PLoS ONE: NFκB1 og NFκBIA Polymorphisms Er forbundet med øget risiko for sporadisk kolorektal cancer i en sydlig kinesisk Befolkning

Abstrakt

Baggrund

Nuclear KB (NFKB) spiller en central rolle i reguleringen af ​​apoptose. Funktionen af ​​NFKB inhiberes ved binding til NFKB-inhibitoren (IKB), og forstyrrelse af balancen mellem NFKB og IKB er relateret til udviklingen af ​​mange sygdomme, herunder tumorer. Derfor vi hypotese, at den

NFκB1 (-94del /insATTG)

NFκBIA Hotel (2758 A G). Polymorfier blev associeret med kolorektal cancer (CRC) modtagelighed

Metoder

i et hospital-baseret case-kontrol undersøgelse af 1001 CRC patienter og 1005 cancer-fri kontrol frekvens matches af alder og køn, vi genotype polymorfier ved hjælp af polymerasekædereaktion-restriktion polymorfisme (PCR-RFLP) metode og udførte luciferaseassays og Western blotting analyse for at identificere, om genetiske varianter i

NFκBIA

ændre sine gen udtryk og funktioner og dermed kræftrisiko.

Resultater

Vi fandt, at både

NFκB1-94 ins /delATTG

NFκBIA 2758 A G

polymorfier blev korreleret med CRC risiko (OR = 1,47; 95% CI = 1,14-1,86, og OR = 1,38; 95% CI = 1,14-1,66, henholdsvis). Endvidere, når evalueret disse to polymorfier sammen, de kombinerede genotyper med 2 variant (risiko) alleler (

2758GG

og

-94ins /ins + del /ins

) var forbundet med en øget risiko for CRC (OR = 1,71; 95% CI = 1,23-2,38) i forhold til 0-variant, og den betydelige trend for 2 variant (risiko) alleler var mere udtalt blandt undergrupper af alderen 60 år, kvinder, aldrig drinkers, aldrig rygere, personer med en normal BMI, og dem med en familie historie af kræft (

P

trend

0,01). Desuden viste luciferaseassays at G-allelen i 3’UTR faldt betydeligt

NFκBIA

mRNA stabilitet og

A

allel regulering af

miRNA449a in vitro

at NFκBIA protein udtryk niveauer af

AA + AG

variant luftfartsselskaber var signifikant højere i peritumorale væv end dem i

2758GG

genotype.

Konklusion

NFκB1

NFκBIA

polymorfier synes fællesskab bidrage til risikoen for CRC. Disse to varianter kan være en genetisk modifier for CRC modtagelighed i denne sydlige kinesiske befolkning

Henvisning:. Song S, Chen D, Lu J, Liao J, Luo Y, Yang Z, et al. (2011)

NFκB1

NFκBIA

Polymorfier Er forbundet med øget risiko for sporadisk kolorektal cancer i en sydlige kinesiske befolkning. PLoS ONE 6 (6): e21726. doi: 10,1371 /journal.pone.0021726

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: 23. marts 2011; Accepteret: 6 Juni 2011; Udgivet: 30 Jun 2011

Copyright: © 2011 Song et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Scientific Foundation of China tilskud [81072042 til Lei Wang, 81072366 til Jiachun Lu og 81001108 til Yisheng Wei], Guangdong Provincial videnskabelige Research Grants [8151008901000059, 10251008901000008 til Lei Wang], den Gongdong provinsen regeringen, Education Department af kinesiske regering, Videnskab og Teknologi Institut for kinesiske regering [00590101220610034 til Jianping Wang], og forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina [200805580074 til Jianping Wang] og Yat-Sen Innovative talenter Dyrkning Program for Excellent Tutors [88000 -3126201 til Dianke Chen og Lei Wang] og støttet af grundforskning Midler til de centrale universiteter. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform hos mænd og den anden mest almindelige kræftform hos kvinder rundt om i verden, og det skønnes, at der var ca. 1,2 mio nydiagnosticerede CRC tilfælde og 608,700 dødsfald i 2008 [1]. Optegnelser fra den kommunale død register over byen Guangzhou, Guangdong, Kina, indikerer, at CRC er den femte mest almindelige kræftform. Dødeligheden blev dramatisk forøget fra 4,33 /10

