJNK, cytochrom

c

, og PARP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), blev anvendt ved 1:1000 fortynding. p-actin, (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, Californien), blev anvendt ved 1:4000 fortynding. Peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev anvendt og bånd blev visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens-metoden (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Top paneler (A) illustrerer resultaterne for A549 cancerceller, mens bundpanelerne (B) afbilder resultaterne for SCC25 cancerceller. Omfanget af celler, som undergår apoptose blev overvåget ved TUNEL-farvning af celler behandlet med nogen lægemidler (underfelterne A1 og B1), sulindac alene (underfelterne A2 og B2), DCA alene (underfelterne A3 og B3), og sulindac og DCA (sub-paneler A4 og B4). Cellerne blev behandlet med de angivne lægemidler som nævnt i paneler, der udsættes for TUNEL farvning, og behandles til fluorescerende mikroskopi som beskrevet i Methods. Flere uafhængige felter blev photomicrographed og repræsentative felter for hver betingelse, er vist. Brown-farvede celler er tegn på celler undergår apoptose.

Ligation-medieret PCR-DNA laddering analysen til overvågning Omfang Celler undergår apoptose

For at bekræfte omfanget af apoptose, ligation- medieret PCR nukleosomal DNA stigedannelse assay blev udført som beskrevet [25]. A549 og SCC25 cancercellelinier blev udpladet med 5 x 10

4 og 1 x 10

5 celler per brønd i 35 mm skåle. De A549 kræftceller blev behandlet i 48 timer med en) uden narkotika, b) 500 uM sulindac, c) 20 mM DCA, og d) 500 uM sulindac plus 20 mM DCA. Tilsvarende blev SCC25 cancerceller behandlet med ovennævnte fire forskellige lægemiddelkombinationer, bortset fra at sulindac og DCA blev anvendt ved 100 um og 10 mM koncentrationer hhv. Efter behandling blev totalt cellulært DNA ekstraheret, ligeret til adapteren konstrueret af 27-mer 5′-GACGTCGACGTCGTACACGTGTCGACT-3 ‘og 12-mer 5’AGTCGACACGTGTAC-3’. Efter ligering blev DNA’et opvarmet til frigivelse af 12-mer, fyldt med Taq-polymerase, underkastet semi-kvantitativ PCR, og analyseret på en 1,2% agarosegel sammen med størrelsesmarkører.

I situ

Lokalisering af cytochrom

c

af immunofluorescens

Intracellulær placering af cytochrom

c

blev overvåget ved immunofluorescens ved hjælp af CBA077 InnoCyte ™ flowcytometrisk cytochrom

c

Frigivelse Kit ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev SCC25 cellerne udpladet med 3,5 × 10

5 celler pr 35 mm glas bunden skålen og behandlet med de angivne lægemidler i 15 timer. Celler blev skyllet i 5 ml 1 x PBS og permeabiliseret på is i 10 minutter i 300 pi medfølgende buffer. Cellerne blev fikseret ved stuetemperatur i 20 minutter i 500 pi 4% paraformaldehyd. Efter vask og blokering blev cellerne inkuberet med 250 pi anti-cytochrom c-antistof (1:500 fortynding) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask blev cellerne inkuberet med 300 pi FITC-IgG (1:300 fortynding) i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev cellerne farvet med 300 pi DAPI (1 mg /ml) i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler blev visualiseret under anvendelse af et Olympus inverteret fluorescensmikroskop. Billeder blev fanget og forarbejdet som nævnt ovenfor. Adskillige områder blev analyseret og repræsentative mikrografer der viser lokalisering mønstre af cytochrom

c

under hver behandling tilstand blev opnået. Kvantitative værdier er præsenteret i teksten.

A. SCC25-celler blev behandlet i 48 timer med sulindac (100 um) og de angivne koncentrationer af DCA og hvor det er angivet 20 uM JNK-inhibitor, SP600125. ♦, Ingen narkotika; ▪, sulindac; ▴, sulindac og SP600125. Cellelevedygtigheden blev overvåget ved MTS-assay som nævnt i fremgangsmåderne. Fejlsøjler er standard på middelværdien (SEM) udtrykt som% af middelværdien af ​​firdobbelte fra et repræsentativt eksperiment. Se tekst for detaljer. Statistisk analyse mellem ♦, må ikke tilsættes og ▪, Sul; * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005. Statistisk analyse mellem ▪, Sul og ▴, sulindac og JNKI;

$ p 0,05,

$$ p 0,005,

$$$ p 0,0005. B. Repræsentative Western blots viser virkningen af ​​sulindac og DCA på niveauerne af total JNK, phopsho-p46JNK og phopsho-p54JNK. p-actin niveauer blev anvendt som en intern kontrol. Cytosoliske fraktioner fra SCC25 celler blev isoleret ved 12 timers tidspunktet og niveauerne af JNK og phospho-JNK blev bestemt ved western blotting. I SCC25 cellelinje viste total JNK to forskellige bands på 46 og 54 kDa.

