PLoS ONE: Somatostatin Derivative (smsDX) Mål Cellular Metabolisme i Prostata Cancer celler efter androgen deprivationsbehandling

Abstrakt

Kræft cellens stofskifte reagerer på androgen deprivation terapi (ADT) kan være involveret i udviklingen og progressionen af ​​prostatakræft, og det ultimative svigt af androgen-deprivation terapi. For at undersøge metabolisme regulering virkninger på androgen-uafhængig vækst af prostatacancer, en etableret LNCaP-s celle model, der ligner den kliniske scenario kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), blev anvendt i denne aktuelle undersøgelse. Denne cellelinje blev dyrket fra androgensensitive LNCaP parentale celler, i en androgen-reducerede betingelser, der ligner klinisk androgen deprivation terapi. For at vurdere virkningerne af smsDX på invasiv af prostata kræftceller vi brugte sårheling assay og Matrigel ™ invasion assay. Vi evaluerede differentielt udtrykt proteiner af den parentale LNCaP-celler og LNCaP-s celler efter ADT ved hjælp af todimensional gelelektroforese (2-DE) efterfulgt af MALDI-TOF massespektrometrianalyse. Den overdækkede område i såret, og antallet af celler invaderer gennem en Matrigel kammer var signifikant mindre for celler behandlet med smsDX end de var til kontrolceller behandlet med bærer. 56 proteiner blev fundet differentielt udtrykt i LNCaP-s celler sammenlignet med LNCaP-celler, de fleste af dem var nedreguleret efter ADT behandling. 104 proteiner af LNCaP-celler og 86 i LNCaP-s celler, separat blev fundet, differentielt udtrykt efter behandling med smsDX, når vi undersøgt disse protein funktioner i webstedet UniProtKB /Swiss-Prot, overraskende, de fleste af proteinerne viste sig at være involveret i den cellulære metabolisme og mitokondriefunktion regulering. LNCaP-s som potentielle metastatisk androgen-uafhængige kræftceller, kunne dens stofskifte og mitokondrie funktioner ændres ved en ny somatostatin derivat smsDX, de smsDX regulatoriske virkninger på stofskiftet i LNCaP-s levere mere terapeutisk oplysninger med behandling af CRPC.

Henvisning: Yan L, Xing Z, Guo Z, Fang Z, Jiao W, Guo X, et al. (2013) Somatostatin Derivative (smsDX) Mål Cellular Metabolisme i Prostata Cancer celler efter androgen deprivationsbehandling. PLoS ONE 8 (2): e55790. doi: 10,1371 /journal.pone.0055790

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: 12. september 2012; Accepteret: December 31, 2012; Publiceret: 7 Feb 2013

Copyright: © 2013 Yan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Grant Sponsor : The National Natural Science Foundation of China (nr 81.172.435) og Shandong Natural Science Foundation (nr ZR2010HM026). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige malignitet hos mænd, og den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA og Europa hanner [1]. Tumoren progression til CRPC fase er en kompleks proces, der kan involverer både klonselektion og adaptive mekanismer i heterogene tumorer sammensat af celler, der reagerer forskelligt på androgen deprivation terapi (ADT). Men de mekanismer, hvormed tumorer erhverver androgen uafhængighed fortsat uklare og skal løses, før der kan udvikles effektive behandlingsstrategier.

ADT er almindeligt anvendt i behandlingen af ​​fremskreden prostatacancer. Men androgen deprivation terapi er ikke helbredende [2], så den letale CRPC er uundgåelig. Tegn på vaskulær degeneration, hypoxi, og metabolisk stress i prostata tumorvæv forværres efter kirurgisk eller medicinsk kastration [3]. Efter en kort remission periode, de fleste af prostatacancer bliver androgen-uafhængige. CRPC celler efter ADT kan overleve den lave ilt og næringsstoffer miljø og komme med en anden fænotype. Androgen deprivation vides at inducere neuroendokrine (NE) differentiation i LNCaP-celler, og involverer i overgangen til androgenuafhængighed [4], [5]. NE tumorer har vist sig at overudtrykke somatostatin receptorer (SSTRs) [6]. Den SSTR1-5 udtryk kunne reguleres af somatostatin og dens afledte smsDX mulig via reguleringen af ​​mitokondrierne af LNCaP der i sidste ende kunne udløse mitokondrie-medieret apoptose [7]. Somatostatinanaloger binder til SSTRs og menes at have dobbelt antitumoraktivitet, både direkte (antiproliferativ) og indirekte (hæmning af forskellige peptidhormoner udskilles af tumorcellerne) [8], [9]. Somatostatinanalog, er lanreotid blevet påvist at have betydelig antineoplastisk virkning i forskellige tumorer, herunder CRPC [10]. Men reguleringen af ​​somatostatin analog på prostatakræft cellulære stofskifte er ikke klart behandlet.