5 personer i 1970’erne til 12,13 /10

5 personer i 2000 er [2]. Størstedelen af ​​CRC tilfælde (ca. 80%) er sporadisk [3], men en arvelig disposition er til stede i 20-35% af patienterne, hvilket antyder, at både genetiske og miljømæssige faktorer bidrager til CRC udvikling [4]. Alkohol drikke og tobak bruge [5], [6], kosten og livsstilsfaktorer [7], og inflammatorisk tarmsygdom, såsom colitis ulcerosa [8], [9] har vist sig at være forbundet med CRC risiko. Selv om mange mennesker er udsat for disse risikofaktorer, kun nogle af de udsatte individer udvikle CRC, hvilket indikerer, at den genetiske variation dels afgør individuel modtagelighed for kolorektal tumorigenese.

Apoptose, et stærkt reguleret cellulær proces, deltager i udvikling, væv homøostase vedligeholdelse og eliminering af uønskede celler [10]. Dysregulering i denne proces vil kunne bidrage til tumorigenese [11]. De biokemiske veje af apoptose er komplicerede og afhænger ikke kun cellerne, men også inducere af apoptose. Betydelige beviser tyder på, at forekomsten og udviklingen af ​​kræft er forbundet med både forlænget celleoverlevelse og suspenderet apoptose i præcancerøse læsioner og følgelig kan afvigende apoptose tillade ukontrolleret cellevækst [12].

Nuclear faktor kappa B ( NFKB) er en større transkription regulator af immunresponset, celleadhæsion, differentiering, proliferation og apoptose [13]. Fem medlemmer (p50 /p105, p65 /RelA, c-Rel, RelB, og P52 /P100) i NFKB familien er blevet identificeret, og den dimere form af NFκB1 p50 /RelA er den største form [14]. I den hvilende celle er NFKB inaktiveres i cytoplasmaet gennem association med en sekvestrerende inhiberende protein, kBa, β eller γ, og de mest almindelige protein af denne familie er NFKB-inhibitoren α (NFκBIA) [15]. I den klassiske aktiveringsvej, phosphorylering og nedbrydning af de inhiberende proteiner fører til NFKB dissociation fra NFKB kompleks og translokation til kernen, hvor den kan aktivere transkriptionen af ​​et stort antal gener [16]. Som en vigtig transkriptionsfaktor, NFKB medierer overlevelsesrespons ved at inhibere p53-afhængig apoptose og opregulering anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien og caspaseinhibitorer [17], [18]. I modsætning hertil er NFKB også aktiveres af både ydre og indre apoptotiske stimuli og medierer opregulering af pro-apoptotiske gener, såsom

TRAIL R2 /DR5

,

Fas

, og

Fas

ligand [19], [20]. En uhensigtsmæssig aktivering af NFKB kunne forstyrre vævshomeostase og føre til dysreguleret apoptose. Desuden aktivitet af NFKB er blevet observeret i flere typer af kræft, herunder CRC [21], [22], hvilket indikerer det kan spille en vigtig rolle i tumorigenese [23], [24].

NFκB1 Hotel (kodning for NFKB) kort til kromosom 4q23-q24 og består af 24 exons [25], [26], og dens hæmmende gen

NFκBIA

(kodning for IKB) er 3,5 kb lang, med seks exons, og er beliggende på kromosom 14q13 [27], [28]. Genetiske undersøgelser har identificeret enkelt nukleotid polymorfier (SNP) i

NFκB1

NFκBIA

[29], [30]. For nylig, en fælles indsættelse /sletning (-94 indsættelse /deletionATTG rs28362491) polymorfi i

NFκB1

promotor-regionen og en 3 ‘-untranslated region (3’UTR) polymorfi 2758A G (rs696) i

NFκBIA

blev observeret at være signifikant korreleret med inflammatorisk tarmsygdom [31], [32] og kræft [33], [34], [35]. Epidemiologiske undersøgelser har også undersøgt sammenhængen mellem

NFκB1

polymorfier og risikoen for CRC i tyskerne og

NFκBIA

polymorfi og risiko for CRC i den svenske med modstridende resultater [36], [37].

