PLoS ONE: MUC1 selektivt Mål Menneskelig kræft i bugspytkirtlen i ortotopisk Nude Mouse Models

Abstrakt

Målet med denne undersøgelse var at bestemme, hvorvidt MUC1 antistof konjugeret med en fluorofor kunne bruges til at visualisere kræft i bugspytkirtlen. Anti-MUC1 (CT2) antistof blev konjugeret med 550 nm eller 650 nm fluoroforer. Nøgen mus blev anvendt til at fremstille subkutane og ortotopisk modeller af pancreascancer. Western blot og flowcytometrisk analyse bekræftede ekspressionen af ​​MUC1 i humane bugspytkirtelkræft cellelinjer, herunder BxPC-3 og Panc-1. Immuncytokemi med fluorophor konjugeret anti-MUC1 antistof demonstrerede fluorescerende områder på membranen af ​​Panc-1 cancerceller. Efter indsprøjtning af konjugerede anti-MUC1 antistoffer via halevenen, subkutant transplanteret Panc-1 og BxPC-3 tumorer udsendte stærke fluorescerende signaler. I det subkutane tumormodeller, blev det fluorescerende signal fra det konjugerede anti-MUC1 antistof bemærket rundt om margenen af ​​tumoren og rummet mellem cellerne. Det konjugerede anti-MUC1 antistof bundet tumoren i orthotopisk-transplanterede Panc-1 og BxPC-3 modeller muliggør tumorerne, der skal afbildes. Denne undersøgelse viste, at fluoroforen konjugeret anti-MUC1 antistoffer kunne visualisere pancreastumorer in vitro og in vivo og kan bidrage til at forbedre diagnosticering og behandling af kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Park JY, Hiroshima Y, Lee JY, Maawy AA, Hoffman RM, Bouvet M (2015) MUC1 selektivt Mål Menneskelig kræft i bugspytkirtlen i ortotopisk Nude musemodeller. PLoS ONE 10 (3): e0122100. doi: 10,1371 /journal.pone.0122100

Academic Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: Januar 14, 2015; Accepteret: 18 februar 2015; Udgivet: Marts 27, 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute CA142669 og CA132971 (til MB og AntiCancer, Inc.), og en bevilling fra Korea Research Foundation under den grundlæggende fremme forskningsfond af Undervisningsministeriet og Health Resources Development Korea fra 2010 til 0.022.990 (til JYP). Den bidragyder ydet støtte i form af lønninger til forfattere [MB], men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. JYP, YH og RMH er ikke-funktionærer afdelinger af AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. markedsfører dyremodeller for kræft. Der er ikke andre konkurrerende interesser. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

tumor markør CA19-9 kan være påvises i serum fra patienter med kræft i bugspytkirtlen. Men nytten af ​​CA19-9 som et diagnostisk eller prognostisk kræft biomarkør er tvivlsom. Følsomheden af ​​serum CA19-9 spænder fra 41 til 86% med en specificitet på 33 til 100%, som ikke er egnet til screening eller diagnose [1]. CA19-9 er ofte forhøjet i andre inflammatoriske sygdomme og galde obstruktion betingelser, således at dens anvendelighed som en biomarkør er endnu mere tvivlsom. Der er behov for bedre biomarkører for pancreascancer [2].

MUC1 er et membranbundet glycoprotein bestående af en stor ekstracellulær underenhed af en 20 aminosyre tandem gentagelse domæne, en lille ekstracellulært domæne underenhed, et transmembrandomæne og en cytoplasma hale [3]. MUC1 ofte overudtrykkes i forskellige cancerformer, herunder bryst-, ovarie-, lunge- og coloncancer [3,4]. Det er også betragtes som en potentiel diagnostisk, prognostisk og terapeutisk biomarkør af kræft i bugspytkirtlen. MUC1 er overudtrykt i over 90% af kræft i bugspytkirtlen patient tumorer [5]. Stærk udtryk for MUC1 er associeret med nedsat overlevelse [6]. MUC1 målrettet terapi er blevet testet i prækliniske og kliniske forsøg [7-9]. Der er gjort forsøg til påvisning MUC1 i serum fra patienter og bugspytkirtelkræft væv med forskellige metoder [10,11].