Vi hævder, at hæmning af androgen receptor (AR) udtryk er i sig selv tilstrækkelig til at fremkalde celledød i AR-positive celler. Men når disse AR-positive celler gradvist mistet AR udtryk eller i en lavere AR udtryk i prostata kræftceller, kunne disse CRPC celler får energiforsyningen via mitokondrie aktiviteter. Ifølge resultaterne af Sotgia F-gruppen [11], kunne epitelial kræftceller tage op energirige metabolitter fra nabolandet stromale fibroblaster, som giver den nødvendige energi-rige mikromiljø for at lette tumorvækst og angiogenese. Disse udsultede celler frataget androgen kunne bruge disse metabolitter i mitokondrie tricarboxylsyrecyklen (TCA), hvilket resulterer i en højere proliferativ kapacitet. For CRPC celler nye efter ADT, opregulere enzymer, der omdanner adrenale androgener til testosteron og DHT (især AKR1C3) yderligere at fremme deres intratumoral androgen syntese og reaktiverende AR transkriptionelle aktivitet [12], er AR reaktivering øget intratumoral syntese af testosteron og DHT fra svage androgener produceret af eventuelt

de novo

fra kolesterol i host stroma og ekstracellulære metabolitter.

det største problem som følge af prostatakræft er dens tilbøjelighed til at metastaserer. Lokal invasion er en af ​​de grundlæggende tidlige trin i metastase, som uden den tumorspredning ikke kan forekomme. Flertrinsprocessen for invasion og metastase er skematiseret som en sekvens af diskrete trin, ofte betegnet invasionen-metastase kaskade [13], [14]. Under denne kaskade den metaboliske omprogrammering for at støtte syntese af nye proteiner, lipider og nukleinsyrer er kritisk for cellevækst og deling [15]. Vi spekulere, at de cellulære metaboliske ændringer ville ledsage fremskridt prostatakræft til dødelig CRPC status. Vores undersøgelse vil fokusere på smsDX hæmmende på invasiv af prostatakræft og regulering af forbindelse cellemetabolisme efter hæmning af AR aktivitet medieret af androgen udtynding. Brug LNCaP og LNCaP-s celler til at undersøge de proteiner, der involverer i stofskiftet celle og energi funktioner i prostatakræft og at bestemme de regulatoriske virkninger forårsaget af somatostatin derivat smsDX, demonstrerede vi ADT nedregulerer de fleste af mitokondrielle proteiner, eventuelt resulterer i aktivering mitochondriel-medierede apoptotiske vej. De smsDX virkninger på ER fører til overekspression af GRP78 sammen med to andre ER proteiner PDIA1 og PDIA3. smsDX udøver sine virkninger ved dysregulating af metaboliske enzymer på flere niveauer, som involverer i færd med CRPC celle invasionsevne og overlevelse. Afslutningsvis disse resultater tyder på, at ADT regulerer mitokondrie-medieret og ER stress signalering i LNCaP celler og fører til omprogrammering af metabolisme i CRPC celler, smsDX regulatoriske virkninger på CRPC celler indeholder nyttige oplysninger til behandling af CRPC.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og reagenser