Der er ikke tidligere rapport om sammenhængen mellem

NFκB1

NFκBIA

polymorfier og CRC risiko. Som NFicB /IKB-systemet spiller en vigtig regulerende rolle i apoptosecyklus og dysreguleret udtryk for

NFκB1

NFκBIA

er blevet observeret i CRC, vi hypotese, at kombineret

NFκB1

og

NFκBIA

polymorfier kan være forbundet med øget risiko for CRC. For at teste denne hypotese, vi genotypebestemmes

NFκB1-94 indsættelse /deletionATTG

NFκBIA 2758A G

polymorfier i vores igangværende sygehus-baserede case-kontrol undersøgelse af CRC i en sydlig kinesisk befolkning, og yderligere udføres luciferaseassays og Western blotting analyse for at identificere, om genetiske varianter i

NFκBIA

ændre sine gen udtryk og funktioner og dermed kræftrisiko.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen protokol Den blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelserne for Sun Yat-Sen University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager efter en fuldstændig redegørelse for undersøgelsen.

Undersøgelse fag og prøvetagning

Fra juli 2002 til april 2010 i alt 1001 patienter med histopatologisk-bekræftet og ubehandlet sporadisk CRC blev prospektivt rekrutteret fra første og sjette Affiliated Hospital (Mave Anal Hospital) og Cancer center for Sun Yat-Sen University, Guangzhou, Kina, Tilknyttet Tumor Hospital i Guangzhou Medical College, Guangzhou, Kina, Guangdong Provincial Folkeparti Hospital, Guangzhou, Kina, og Panyu Folkets Hospital, Guangzhou, Kina. Alle disse emner var genetisk relateret etniske han-kinesere og var fra byen Guangzhou og de omkringliggende områder i det sydlige Kina. Af de 1001 sager, der indgår i denne undersøgelse, var der 169 (16,9%) tilfælde af højre tyktarmskræft, 309 (30,9%) tilfælde af venstre tyktarmskræft og 523 (52,2%) endetarmskræft. Ifølge amerikanske fælles udvalg om kræft iscenesættelse Manual, der var 171 (17,1%) tilfælde af fase I, 320 (31,9%) fase II, 345 (34,5%) fase III, og 165 (16,5%) trin IV. I mellemtiden blev der i alt 1005 kræft-fri kontrol tilfældigt udvalgt fra et emne pulje på mere end 10.000 personer, der deltog i helbredsundersøgelser-programmer på community sundhed stationer i Guangzhou, Kina.

Undersøgelsen deltagerne blev interviewet og blev opnået data om rygning status, brug af alkohol og andre faktorer, herunder familiens historie af kræft ved hjælp af en struktureret spørgeskema. Rygning status, brug af alkohol og familie historie af kræft blev defineret som tidligere [38] beskrevet. Emner, hvis body mass index (BMI) var 18,5 kg /m

2 blev kategoriseret som værende undervægtige, fag, hvis BMI var fra 18,5 til 24,0 kg /m

2 var normale kropsvægt, dem, der har et BMI 24,0 kg /m

2 var overvægtige [39]. Sager, der tilhører familiær adenomatøs polypose og de tilfælde, der opfyldte kriterierne i Amsterdam for arvelige nonpolyposis CRC blev udelukket.