Vi har vist, at anti-CEA-antistof konjugeret med fluoroforer bidraget til at forbedre kræft påvisning og aktiveret fluorescens -Guidede kirurgi (FGS) i bugspytkirtlen og tyktarmskræft musemodeller, som væsentligt forbedret resultat i forhold til standard lyse lys kirurgi [12-14]. Det er blevet rapporteret, at cathepsin og claduin-4 målrettede optisk billeddannelse været med til at opdage kræft i bugspytkirtlen og dens forløber i musemodeller [15,16].

I den foreliggende undersøgelse, vi afgøres, om anti-MUC1 antistof konjugeret med en fluorofor kunne målrette og visualisere bugspytkirtelkræft in vitro og in vivo modeller.

Materialer og metoder

bugspytkirtelkræft cellelinjer

De humane bugspytkirtelkræft cellelinjer BxPC-3 [ ,,,0],17] og Panc-1 [18] blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), penicillin /streptomycin (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), natriumpyruvat (Gibco-BRL) , natriumbicarbonat (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamin (Gibco-BRL), og minimalt essentielt medium ikke-essentielle aminosyrer (Gibco-BRL). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator.

Konstruktion af GFP-udtrykkende pankreatisk cancercellelinie

Konstruktionen af ​​grønt fluorescerende protein (GFP), der udtrykker Panc-1-cellelinien blev udført som tidligere [19] beskrevne. For GFP-genet transduktion, 20% konfluente Panc1 celler [18] blev inkuberet med en 1: 1 udfældede blanding af retrovirale supernatanter af de PT67 pakkeceller og RPMI 1640 (Gibco-BRL, Life Technologies, Inc.) i 72 timer. Cellerne blev høstet ved trypsin /EDTA 72 timer efter inkubation med GFP retrovirale supernatanter og subdyrket i et forhold på 1:15 i selektivt medium, der indeholdt 200 ug /ml G418. Niveauet af G418 blev forøget til 800 ug /ml trinvis. Kloner udtrykker GFP blev isoleret med kloning cylindre (Bel-Art Products, Pequannock, NJ) ved trypsin /EDTA og blev forstærket og overført ved konventionelle dyrkningsmetoder. Høj GFP-ekspression kloner blev derefter isoleret i fravær af G418 for 10 passager for at vælge for stabil ekspression af GFP [20-22].

Mus

athymiske

nu /nu

nøgne mus (AntiCancer Inc., San Diego, CA) , 4-6 uger gamle, blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev holdt i en barriere facilitet under HEPA filtrering. Mus blev fodret med en autoklaveret laboratorium gnaver kost. Alle mus kirurgiske procedurer og billeddannelse blev udført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injektion af 50% ketamin, 38% xylazin, og 12% acepromazinmaleat (0,02 ml). Dyrene modtog buprenorphin (0,10 mg /kg ip) umiddelbart før kirurgi og en gang om dagen i løbet af de næste 3 dage til at lindre smerte. Den maksimale tumorstørrelse var mindre end 2 cm. Betingelsen af ​​dyrene blev overvåget hver dag. Dyrene blev alle aflivet 2-3 uger efter operationen. CO2 inhalation blev anvendt til eutanasi. At sikre død efter CO2-kvælning, blev cervikal dislokation udført. Alle dyreforsøg blev godkendt af AntiCancer, Inc. Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er beskrevet i National Institute of Health Guide for pasning og anvendelse af dyr under Assurance Number A3873-1.

antistof-dye konjugation

Hamster monoklonale antistoffer mod MUC1 (CT2, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) blev konjugeret med DyLight 650 eller 550 farvestoffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA ) pr producentens specifikationer, hvilket sikrer et minimum af mindst 4: 1 farvestof: protein-forhold. Protein: dye koncentrationer blev bekræftet ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) [23]

Western blotting

Cellelysater blev udvundet i lysis buffer indeholdende 70 mM β-glycerophosphat. , 0,6 mM natriumorthovanadat, 2 mM MgC

2, 1 mM ethylenglycol-tetraeddikesyre, 1 mM DTT (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 0,5% Triton-X100, 0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Lysater blev adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranerne blev blokeret i 5% (vægt /volumen) fedtfrit tørmælk og probet med antistoffer. Anti-MUC1 (CT2) anvendt. De immunreaktive proteiner blev visualiseret under anvendelse af SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Flowcytometrisk analyse