LNCaP human prostatacancer-cellelinie (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) blev rutinemæssigt opretholdt i den regulære medium (phenolrødt-positive RPMI 1640-medium suppleret med 5% FBS, 1% glutamin og 0,5% gentamicin) som tidligere beskrevet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Mediet blev skiftet to gange efter uge, og cellerne blev trypsiniseret og subdyrket en gang om ugen. Til forsøg, blev anvendt androgen følsomme LNCaP-celler med passagetal 28-33. At etablere en androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinie, dyrkede vi en LNCaP-s-cellelinie fra en parental prostatacancer LNCaP i en androgen-berøvelse tilstand. Efter 8-12 passager, blev LNCaP-s celler behandlet med smsDX. Somatostatin var fra Ferring, Kiel, Tyskland. Cellekulturen blev behandlet med smsDX (fra professor Sten Nilsson Lab) eller med somatostatin i tre dage, 1 nM per dag, som beskrevet af Liu Z [7]. Anti-humant AR, CgA og NSE, anti-TOM40 antistof (sc11414), β-actin (kanin-anti-actin-antistof R-22) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotecnology. TCTP (# 5128), STMN1 (# 3352) og VDAC2 (# 9412) antistoffer blev indkøbt fra cellesignalering kommercielt. CBX3 (HPA004902) og GRP78 (G9043) antistoffer blev indkøbt fra Sigma kommercielt.

Sårheling assay

Celler blev dyrket til konfluens på 6-brønds vævskulturplader og et sår blev fremstillet ved at skrabe i midten af ​​cellemonolaget med en P200 pipette tip. Efter flydende celler blev fjernet ved omfattende vask med iskold phosphatbufret saltvand frisk komplet medium indeholdende 10 nM smsDX eller den tilsvarende mængde af PBS blev tilsat. Migration og celle bevægelighed i hele sårområdet blev undersøgt efter 24 timer.

Matrigel Invasion Assay

Invasion assay blev udført ved hjælp af Matrigel coatede Transwell indstik (BD ™) med 8 um porer i 24 brønde plader, ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev en suspension af 1 × 10

6 celler i 100 pi serumfrit medium blev tilsat til indsatsen og 500 pi RPMI 1640 medium indeholdende 20% FBS suppleret med 1-10 nM smsDX eller den tilsvarende mængde saltvand var tilsat til bunden af ​​brønden. Efter pladerne blev inkuberet i 48 timer ved 37 ° C inserterne blev fikseret i methanol, blev filtrene farvet med 0,1% krystalviolet, og antallet af celler, der invaderede gennem Matrigel coatede Transwell inserter blev talt ved 40 x forstørrelse. Antallet af celler blev talt i uafhængige tredobbeltforsøg i mindst 10 felter per brønd. Analyserne blev gentaget 3 gange.

Western blot-analyse

androgenafhængige LNCaP-celler efter ADT behandling, dyrkede vi en stabil LNCaP-s cellelinie. De androgenuafhængige prostatacancer celle biomarkører og proteiner ramt af smsDX blev testet. Western blotting blev udført for at validere flere udvalgte differentielt udtrykte proteiner identificeret ved 2-DE baserede MS. Primære antistoffer blev anvendt ved følgende fortyndinger: gede-anti-humant AR, CgA og NSE, 1:1000; p-actin, 1:1500; anti-TOM40 antistof, 1:800. TCTP, 1:1000; STMN1, 1:1000; VDAC2, 1:1000; CBX3, 1:1000; GRP78, 1:1000. Western blots blev udført som beskrevet [16]. Kort sagt blev celler lyseret med puffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 250 mM NaCl, 0,1% NP-40 og 5 mM EGTA, 50 mM natrium-influenza-oride, 60 mM β-glycerol-phosphat, 0,5 mM natrium-vanadat, 0,1 mM PMSF, 10 ug /ml aprotinin og 10 ug /ml leupeptin. Proteinprøver (35 ug) blev underkastet en 10% SDS-PAGE og overført elektroforetisk til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranerne blev først inkuberet med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (TBS). Efter vask tre gange i 0,1% Tween 20-TBS (TBST) blev membranerne inkuberet med forskellige primære antistoffer særskilt ved 4 ° C natten over, efterfulgt med den tilsvarende sekundære antistoffer separat (1:2000) i 1 time ved stuetemperatur, og antistof-bundne proteiner blev opdaget af ECL-systemet (Amersham Biosciences, Little Chalfont Buckinghamshire, UK).

prøveforberedelse og protein udvinding og koncentration

den cellulære ekstraktion fra LNCaP- og LNCaP-s celler og forberedelsen af ​​den samlede cellelysat blev udført som tidligere beskrevet af [17]. Proteinbestemmelse blev foretaget under anvendelse Pierce BCA protein assayreagens (Rockford, IL, USA).