Genotypning

Fem ml blod blev opsamlet fra hver deltager og genomisk DNA blev ekstraheret ved hjælp af DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Genotypebestemmelse blev udført ved polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (PCR-RFLP) -metoden. Til bestemmelse af

NFκB1

promotoren (rs28362491) polymorfi blev SNP-holdige fragment amplificeret under anvendelse af følgende primere: 5′-TGGGCACAAGTCGTTTATGA-3 ‘(fremadrettet) og 5′-CTGGAGCCGGTAGGGAAG-3’ (revers) . PCR blev kørt ved 94 ° C i 3 minutter efterfulgt af 30 cyklusser af 94 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s og 72 ° C i 60 s med en endelig ekstension ved 72 ° C i 10 min. PCR produkter (281/285 bp i størrelse) blev fordøjet med

PFI

MI (Fermentas, Vilnius, Litauen) ved 37 ° C natten over efterfulgt af 2% agarose gelelektroforese. Til bestemmelse af

NFκBIA

(rs696) polymorfi blev SNP-holdige fragment amplificeret under anvendelse af følgende primere: 5′-GGCTGAAAGAACATGGACTTG-3 ‘(fremad) og 5′-GTACACCATTTACAGGAGGG 3’ (revers). PCR blev kørt ved 94 ° C i 5 minutter efterfulgt af 32 cyklusser af 94 ° C i 30 s, 54,3 ° C i 45 s og 72 ° C i 60 s med en endelig ekstension ved 72 ° C i 10 min. De amplificerede fragmenter blev spaltet med

Hae

III (Fermentas, Vilnius) natten over ved 37 ° C efterfulgt af 2% agarosegelelektroforese.

Genotype analyse blev udført af to eksperimentatorer uafhængigt som var blindet til status for de emner som patient eller kontrol. For yderligere at validere genotypebestemmelse resultater, valgte vi tilfældigt 10% prøver for hver af de 2 SNPs at udføre gentagne assays, og resultaterne var 100% overensstemmende. Derudover blev 5% af PCR produkter til hvert mål genotype renset og bekræftet ved direkte sekventering (Figur S1 og Figur S2).

Bioinformatik analyse

For at undersøge om genetiske varianter af

NFκBIA

kunne binde til microRNA (miRNA), søgte vi efter mål microRNA af genetiske varianter af

NFκBIA

hjælp algoritmen programmer (https://www.targetscan.org og http: //microrna.sanger .ac.uk /cgi-bin /mål /v5 /search.pl).

Cell kultur

Tre humane kolorektale adenocarcinom cellelinjer, HCT116, HT29 og SW480 blev købt fra Culture Collection of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og rutinemæssigt dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium eller RPMI 1640-medium suppleret med 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS). Cellerne blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO2 i en fugtig inkubator.

RNA-interferens, forbigående transfektioner og luciferaseassays

MIR-449a

efterligner målretning

NFκBIA

, 5′-UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU-3 ‘(sense) og 5′-CAGCUAACAAUACACUGCCAUU-3’ (anti-sense),

mIR-449a

inhibitor, 5′-ACCAGCUAACAAUACACUGCCA-3 ‘, miR -34b efterligner målretning

NFκBIA

, 5′-CAAUCACUAACUCCACUGCCAU-3 ‘(sense) og 5′-GGCAGUGGAGUUAGUGAUUGUU-3’ (anti-sense), og

mIR-34b

inhibitor, 5 ‘ -AUGGCAGUGGAGUUAGUGAUUG-3 ‘blev syntetiseret ved GenePharma Co. (Shanghai, Kina). Hertil kommer, at 3’UTR af

NFκBIA 2758A

allel (2575-2955 bp i forhold til oversættelsen startstedet), der indeholder

miR-449a

miR-34b

bindingssted blev amplificeret ved anvendelse af følgende to primere, 5′-CCGCTCGAGCAAAGGGGCTGAAAGAA-3 ‘(sense) og 5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAATGTGGTCCTTCCATGA-3’ (anti-sense). De forstærkede fragmenter blev begrænset med

Xho

I og

Ikke

I (New England BioLabs, Ipswich, MA) og derefter ligeret ind i

Xho

I og

Ikke

i restriktionssite af dual-luciferase plasmid, psiCHECK ™ -2 (Promega, Madison, WI). Derudover 3′-UTR af det