Celler blev dyrket til 80% konfluens, behandlet med Accutase opløsning (Sigma) i 5 minutter, vasket to gange med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) puffer (2% FBS, 0,1% natriumazid i PBS). Celler (1 x 10

6) blev resuspenderet i FACS-buffer. Celler blev fikseret med 2% paraformaldehyd og derefter blokeret med 2% BSA-PBS-opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev inkuberet med anti-MUC1 (CT2, 2 ug /test) i 40 minutter ved stuetemperatur, og derefter med gede-anti-armensk hamster IgG-FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) i 40 minutter ved stuetemperatur . Efter vask med FACS-buffer blev cellerne resuspenderet i FACS buffer og udsat for flowcytometri under anvendelse af en FACS Aria (BD Immunocytometry Systems, Franklin Lakes, NJ). Side scatter og forward scatter profiler blev brugt til at fjerne celle dubletter.

Immuncytokemi af levende celler

Panc-1 celler (2 x 10

5) blev dyrket natten over. Anti-MUC1 (CT2) antistof konjugeret med DyLight 550 farvestoffer blev fortyndet til 4 ug /ml i PBS (Corning Cellgro, Manassas, VA). Dyrkningsmediet fra cellerne blev aspireret og den fortyndede antistof blev sat til de levende celler. Celler blev inkuberet med antistof i 1 time ved stuetemperatur. Cellerne blev vasket forsigtigt 2 gange med phosphatbufret saltvand efter antistoffet blev aspireret. Cellerne blev observeret under en FV1000 konfokal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med hvidt lys og 559 nm laser [24].

Immunhistokemi

For fluorescens immunfarvning på lysbilleder fremstillet af frossen tumorvæv , anti-MUC1 (CT2) konjugeret med DyLight 650 blev anvendt. Objektglassene blev inkuberet med 10% normalt donkey serum i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med det konjugerede antistof ved stuetemperatur i 1 time ved en fortynding på 1: 100. Væv blev tørret og observeret med en IV-100 scanning laser mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med 633 nm laser [25]. Alternative dias fra den samme frosne tumorvæv blev farvet med hematoxylin og eosin og observeret under lysmikroskop.

Skin flap model

Nøgne mus blev bedøvet med ketamin blandingen via subkutan injektion. En bue-formet indsnit blev lavet i den abdominale hud. Det subkutane bindevæv blev adskilt for at frigøre hudlap uden at skade arterien og venen. Huden flap blev spredt og fast på den flade standen. Panc-1-GFP (1 X 10

6 celler) i 30 pi matrigel blev drysset på den indvendige overflade af huden flap, og huden blev lukket [26].

Subkutan og orthotopisk tumor musemodel

for at gøre subkutant transplanteret pancreas tumor-modeller, Panc-1 og BxPC-3 humane bugspytkirtelkræftceller (2 × 10

6) blev injiceret subkutant i flankerne af nøgne mus. Når de subkutane tumorer voksede mellem 10 og 20 mm i diameter, blev de høstet og opsplittet i små fragmenter. De tumorfragmenter blev implanteret orthotopisk i nøgne mus, som beskrevet tidligere [19,27-29].

Hele kroppen imaging

I begge subkutane og ortotopisk tumormodeller, blev musene injiceret med den antistof konjugeret med fluorofor i halevenen, og derefter hele kroppen billeddannelse blev udført ved anvendelse af OV100 Small Animal Imaging System (Olympus, Tokyo, Japan) efter anæstesi med ketamin blandingen beskrevet ovenfor [30]. Den optimale dosis for dyreforsøg blev besluttet af dosis af det konjugerede antistof, som producerede billeder med den bedste tumor til baggrund forholdet i subkutan tumor model.

Billedanalyse

Alle billeder blev analyseret med Billede- J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland), før processen med billeder og sammenlignet. Billede proces blev udført med Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc., San Jose, Californien).