IEF og SDS-PAGE

Prøverne blev fortyndet til et totalvolumen på 250 pi, 0,2% Pharmalyte , 8 M urinstof, 0,3% DTT, 2 M CHAPS og et spor af bromphenolblåt (Sigma). En mængde på 100 ug protein blev sat på hver strimmel via rehydrering ved non-lineær pH ​​3-10 Ready Strip IPG, strimler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Fokusering blev udført i alt 45.500 Vh i en PROTEAN IEF celle (Bio-Rad). Færdigstøbte geler (12,5% homogen Tris-HCL Criterion) SDS-PAGE (Bio-Rad) blev kørt under anvendelse af en Kriterium dodeca celle gel apparat (Bio-Rad). I alt 4 geler blev kørt per prøve gruppe. Elektroden løbebuffer var 25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% vægt /vol SDS. Geler blev kørt ved 250 V i ca. 1 time, indtil bromphenolblåt markør havde nået bunden af ​​gelen ved en temperatur på ca. 15 ° C. Proteiner blev visualiseret ved sølvfarvning som beskrevet af [18].

Gel scanning og billedanalyse

2-DE-geler blev scannet ved 100 um opløsning (12-bits /pixel) med en GS -710 laserdensitometer (Bio-Rad). Dataene blev analyseret ved anvendelse PDQuest ™ -software Version 7 (Bio-Rad). Efter automatisk registrering af alle protein spots blev gel-billeder omhyggeligt redigeret. De individuelle proteiner mængder blev udtrykt som ppm af den samlede integrerede OD. Alle 2-DE-kort blev matchet og vurderes for sig. Den metodiske reproducerbarhed af 2-DE-analyse blev bestemt ved anvendelse gruppe korrelationsanalyse. Kort beskrevet er den totale optiske densitet direkte korreleret til den samlede koncentration protein. Mindre forskelle i gel loading, driftsforhold, og sølvfarvning kan påvirke samplesammenligninger og påvirker 2-D gel reproducerbarhed. Fire geler blev kørt fra hver behandlingsgruppe og sammenligninger af intensiteten af ​​matchede pletter mellem 2-DE-geler blev udført under anvendelse korrelationskoefficienten analyse. En korrelationskoefficient blev målt mellem to geler baseret på optiske tætheder af samme pletter i de to geler der sammenlignes. En korrelationskoefficient på 1 vil indebære, at de to prøver der sammenlignes, er identiske. I en gruppe bestående af 4 prøver, højst seks parvise sammenligninger er mulige. Den gennemsnitlige korrelationskoefficient blandt smsDX prøverne var 0,85 (n = 6 gel par, range 0,80-0,92).

massespektrometrianalyse

Proteiner blev identificeret med en vMALDI-LTQ instrument (Thermo Electron , San José, CA, USA). Stedet plukning, affarvning, fordøjelse, udvinding, prøveforberedelse og spotting på MALDI target plader blev udført ved hjælp af en spothandling arbejdsstation (Ettan Spothandling arbejdsstation, GE Healthcare) og en standard-protokol leveres af GE Healthcare. Pladen indeholdende de kombinerede ekstrakter blev inddampet til tørhed. Hver prøve blev fremstillet ved at udgøre de tørrede peptider i 2,5 pi matrixopløsning (2,5 mg /ml α-cyano-4-hydroxy-kanelsyre (Sigma) i 50% acetonitril indeholdende 0,05% TFA). 2.0 pi prøve blev spottet på en ren MALDI target glideflade og fik lov at tørre. Prøverne blev analyseret med en vMALDI-LTQ (Thermo Electron, San José, CA, USA). Analysen blev udført ved hjælp Xcalibur 1.4 software i data afhængig tilstand. En undersøgelse scanning (MS) blev efterfulgt af MS /MS scanninger på de 5 mest udbredte ioner. Denne streng af 6 Scan begivenheder blev gentaget seks gange for hver prøve plet. Dynamisk Udelukkelse ™ sikret, at i alt 30 forskellige peptider blev selekteret og fragmenteret for hver prøve. MS-spektre blev opsamlet i 900-2000 Da masseinterval mens massen område for MS /MS-spektre automatisk blev udvalgt af system baseret på en Q-værdi på 0,25. Standarden kollisionsenergi på 38 fastsattes til alle analysen. En frist på 5 minutter /prøve blev valgt, uanset om 30 MS /MS spektre kunne erhverves. Database søgninger blev udført ved hjælp af både MASCOT og SEQUEST søgealgoritme mod den menneskelige møde i IPI protein database (version 2.38). De to søgninger blev sammenlignet i den i hus udviklet software Promiscuous MS /MS. Et minimum af to peptider og en maskot score på 45 var nødvendige for et protein, der skal accepteres som identificeret.