NFκBIA 2758G

allel, som indeholdt et muteret mRNA-bindingssted, blev amplificeret under anvendelse af PCR site-directed mutagenese og klonet ind psiCHECK ™ -2. Til transfektion blev celler podet på plader med 24 brønde ved 1 x 10

5 celler /brønd, og efter inkubering natten over blev cellerne co-transficeret med reporter plasmidet (2758G eller 2758A allel) og MIR efterligner eller inhibitorer under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved at følge fabrikantens protokol. Cellerne blev lyseret 48 timer efter transfektion, og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af en dobbelt-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Hvert forsøg blev udført tre gange og mindst tre gange uafhængigt

Western blotting analyse

For at analysere sammenhængen mellem

NFκBIA

polymorfier i sin 3’UTR (2758A . G ) og NFκBIA protein udtryk niveauer i væv, 32 parrede tumor og peritumorale væv blev opnået fra sporadiske CRC patienter resektion på sjette Tilknyttede Hospital i Sun Yat-Sen University og arkiveret i tumoren bank. Alle væv prøver blev histologisk bekræftet. Immunoblotting assays blev udført som tidligere beskrevet [38] og antistoffer mod NFκBIA og β-actin (Precision Task Group, Chicago, USA) blev anvendt under proceduren. Protein densitometri blev udført ved hjælp af Gel-Pro Analyzer 4.0 software (Media Kybernetik, Inc., Silver Spring, MD) og NFκBIA udtryk blev normaliseret mod β-actin.

Statistisk analyse

To-sidet chi-square tests blev anvendt til at vurdere forskelle i fordelingerne af alder, køn, rygning status, brug af alkohol, BMI, menstruation historie, og familie historie af kræft mellem cases og kontroller. Den Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) er blevet underkastet en goodness-of-fit chi-square test for at sammenligne de forventede genotypefrekvenser med observerede genotypefrekvenser (P2 + 2PQ + Q2 = 1) i kræft-fri kontrol. Sammenhængen mellem case-kontrol status og hver SNP, målt ved odds ratio (OR) og dens tilsvarende 95% konfidensinterval (CI), blev estimeret ved hjælp af en ubetinget logistisk regressionsmodel, med og uden justering for alder, køn, rygning status , alkoholindtagelse status, BMI, tumor site, og arvelig kræft. Nylige undersøgelser tyder på, at en analyse af de kombinerede genotyper kan være mere videnskabeligt signifikant end en analyse af en enkelt polymorfi i forudsige sygdom foreninger. Derfor de kombinerede genotypedata blev yderligere stratificeret efter alder, køn og rygning status, alkoholindtagelse status, BMI, tumor site, og arvelig kræft. Logistisk regression modellering blev også brugt til tendensen test. Students t-test blev udført for at undersøge forskellen i luciferase reportergenekspression mellem forskellige konstruktioner. Kruskal-Wallis envejs ANOVA tests blev anvendt til analyse NFκBIA proteinekspression i peritumorale væv fra forskellige genotyper. Alle tests var to-sidet ved hjælp af SAS-software (version 9.1, SAS Institute, Cary, NC).

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Karakteristik af undersøgelsespopulationen

Fordelingen af ​​demografiske karakteristika for de 1001 sporadiske CRC sager og 1005 kræft-fri kontrol er vist i tabel 1. Samlet set ingen statistisk signifikant forskel blev observeret i alder, køn og rygning status mellem de tilfælde og kontroller (

P

0,05 i alt). Sammenlignet med kontroller, var der flere nogensinde drinkers (sager vs. kontrol, 45,5% vs. 23,6%) (

P

0,01) i den kohorte, CRC tilfælde. Desuden sammenlignet med kontroller, CRC tilfælde var mere tilbøjelige til at have en familie historie af kræft eller en højere BMI (

P

0,05 i begge). Som følge heraf blev disse variable yderligere justeret for i multivariat logistisk regressionsmodel for at undgå mulig confounding om de vigtigste virkninger af SNP’er under studiet. De blev også brugt i den efterfølgende lagdeling og gen-miljø interaktion analyse.