Statistisk analyse og bestemmelse af Combination Indices

Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM for cellen levedygtighed assays. Til statistisk analyse blev Minitab statistisk software anvendes til at udføre t-test og værdier med p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. For at konstatere den synergistiske virkning af sulindac og DCA på A549 og SCC25 cancercellelinjer, blev en kvantitativ analyse af dosis og virkning udført for at bestemme kombinationen indeks [26]. Både sulindac og DCA blev testet alene på A549 og SCC25 celler i koncentrationer som angivet. For A549-celler, blev et forhold på 1:50 opretholdes i dets sulindac: DCA lægemiddelkombinationer i området fra 0,2 mM: 10 mM op til 1 mM: 50 mM. For SCC25 celler, blev et forhold på 1:100 opretholdes i dets sulindac: DCA lægemiddelkombinationer i området fra 0,05 mM: 5 mM op til 0,3 mm: 30 mm. Vores eksperimentelle resultater og de bestemt kombination indeksværdier indgår i teksten.

Resultater

Sulindac og DCA Årsag Forbedret Killing af A549 og SCC25 Cancer Cells, men ikke normale celler

til disse undersøgelser testede vi kombinationen af ​​sulindac og DCA på A549 og SCC25 kræftceller. Cellerne blev inkuberet med hver forbindelse alene eller i kombination i 48 timer før assay for levedygtighed (se fremgangsmåder). En sulindac dosisreaktionskurve under disse betingelser er angivet, at A549 og SCC25 cancerceller kan tåle en maksimal koncentration på 500 uM og 100 uM af sulindac henholdsvis uden at udvise nogen signifikant drab (data ikke vist), og disse koncentrationer blev anvendt i alle undersøgelser. DCA, når det tilsættes, blev anvendt ved koncentrationer fra 0-40 mM, som angivet. Vi brugte disse koncentrationer baseret på tidligere rapporter, der er angivet, at mM over 5 er forpligtet til at forårsage mitokondrielle dysfunktioner i

in vitro

eksperimenter [27]. Som vist i figur 1A, DCA alene (ingen sulindac) er noget toksisk for A549 cancerceller, især over koncentrationer på 20 mM, men i nærvær af sulindac der er forbedret drab af disse celler ved DCA koncentrationer over 5 mM. I tilfælde af SCC25 cancerceller vist tab af cellelevedygtighed med DCA alene blev set selv ved DCA koncentrationer under 10 mM (figur 1B). Men i nærværelse af sulindac der var igen en markant stigning i celledød, der klart var tydelig mellem DCA koncentrationer på 2-10 mM. Tidligere viste vi, at kombinationen af ​​sulindac og et oxidationsmiddel var selektiv for cancerceller og ikke øge drab af normale celler [7]. Sulindac og DCA heller ikke øge drab af normale lunge- og hudceller under de anvendte forsøgsbetingelser, som vist i figurerne 1C og D. Det skal bemærkes, at MRC-5 (lunge normal) celler er særligt følsomme over for DCA, som tidligere rapporteret [28], af årsager, der ikke er kendt.

for at kontrollere, at der var en synergistisk effekt, når kombinationen lægemidlet blev anvendt, vi bestemt kombinationen indeks ved at udføre en kvantitativ analyse af dosis og virkning [ ,,,0],26] på to forskellige cancer cellelinjer (figur S1). Kombinationsemballagerne indeks var 0,84 for A549 og 0,73 for de SCC25 cancerceller hhv. En værdi mindre end 1,00 angiver en synergistisk kræft dræbende effekt (Figur S2).

Den Sulindac Effect er ikke på grund af sin NSAID Aktivitet

I tidligere undersøgelser ved hjælp af sulindac og et oxidationsmiddel det blev vist at den forstærkede og selektivt drab af cancerceller ved sulindac og et oxidationsmiddel ikke var relateret til den kendte NSAID evne sulindac. For at bestemme rollen af ​​COX-inhibering en sulindac metabolit, sulindac sulfon, kan anvendes, da det ikke inhiberer COX 1 eller 2 [7], [29]. Som vist i figur 2, under anvendelse af både A549 (A) og SCC25 (B) cancerceller, kombinationen af ​​sulindac sulfon og DCA udviste en lignende dræbende virkning som set ovenfor med sulindac. Disse resultater indikerer, at sulindac forbedret kræft dræbende virkning i nærvær af DCA ikke er relateret til den kendte anti-inflammatorisk aktivitet.