Resultater

Etablering af androgen-uafhængig cellelinie, LNCaP-s og detektion af AR , CgA og NSE udtryk i LNCaP-s celler

for at løse den naturlige udvikling af prostatakræft fra androgen følsomme over for androgen uafhængig stat, en prostatakræft celle model er meget vigtigt for

in vitro

undersøgelse . Så vi dyrket en LNCaP-s-cellelinie fra en parental prostatacancer LNCaP i en androgen-berøvelse tilstand. NE-celler er karakteriseret ved en neuronal-lignende fænotype som producerer og udskiller en række neuropeptider, der er involveret i tumor proliferation, transformation og metastase [19]. De morfologiske karakteristika viste en neuronal morfologi med kompakt afrundede celle organer, der har forlænget og fine forgrenede processer. Således androgen-sensitive LNCaP-celler erhvervet en NE-lignende fænotype (figur 1) LNCaP-s i en androgen-reducerende betingelse. NE-lignende celler, blev karakteristika evalueres ved at teste markører for NED, Chromogranin A (CgA) og neuron-specifik enolase (NSE). Efter dyrkning i androgen-reducerede betingelser, viste LNCaP-celler et reduceret ekspressionsniveau af AR, et forøget NSE ekspressionsniveau, men CgA uden signifikant ekspression. Figur 1 viste forskellige udtryk for AR, CgA og NSE i LNCaP-s celler.

Forældrekontrol LNCaP celler har en epitheial morfologi og LNCaP-s celler viste en neuronal morfologi. AR, CGA og NSE udtryk i LNCaP og LNCaP-s celler undersøgt ved RT-PCR og Western Blotting.

smsDX hæmmede invasiv af prostata kræftceller

Det er velkendt, at somatostatin og dets analoge virkninger på proliferationen af ​​prostatacancerceller [20]. Men somatostatin virkninger på invasiv var ikke blevet undersøgt. For at vurdere virkningerne af smsDX om invasivitet af prostatacancerceller vi bruges sårheling assay og Matrigel ™ invasion assay Den overdækkede område i såret, og antallet af celler invaderer gennem en Matrigel kammer var signifikant mindre for celler behandlet med smsDX, end de var for kontrolceller behandlet med vehikel i LNCaP og LNCaP-s celler (figur 2 og 3). Inhiberingen af ​​smsDX viser en dosisafhængig måde med celletallet invaderende evne i både LNCaP og LNCaP-s celler. Disse resultater antyder, smsDX reducerede invasivitet af prostatacancerceller.

Repræsentative mikrofotografier demonstrerer sårlukning i LNCaP-celler (A) og LNCaP-s celler (B). Monolag af LNCaP /LNCaP-s celler blev afbrudt med steril pipette spids for at skabe uniformand behandlet med PBS eller 1-10 nM smsDX i 24 timer.

Matrigel invasion data, når LNCaP /LNCaP-s celler i øvre brønd blev inkuberet i serumfrit medium og nedre brønd blev fyldt med serum-frit medium og 1-10 nM smsDX eller PBS. Efter 24 timer blev antallet af celler, invaderede gennem Matrigel tælles i mindst 10 felter per brønd. Repræsentative fotografier afslører LNCaP (A) og LNCaP-s (B) celler, der invaderede gennem Matrigel. Nedsat fra × 100.