PCR-RFLP undersøgelse af

NFκB1

promoter regionen og

NFκBIA

3 ‘ UTR omegn

Vi udførte analyse af

NFκB1

promoter region ved PCR-RFLP-metoden. To ATTG gentagelser er til stede på

NFκB1

promoter region, og en allel, der har en ATTG indsættelse (ins) blev spaltet i en 45-bp og en 240-bp fragment efter fordøjelse med

PFI

MI mens den anden deletion allel (del), som kun har én ATTG på dets promotor ikke blev spaltet (fig 1.a). Desuden efter fordøjelse med

Hae

, III,

2758GG

genotype produceret en 316-bp og en 108-bp band hvorimod 2758AA genotypen produceret en enkelt 424-bp band, og heterozygote vises alle 3 bånd (figur 1.b).

(a)

PFI

MI fordøjelse band profil af

NFκB1

gen på 2% agarosegel. Bane 1 Gene Ruler 100 bp Low Range Ladder, Lanes 2 og 7 del /ins heterozygot genotype, Lanes 4 og 6

ins /ins

genotype, Lanes3, 5

del /del

genotype. (B)

Hae

III fordøjelse band profil

NFκBIA

på 2% agarosegel. Bane 1 Gene Ruler 100 bp Low Range Ladder, Bane 3, 5 homozygot G /G genotype, Bane 2 og 6 homozygot A /A genotype, Lanes 4, 7 heterozygote A /G-genotypen.

Den

NFκB1-94ins /delATTG

(rs28362491) og

NFκBIA 2758A G Hotel (rs696) polymorfier er forbundet med risiko for sporadisk CRC

genotype og allel fordelinger af

NFκB1-94ins /delATTG

(rs28362491) og

NFκBIA 2758A G Hotel (rs696) polymorfier blandt cases og kontroller er sammenfattet i tabel 2. Den observerede genotypefrekvenser af disse to polymorfier var alle efter aftale med Hardy-Weinberg ligevægt i kontrolpersoner (

P

0,05). Som vist i tabel 2, for rs28362491, fordelingen af ​​co-dominant genetisk model (del /del vs. ins /ins vs. del /ins), og den dominerende model (ins /ins + del /ins vs. del /del) afveg betydeligt mellem CRC sager og kontroller (ins /ins: OR = 1,70; 95% CI = 1,29-2,25;

P

0,01; del /ins: OR = 1,33; 95% CI = 1,03 -1,74;

P

0,01; ins /ins + del /ins: ELLER = 1,47; 95% CI = 1,14-1,86;

P

0,01, henholdsvis). For rs696, var der en signifikant forskel i fordelingen af ​​rs696 genotyper mellem CRC cases og kontroller (

P

0,01). Signifikante forskelle blev også noteret i fordelingen af ​​den recessive model af rs696 (GG versus AA + AG) mellem CRC sager og kontroller (OR = 1,38; 95% CI = 1,14-1,66;

P

0,05) . Konsekvent, blev signifikant sammenhæng fundet mellem de to SNPs og risikoen for sporadisk CRC.

Stratificering analyse af foreningen af ​​kombinerede

NFκB1

og

NFκBIA

polymorfier med risiko for CRC

Vi analyserede yderligere de kombinerede genotyper af

NFκB1

NFκBIA

polymorfier ved at undersøge alder, køn, rygning, alkohol, BMI, tumor site, og familie historie af kræft ved logistisk regression. Vi kombinerede den

NFκB1

NFκBIA

polymorfier baseret på antallet af variant (risiko) alleler (dvs.