Kombinationen af ​​sulindac og DCA Generate ROS

Den synergistiske virkning på levedygtighed observeret med sulindac og dichloracetat med både A549 og SCC25 cancerceller er slående lighed med tidligere undersøgelser ved hjælp af en kombination af sulindac og TBHP [7]. For at bestemme om ROS produktion var involveret i det selektive drab observeret i de nuværende undersøgelser, produktion af ROS, ved hjælp af indikatoren farvestof H

2DCFDA (se Metoder), blev bestemt i de kræftceller udsættes for sulindac og DCA. Resultaterne er opsummeret i figur 3. Figur 3A viser resultaterne med A549 cancerceller. Det er tydeligt ud fra resultaterne vist i figur 3A, at ubehandlede A549 cancerceller (panel A1), eller celler behandlet med sulindac alene (panel A2), eller DCA alene (panel A3), viser kun få positivt farvede celler. Men når cellerne blev eksponeret for både sulindac og DCA (panel A4), en stor stigning i positivt farvede celler for ROS (grøn fluorescens) ses, viser, at tilstedeværelsen af ​​både sulindac og DCA resultater i dannelsen af ​​signifikante niveauer af ROS. Som vist i figur 3B lignende resultater ses med SCC25 cancerceller. Sulindac eller DCA alene resulterer i en lille stigning i ROS producerende celler (panel B2 og B3), men en stor stigning i ROS produktionen igen observeret, når begge lægemidler tilsættes (panel B4). Kvantificering ved hjælp SCC25 celler viser, at antallet af DCF-positive celler (se fremgangsmåder) er 9-10 × mere, når cellerne behandles med sulindac og DCA sammenlignet med hver af lægemidlerne alene (se figur S3A). Det fremgår af disse resultater og tidligere undersøgelser, at ROS-produktion kan være et fælles træk i den forstærkede drab af cancerceller når sulindac anvendes i kombination med forbindelser, som påvirker mitokondrisk funktion.

Sulindac i kombination med DCA resulterer i et Tab af mitokondrie Membrane Potential

Hvis ROS produktion er involveret i sulindac /DCA forøget, dræbe effekt man ville forvente, at produktionen af ​​ROS ved kombinationen lægemiddel vil påvirke mitokondriefunktionen. For at bestemme dette blev mitochondriemembranpotential målt under anvendelse JC-1-farvning som beskrevet i Methods. Et tab af membranpotentiale er angivet med en stigning i grøn fluorescens som beskrevet i Methods. Et typisk resultat er opsummeret i figur 4. Både A549 og SCC25 cancerceller blev udsat for sulindac og DCA enten alene eller i kombination i 48 timer og farvet med JC-1, for at overvåge mitochondriemembranpotential. Figur 4A viser resultaterne med A549 cancercellelinie. I mangel af ethvert lægemiddel, mitokondrierne synes intakte og opretholder deres membranpotentialet som angivet ved lille grønne fluorescens (panel A1). I nærvær af sulindac alene (panel A2) eller DCA alene (panel A3) er der en lille stigning i grøn fluorescens, hvilket indikerer et vist tab af mitochondriemembranpotential. Men når både sulindac og DCA er til stede er der en slående tab af mitochondriemembranpotential som vist ved en stor stigning i grøn fluorescens (panel A4). Vi observerede det samme mønster, når flere uafhængige felter blev analyseret ved fluorescensmikroskopi. Figur 4B viser lignende resultater med de SCC25 cancerceller. Igen et betydeligt tab af mitochondriemembranpotential blev kun set når cellerne blev eksponeret for både sulindac og DCA (panel B4). Kvantificering af effekten er vist i fig S3B. Det kan ses, at den procent af JC1-grønne positiver celler når lægemidlet kombinationen blev anvendt, er 3-4 ×, der ses med enten stof alene.

ROS er involveret i aflivning af kræftceller ved en kombination af sulindac og DCA

for at give mere direkte bevis for, at ROS produceres er involveret i forbedrede drab af kræftceller ved sulindac og DCA, har vi brugt to kendte ROS skraldemanden, N-acetylcystein (NAC) og Tiron ( se metoder). Resultaterne ved hjælp NAC er vist i figur 5. Figur 5, panel A, viser, at ved både 20 og 30 mM DCA, den forøgede drab af A549 cancerceller observeres i nærvær af sulindac, er i vidt omfang forhindres, hvis NAC (2 mM) er stede under 48 timers inkubationer. Meget lignende resultater ses med SCC25 cancerceller som vist i figur 5, blev panel B. Sammenlignelige resultater blev opnået, når Tiron blev anvendt i stedet for NAC (fig S4).

Sulindac og DCA Drab på cancerceller Omfatter apoptotisk død

resultaterne ovenfor (figur 3, 4, 5) viser, at den forbedrede aflivningen af ​​kræft cellelinjer indebærer mitokondriel dysfunktion, der tyder på, at den observerede celledød via apoptose. Tidligere undersøgelser har vist, at sulindac og dets derivater er proapoptotiske lægemidler [5], [6]. Der er også rapporter om, at DCA kan forårsage celledød ved apoptose [20], [23]. For at bestemme om drab af cancerceller ved kombinationen af ​​disse to lægemidler, medieret af ROS, involverer apoptotisk død udførte vi TUNEL-farvning til måling apoptose (se fremgangsmåder). Flere replikater blev testet for sulindac og DCA alene eller i kombination, for Tunel farvende eksperimenter. Et typisk resultat er vist i figur 6, hvor de øverste paneler (figur 6A, paneler A1-A4) repræsenterer resultaterne med A549 cancerceller og bundpanelerne (figur 6B, paneler B1-B4) afbilder resultaterne med SCC25 kræft