2D gelelektroforese analyse

Figur 4 viser repræsentative 2D-geler af kontrol og smsDX prøver i LNCaP og LNCaP-s celler. Tre gentagelser blev kørt for hver gruppe, kontrol og smsDX. De smsDX virkninger på LNCaP og LNCaP-s celler blev sammenlignet separat med kontrolgruppen ved anvendelse af en Mann-Whitney-test.

Whole-cellelysat blev underkastet 2-DE under anvendelse af IPG strips pH 3-10 i den første og 12,5% SDS polyacrylamidgel i den anden dimension. A, Forældrekontrol LNCaP celler, B, afledte LNCaP-s celler. C, LNCaP + smsDX, D, LNCaP-s + smsDX.

Proteiner differentielt udtrykte mellem LNCaP og LNCaP-s celler

I alt 222 pladser blev identificeret med succes ved hjælp 2DE- baserede MS. I den første analyse blev smsDX-behandlede LNCaP-celler sammenlignet med LNCaP kontrolgruppen ved anvendelse af en Mann-Whitney-test. 56-proteiner fandtes at være differentielt udtrykt i LNCaP og LNCaP-s (tabel S1). I den anden analyse, 104 og 86 proteiner, særskilt, blev fundet differentielt udtrykt i LNCaP-celler og LNCaP-s celler efter smsDX behandling (tabel S2A og tabel S2B). Udtrykket af specifikke isoformer af metaboliske enzymer er blevet vist at være afgørende for tilpasning af tumorceller til ændringer i næringsstof tilgængelighed, især for glycolytiske enzymer [21]. Så isoformer af proteiner blev også anført i denne tabel. Det samme protein blev undertiden findes i flere afsluttende pletter på 2DE geler, er det muligt på grund af posttranslationel modifikation af protein efter stress.

seksoghalvtreds proteiner blev fundet ned-udtrykt (mere end 1,2 gange ændring) i LNCaP-s celler sammenlignet med de parentale LNCaP celler, som er anført i tabel S1.

Proteiner både i LNCaP og LNCaP-s celler ramt af smsDX inkubation med en fold ændring ≥1.2 optaget i tabel S2A og bord S2B .

Sorterede funktioner af proteiner i effekten af ​​smsDX på prostatakræft (LNCaP-s) celler efter ADT behandling

de forskellige funktioner af proteiner med tiltrædelse kode refererer til hjemmesiden, http: //www.uniprot.org/uniprot/. De identificerede proteiner blev kategoriseret på grundlag af deres kendte biokemiske funktioner, herunder metabolisme, signalering transduktion, opretholdelse af cellestruktur, transkriptionel regulering og cellecyklusregulering. De fleste af androgen deprivation stressede proteiner blev nedreguleret efter ADT behandling. Når vi undersøgt disse protein funktioner i hjemmesiden UniProtKB /Swiss-Prot, overraskende, de fleste af de ramt af ADT terapi proteiner blev fundet at være involveret i cellen stofskifte og mitokondriefunktionen regulering. Baseret på de formodede funktioner i Kegg pathway database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), tabel S3 (A, B, C) blev afledt fra tabel S2A og tabel S2B at fremhæve lighederne /forskelle i virkningen af ​​smsDX mellem LNCaP og LNCaP-s cellelinier. Tabel S3A opført fyrre-otte almindelige proteiner mellem LNCaP og LNCaP-s celler efter udsættelse for smsDX. Tabel S3B, S3C listet de forskelligt berørte proteiner i LNCaP og LNCaP-s celler, hver for sig.

Androgen afsavn kan påvirke mitokondrie proteinekspression, f.eks HSPD1, ETFA, GLUD1, PMPCB og et al. Disse proteiner blev fundet tilhører mitokondrielle proteiner involverer i glucosemetabolisme, produktion af reaktive oxygenarter (ROS) og iboende mitokondrie-medieret apoptotiske funktion. Proteinerne med vigtige roller i celle metaboliske proces, herunder energi (APRT, ATP5B, CKB, Tubb), lipid (ACAT2, ACADM, PRDX6), glucose (ENO1, TPI1) og aminosyre og protein biosyntese (PHGDH, EIF5A, EIF1AY) fandtes nedreguleret i LNCaP-s celler. Nogle metaboliske enzymer involveret i TCA blev også identificeret. ADT behandling fører til et fald i protein ekspressionen af ​​adskillige ER chaperoner, herunder GRP78, ERP29, PDIA1 og PDIA3 protein.