2758GG

-94ins /ins + del /ins

). Som vist i tabel 3, sammenlignet med den

NFκB1-94 del /del

NFκB1IA 2758AA + AG

genotype, én variant kombineret genotype luftfartsselskaber, der var 60 år havde en højere risiko for CRC (OR = 1,57; 95% CI = 1,04-2,38) (

P

0,05). Yderligere lagdeling analyse viste, at personer med to varianter havde en signifikant højere risiko for CRC blandt undergrupper af patienter i alderen 60 år (OR = 2,18; 95% CI = 1,37-3,44) (

P

0,01) , kvinder (OR = 2,36; 95% CI = 1,35-4,10) (

P

0,01), aldrig rygere (OR = 2,05; 95% CI = 1,30-3,22) (

P

0,01), aldrig drikker (OR = 1,87; 95% CI = 1,23-2,84) (

P

0,01), personer med en normal BMI (OR = 1,80; 95% CI = 1.21- 2,69) (

P

0,01) og dem med en familie historie af kræft (OR = 4,57; 95% CI = 1,34 til 15,6,

P

. 0,05)

MIR-449a

efterligner undertrykt aktiviteterne i

NFκBIA

2758 A G polymorfi

Vi yderligere analyseret 3’UTR af

NFκBIA

2758 a G polymorfi hjælp af en computer algoritme og fandt, at polymorfi kan påvirke miRNA binding.

MIR-449a

miR-34b

, som er involveret i en lang række biologiske funktioner, viste sig at have et bindingssted i 3′-UTR af

NFκBIA

2758 A G polymorfi (figur 2a). Til bestemmelse af allel-specifik virkning af

NFκBIA

2758 A G variant på aktiviteten af ​​3’UTR og om denne polymorfi påvirket miRNA binding, transficerede vi CRC cellelinier SW480, HT29, og HCT116 med reporter plasmider, der bærer den

2758G

eller

2758A

allel og MIR efterligner eller inhibitorer (figur 2a). Vi fandt, at i mangel af MIR efterligner eller inhibitorer, sammenlignet med den

2758A

allel,

2758G

allel udstillet nedsat luciferaseaktiviteter (

P

0,05) (figur 2b).

MIR-449a

efterligner kunne reducere de relative luciferase aktiviteter

2758A

allel mens

miR-449a

hæmmere markant opregulere de relative luciferase aktiviteter

2758A

allel i alle tre cellelinjer (

P

0,01 for HT29

P

0,05 for SW480 og HCT116) (figur 2b). På den anden side,

MIR-34b Salg efterligner ikke udøve nogen mærkbare virkninger på de relative luciferaseaktiviteter i

2758G

allel i disse cellelinier (data ikke vist). Tilsammen viste disse resultater, at

2758G

allel i 3’UTR af

NFκBIA

reducerede normaliseret luciferaseaktivitet sammenlignet med

2758A

allel, sandsynligvis svarende til reduceret mRNA stabilitet eller translationel effekt og at

miR-449a

har evnen til at binde og delvist undertrykke luciferase udtryk via

NFκBIA

3’UTR-segment, når du bærer

2758A

allel af

NFκBIA

2758 a . G polymorfi

(a) en formodet målsted af

miR-449a og miR-34b

højt konserveret i

NFκBIA

mRNA 3’UTR. (B) psiCHECK-2 Dual Luciferase Assay i tre cellelinier: SW480, HT29 og HCT116. Celler blev transficeret med reporter plasmider alene eller cotransficeret med microRNA. Luciferaseekspression blev målt 48 timer efter transfektion. Luciferaseaktiviteten af ​​hver konstruktion blev normaliseret mod den interne kontrol af Renilla luciferase. Kolonner, betyder fra tre uafhængige forsøg; barer, SD. *,

P

. 0,05 for alle sammenligninger af hver cellelinje mellem aktiviteterne i de reporter genkonstruktioner

Sammenslutningen af ​​

NFκBIA3’UTR

polymorfier med NFκBIA proteinekspression

Vi var også interesseret i at undersøge, om den

NFκBIA3’UTR

polymorfier (

2758A G

) var associeret med forøget eller reduceret ekspression af NFκBIA protein . Vi indsamlede 32 parrede tumor og peritumorale væv fra de ubehandlede CRC patienter af forskellige genotyper. Immunblotting analyse viste, at niveauerne af NFκBIA (NFκBIA /β-actin protein-forhold) i peritumorale væv af 12 tilfælde af

2758AA

genotype var 0,80 ± 0,09 og de af 8 tilfælde af

2758AG

genotype var 0,63 ± 0,11, som begge var betydeligt højere end de øvrige 12 tilfælde af