Resultater

Angivelse af MUC1 i bugspytkirtelkræft cellelinjer

Både kræft i bugspytkirtlen testede cellelinjer (BxPC-3 og Panc-1) havde MUC1 ekspression observeret med Western blotting (fig 1A). Andelen af ​​MUC1-positive celler var 36,9% i BxPC3 og 24,4% i Panc1 bugspytkirtelkræft cellelinjer, som observeret med flowcytometri (fig 1B). Den samme test blev gentaget i hver cellelinje mindst tre gange. Resultaterne af alle forsøg viste, at anti-MUC1 (CT2) antistof kunne registrere MUC1 på cellemembranen af ​​kræft i bugspytkirtlen celler in vitro.

(A) Western blot analyse viser MUC1 udtryk i bugspytkirtelkræft cellelinjer (BxPC -3 og Panc-1). (B) Flowcytometrisk analyse viser ekspressionen af ​​MUC1 på overfladen af ​​BxPC-3 og Panc-1 cellelinier. (C) Immuncytokemi på levende celler viser flere fluorescerende prikker på overfladen af ​​Panc-1-celler. Repræsentative fluorescens billeder fusioneret med tilsvarende DIC (differential interferens kontrast) billeder (x60 nedsænkning i vand mål på FV1000, ved hjælp af 559 nm laser).

Immuncytokemi blev også udført ved hjælp af anti-MUC1 (CT2) antistof konjugeret med flourophores. Efter inkubering med det konjugerede antistof uden gennemtrængning blev multiple fluorescerende prikker noteret på overfladen af ​​Panc-1-celler under et fluorescensmikroskop (figur 1C). Fusionere med tilsvarende differential interferens kontrast mikroskopi bekræftede, at fluophore-konjugeret antistof omsættes med MUC1 på overfladen af ​​de bugspytkirtelkræftceller og produceret fluorescens.

Målretning af subkutane pancreas tumorer med fluorescerende MUC1

Når BxPC-3 eller Panc-1 subkutane tumorer havde nået ca. 10-20 mm i diameter, blev dyrene hver fik en enkelt 30 ug dosis DyLight 650-konjugeret anti-MUC1 (CT2) via halevenen. Musene blev afbildet under både lysfelt og fluorescens belysning ved hjælp af Olympus OV100 Small Animal Imaging System. Både Panc-1 (fig 2A) og BxPC-3 (data ikke vist) tumor viste stærkere fluorescens. Fluorescens immunfarvning blev udført på frosne tumorprøver fremstillet af BxPC-3 og viste fluorescens på cellemembraner demonstrerer ekspressionen af ​​MUC1 (Fig 2B).

(A) Musen afbildes under både hvidt lys og fluorescens belysning. Intensiteten af ​​det røde fluorescens-signalet fra Panc1 subkutan tumor er stærkere end baggrunden. (B) Hematoxylin og eosin-farvning (x200, venstre). Fluorescens immunfarvning for MUC1 (x20 regelmæssig mål, højre) af frosne tumorprøver viser fluorescens signaler på membranen af ​​kræftcellerne.

Målretning af bugspytkirtelkræftceller i hudlapper med fluorescerende MUC1

Mus med bugspytkirtelkræftceller vokser i hudlapper blev injiceret med anti-MUC1 (CT2) konjugeret med DyLight 550 farvestoffer i halevenen. Otteogfyrre timer efter antistoffet injektion blev hudlap spredes igen. Billeddannelse blev udført med OV100 og FV1000. Adskillige kolonier af kræftceller blev noteret på overfladen af ​​huden flap med OV100. GFP fluorescenssignaler fra individuelle cancerceller blev observeret med FV1000. Ved ydersiden margen af ​​kolonien og mellemrummet mellem cancerceller inde i kolonien, 550 nm fluorescenssignaler, der stammede fra fluoroforen-konjugeret antistof, blev observeret. (Fig 3) Resultaterne viste, at antistoffet reagerede med MUC1 på membranen af ​​kræftceller in vivo.

Repræsentative billeder blev opnået under hvidt lys, og 473 nm og 559 nm lasere på OV100, og fusionerede . GFP signal fra de enkelte kræftceller og rødt fluorescerende signal fra DyLight 550 fluoroforen-konjugeret anti-MUC1 antistof på ydersiden margen af ​​kolonien og plads mellem kræftcellerne blev observeret.