Validering af proteiner ramt af smsDX og ADT behandling i prostata cancer celler med vestlige Blotting

proteiner i LNCaP-s celler, der involverer forskellige signalveje blev identificeret i denne aktuelle undersøgelse, kunne disse proteiner reguleres af smsDX ved forskellige forandringer fold som anført i tabel S2. Validering af proteiner ramt af smsDX og ADT behandling i prostatacancerceller blev udført ved Western Blotting. Adskillige mitokondrielle proteiner, ER proteiner og proteiner involverer metabolisme blev udvalgt til påvisning til validering med immunblotting. Figur 5 viser, at TCTP, STMN1, og CXB3 i LNCaP-celler efter ADT blev nedreguleret og TOM40, GRP78 og VDAC2 som involverer i mitokondrielle aktivitet i LNCaP-s celler blev opreguleret af, når de behandles med smsDX.

A, Lavere udtryk for protein TCTP, STMN1 og CXB3 i LNCaP celler efter ADT i LNCaP-s celler. B, Ned regulerede udtryk for TOM40, GRP78 og VDAC2 i LNCaP celler ved androgen-berøvelse, op regulerede udtryk i LNCaP-s celler ved smsDX behandling.

Metaboliske veje reguleret af somatostatin-derivat (smsDX) i prostatacancerceller

Baseret på Kegg vej database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), præsenterede vi et diagram over metaboliske veje reguleret af smsDX i prostatacancer fra androgen afhængig til CRPC status (figur 6). Enzymerne i cirkel blev identificeret ved 2-DE MS i denne aktuelle undersøgelse.

Enzymer og metabolitter, som er en del af glycosis, fede acide syntese og TCA cyklus vises. G6PD, glucose-6-phosphat 1-dehydrogenase. ENO1, Alpha enolase. PPP, pentosephosphatvejen. ACAT2, acetyl-CoA acetyltransferase. ACAMD, acyl-CoA dehydrogenase. IDH2, isocitratdehydrogenase [NADP]. MDHM, Malate dehydrogenase. GLUD1, Glutamat dehydrogenase1. α-KG, α-ketoglutarat. Denne forenklede diagram er baseret på det Kegg vej database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html). Enzymerne i cirkel blev identificeret ved 2-DE MS i denne aktuelle undersøgelse.

Diskussion

Androgen spiller en væsentlig rolle i prostata kræft vækst, så androgen deprivation og blokaden af ​​AR signalering akse er i øjeblikket den vigtigste behandling for prostatakræft og dens progression. Det er veldokumenteret, at den kliniske androgen-deprivation terapi er forbundet med øget NE differentiering i prostata carcinomer, og er involveret i overgangen til androgen uafhængighed [22], NE celler er karakteriseret ved en neuronal-lignende fænotype: de er ikke-proliferative og udtrykke neuronale-lignende proteiner, såsom NSE og CGA. Androgen afsavn kan påvirke serum CGA niveauer til forskelligt omfang i prostatakræft [23]. Overekspressionen af ​​NSE i LNCaP-s i vores undersøgelse blev fundet i progressionen af ​​NED fra androgenafhængige LNCaP-celler. I denne aktuelle undersøgelse, efter at op til 10 passager af LNCaP celler i en reduceret androgen tilstand blev NE-lignende karakteristika LNCaP-s identificeret ved en neuronal morfologi og ændrede udtryk for AR og NSE.