2758GG

genotype (0,47 ± 0,06) (variansanalyse test,

P

G

. De NFκBIA proteinekspressionsniveauer blev normaliseret til den for β-actin ved at beregne de relative ekspressionsniveauer. Individuel genotype betegnelse: For 2758A G, bane 1-3, 9-11, 17-20, 25-26, AA-genotypen (n = 12); bane 4-6,12-14, 21-24, 27-28, GG genotype (n = 12); banerne 7-8, 15-16, 29-32, AG-genotypen (n = 8).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi sammenslutningerne af

NFκB1-94del /insATTG

NFκB1IA 2758A G

polymorfier med risiko for CRC i en sydlig Han kinesiske befolkning. Vi fandt, at både den

NFkB1-94del /ins ATTG

NFkBIA 2758A G

polymorfier var forbundet med øget risiko for CRC. For

NFkB1

–

94del /insATTG

polymorfi, med

-94del /del

som reference, vi fandt, at

-94 (ins /ins + del /ins)

genotype var forbundet med en statistisk signifikant øget risiko for CRC. For

NFKBIA 2758A G

polymorfi, med

2758 (AA + GA)

som reference, vi fandt også, at

2758GG

genotype blev forbundet med en statistisk signifikant øget risiko for CRC. Endvidere, når vi evalueret

NFkB1

NFKBIA

polymorfier i kombination, fandt vi, at den kombinerede

2758GG

-94ins /ins + del /ins

genotype var forbundet med en signifikant øget risiko for CRC sammenlignet med dem uden at

2758GG

-94ins /ins + del /ins

genotype, og denne øgede risiko var mere udtalt blandt yngre end 60 år, kvinder, aldrig drinkers, aldrig rygere, personer med en normal BMI og de med arvelig kræft. I de in vitro-analyser, vi fandt også, at sammenlignet med

2758A

allel,

2758G

variant allel viste signifikant nedsat mRNA stabilitet og /eller translationel effektivitet. Desuden fandt vi, at NFkBIA niveauer signifikant højere i peritumorale væv fra patienter i de

2758AA + AG

genotyper end de

2758GG

genotyper, hvilket tyder på, at

2758A G

polymorfi er potentielt funktionelle og polymorfi

2758A G dele på 3’UTR af

NFkBIA

kan påvirke genekspression. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at undersøge, om

NFkB1

NFkBIA

polymorfi, og deres samlede polymorfi var forbundet med risiko for CRC.

Der er flere linjer af beviser til støtte for vores resultater.

NFKB

1 veje synes at spille en kritisk rolle i flere humane patologier ved at regulere transkriptionen af ​​gener involveret i immunresponset, celleproliferation og apoptose [13]. Det er blevet vist, at ændringer af

NFKB

1 ekspression spiller en vigtig rolle i beskyttelsen af ​​celler fra apoptose [40].

NFicB

en aktivitet er blevet observeret i forskellige typer af kræft [41], herunder brystkræft [42] og CRC [21], for at bidrage til tumor angiogenese og progression [43]. Der er også mange eksperimentelle data antyder, at NFκB1 /IKB-vejen kan deltage i tumorcelleinvasion såvel [44]. Derfor er varianter af

NFκB1

NFκBIA

gener, hvis funktionelle, kunne forventes at have en effekt på celledød, og dermed, carcinogenese.

Flere forening undersøgelser har rapporteret, at

NFκB1

NFκBIA

polymorfier er relateret til udviklingen af ​​inflammatoriske og andre sygdomme, herunder colitis ulcerosa, Graves ‘sygdom og diabetes mellitus, og modtageligheden for tumorer, herunder melanom, blærekræft og CRC i forskellige etniske grupper [32], [36], [45], [46], [47], [48]. . Gao

et al

‘s undersøgelse rapporteret en mangel på en sammenhæng mellem

NFκBIA2758 A G

polymorfi i det nordlige kinesiske befolkning, men viste en forening med den svenske befolkning og CRC risiko [36 ].