Målretning af pancreas tumorer i ortotopisk modeller med fluorescerende MUC1

Mus med tumorer implanteret orthotopisk i musen pancreas blev injiceret med DyLight 650-konjugeret anti-MUC1 (CT2) antistof med en enkelt 30 ug dosis via halevenen 7-10 dage efter tumorimplantation. Billeddannelse blev udført efter åbning af abdomen af ​​musene. Intravital billeddannelse med OV100 opdaget fluorescens signal, der kommer fra Panc1 og BxPC3 tumorer (Fig 4). Tumorer mindre end 5 mm kunne detekteres med fluorescens imaging (figur 4). De gennemsnitlige forhold mellem fluorescensintensiteten mellem tumor og baggrund i Panc-1 og BxPC-3 ortotopisk tumorer var 6,70 og 2,39, henholdsvis. Disse resultater bekræftede, at i ortotopisk tumormodeller, MUC1 målrettet bugspytkirtelkræft og aktiveret tumor detektion. Andre end tumoren, blev fluorescenssignaler detekteret fra huden og, blære og tarmindholdet, men ved lavere intensitet.

påvistes fluorescenssignaler fra pankreatiske tumorer orthotopisk transplanteret i halen på bugspytkirtlen. Andre end tumoren, blev fluorescenssignal detekteret fra huden og, blære og tarmindhold men ved lavere intensitet end tumoren. Hvide pile angiver pancreastumor.

Discussion

MUC1 er en meget attraktiv imaging biomarkør for kræft i bugspytkirtlen, da det overudtrykkes i ca. 90% af patienter med pancreascancer [5,6]. De foreliggende resultater fra subkutane og ortotopisk tumormodeller viser, at MUC1 kan målrette og visualisere bugspytkirtelkræft ved at gøre det fluorescerende. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at MUC1 er en ekstra mål for kræft i bugspytkirtlen mærkning og terapi levering. MUC1 kan være et nyttigt mål at identificere og behandle fjernt metastase af alle cancertyper, der udtrykker antigenet under anvendelse af mærkede eller terapeutiske bærende antistoffer.

BxPC-3 og Panc-1 blev udvalgt baseret på tidligere undersøgelser med disse cellelinier til fluorescens-vejledt kirurgi (FGS) [13,14]. Det er muligt, at den del af positive celler i tumoren, er mindre end den, der ses ved flowcytometri på grund af sterisk hindring til antistof indtræden i tumoren. Det er også muligt, at tilstedeværelsen af ​​stromale celler i tumoren kan nedsætte procentdelen af ​​positive celler.

CT2 antistof genkender både levende cancerceller samt celler i tumoren i mus, som er let visualiseret ved konjugering af antistoffet til en fluorofor. Det er muligt, i den levende celle, tilstrækkelige dele af den cytoplasmatiske hale bliver tilgængelige for antistoffet. Som nyligt fremgik af Kumar et al, er mere undersøgelse er nødvendig for at forstå strukturen og subcellulær lokalisering af MUC1 protein [31].

Der har været forsøg på at anvende MUC1 som en behandling target. MUC1 målrettet billedbehandling kan guide lægemidler til tumoren [11,32,33]. Imaging til MUC1 kan vise, om terapeutiske mål er til stede i cancerceller og forudsige behandlingsrespons af MUC1-målrettet terapi [5]. Desuden kan fluorescensimagografi rettet mod MUC1 i bugspytkirtelkræft forbedre tumor visualisering for at opnå fuldstændig resektion under kirurgi. Fluorescerende guidet kirurgi (FGS) har vist sig at forbedre overlevelsen i musemodeller med pancreascancer [13,14].

I den foreliggende undersøgelse, ønskede vi at studere MUC1 målretning af human pancreascancer med det næste mål for studerer MUC1 målretning i vores bugspytkirtelkræft ortotopisk xenograft (PDOX) modeller [12]. Efterfølgende fremtidige undersøgelser vil være på MUC1 målrettet i spontane PDAC musemodeller. Formel bio-distributions- undersøgelser vil ske i fremtidige eksperimenter. Den foreliggende undersøgelse viser MUC1 kan anvendes til selektiv tumortargeting in vivo. Baseret på evnen af ​​fluorescerende MUC1 antistof rettet mod at belyse disse tumorer, kan vi nu sammenligne FGS i fremtidige studier med mærket anti-CEA og anti-MUC1.