Effekterne af somatostatin hæmning på levedygtighed kræftcellen og spredning er blevet godt undersøgt, men vores viden, havde dens virkninger på invasiv ikke undersøgt. Brug sårheling og Matrigel invasion assay observerede vi, at smsDX hæmmede invasiv både LNCaP og LNCaP-s celler. Selv om de nøjagtige mekanismer i smsDX induceret undertrykkelse af invasiv øjeblikket ikke klart, kan det være på grund af reaktioner på beskadigede mitokondrie funktioner. I vores tidligere undersøgelser [7], [24], smsDX reguleret mitokondrielle og beslægtede proteiner både androgen-afhængige og uafhængige prostatacancerceller, så kræft-associerede ændringer i stofskiftet er muligvis ansvarlige for celleproliferation og overlevelse signaler i tilbagevendende prostatacancer og CRPC.

for at bestemme de stofskifte regulering virkninger af smsDX på progression af prostatakræft fra androgen-afhængige til androgen uafhængig status, vi udførte todimensional gelelektroforese (2-dE) efterfulgt af MALDI-TOF massespektrometriske analyse. Efter sammenligning af proteinekspression i LNCaP-s og dets parentale LNCaP-celler, blev fundet seksoghalvtreds proteiner, som skal udtrykkes differentielt op til 1,2 gange ændring som vist i tabel S1. Disse proteiner blev sorteret i henhold til deres forskellige funktioner i cellemetabolisme, herunder sukker, energi, lipid og aminosyre-proces. Resultaterne antyder, at androgen-regulerede metabolisk ændring er de vigtigste forskelle i udviklingen af ​​prostatakræft fra androgen-følsomme over for androgen-resistente status. De tilsvarende og forskellige virkninger forårsaget af smsDX blev fundet mellem LNCaP og LNCaP-s celler. Den stress forårsaget af androgen deprivation og smsDX til prostatakræft celle miljø kunne muligvis forårsaget mitokondriefunktionen skader og aktivere AMPK vej i prostata kræftceller. Mitokondrielle processer spiller en vigtig rolle i tumor initiering og progression. Øget metabolisk aktivitet er kendetegnende for prolifererende cancerceller [25]. Så undertrykke cancercellen metaboliske aktivitet tilvejebringer en alternativ strategi for CRPC fase. ADT for prostatakræft forårsagede unormal mikromiljø tilstand fremkalde reaktioner fra tumorcelle påvirke den metaboliske aktivitet. Disse tilpasninger optimerer tumor cellens stofskifte til at få energi og næringsstoffer fra tumor mikromiljø. Adskillige rapporter har vist, at androgen biosyntese og Ar signalering i prostatacancerceller er intimt påvirket af lipogenese [26] – [28]. Så målrette de mulige underliggende molekylære mekanismer forbinder metabolisme vil kunne lette videreudvikling af lovende terapeutiske tilgange til CRPC status.

Baseret på de data, vi indsamlede her, fandt vi smsDX PI3K /AKT /mTORC1 vej og TCA cyklus via op og ned regulering forskellige metaboliske proteiner anført i tbale S2A og tabel S2B. I prostatacancer AKT aktiveres via PI3K pathway, der har vist sig som en kritisk vej for celleoverlevelse. Fjernelse androgen støtte fra LNCaP celler udløser en række begivenheder, herunder cellecyklusstop og øget PI3K /Akt aktivitet, der kulminerede i den endelige overtagelse af den androgen- uafhængige fænotype [29]. PI3K /Akt fører til forbedret glucoseoptagelse og glycolyse [30] .Dette pathway fremmer også glucose carbon flux i biosyntetiske veje, der er baseret på funktionel mitochondrial metabolisme, herunder fedtsyre, cholesterol og isopronoid syntese kræver alle acetyl-CoA. AKT aktiverer også ATP-citratelyase (ACL) fremme omdannelsen af ​​mitokondrie-afledt citrat til acetyl-CoA for lipid syntese. mTORC1 er en velkarakteriseret cellevækst regulator virker som neden for PI3K /AKT, har mange effekter slyngede med mitokondrie stofskifte. mTORC1 er bedst kendt for at øge proteinsyntesen [25]. Alpha enolase (ENO1), også kendt som pyruvatdehydrogenase-phosphatase, er kritisk for cellulær energimetabolisme [31]. ENO1, som et centralt glykolytisk enzym, spiller en afgørende rolle i anaerob glykolyse. I denne aktuelle undersøgelse, kunne ENO1 være op reguleret af smsDX, som viste, at smsDX har en regulerende effekt på glykolyse i prostata kræftceller.

TCA cyklus er en central vej i metabolismen af ​​sukker, lipider og amino syre, TCA cyklus metablites resultere i nedsat cellulær differentiering.