PLoS ONE: Iod-131 dosisafhængig genekspression i skjoldbruskkirtelkræft og tilsvarende normale væv efter Tjernobyl ulykke

Abstrakte

Det stærke og konsekvent sammenhæng mellem bestråling i en ung alder og efterfølgende kræft i skjoldbruskkirtlen giver en fremragende model til at studere stråling carcinogenese hos mennesker. Vi evaluerede således differentieret genekspression i skjoldbruskkirtlen væv i forhold til jod-131 (I-131) doser modtaget fra Tjernobyl-ulykken. Sixty tre af 104 papillære skjoldbruskkirtelkræft diagnosticeret mellem 1998 og 2008 i den ukrainsk-amerikanske kohorte med individuelle skøn I-131 skjoldbruskkirtel dosis havde parret RNA prøver fra frisk frosset tumor (T) og normal (N) væv, som Tjernobyl Tissue Bank og kriterier tilfredse kvalitetskontrol. Vi først hybridiseret 32 ​​tilfældigt tildelte RNA eksemplar par (T /N) på 64 hele genomet microarrays (Agilent, 4 × 44 K). Sammenslutninger af differential genekspression (log

2 (T /N)) med dosis blev vurderet ved hjælp af Kruskall-Wallis og trend test i lineære mixed regressionsmodeller. Mens ingen af ​​generne modstod korrektion for den falske opdagelse sats, valgte vi 75 gener med

a priori

beviser eller P Kruskall /P trend 0,0005 for validering af QRT-PCR på de resterende 31 RNA specimen par ( T /N). De QRT-PCR-data blev analyseret under anvendelse Lineære regressionsmodeller, der omfattede strålingsdosis som en kategorisk eller ordenstal variabel. Elleve af 75 QRT-PCR analyseret gener (

ACVR2A

,

AJAP1

,

CA12

,

CDK12

,

FAM38A

,

GALNT7

,

LMO3

,

MTA1

,

SLC19A1

,

SLC43A3

,

ZNF493

) blev bekræftet til har en statistisk signifikant differentiel dosis-udtryk forhold. Vores undersøgelse er blandt de første til at give direkte humane data om langsigtet differential genekspression i forhold til de enkelte I-131 doser, og at identificere et sæt gener potentielt vigtige i stråling carcinogenese

Henvisning:. Abend M, Pfeiffer RM, Ruf C, Hatch M, Bogdanova TI, tronko MD, et al. (2012) Jod-131 dosisafhængig genekspression i skjoldbruskkirtelkræft og tilsvarende normale væv efter Tjernobyl ulykken. PLoS ONE 7 (7): e39103. doi: 10,1371 /journal.pone.0039103

Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italien

Modtaget: Marts 20, 2012; Accepteret: 16 maj 2012; Udgivet: 25 Jul 2012

Copyright: © 2012 Abend et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev primært støttet af den tyske forsvarsministerium. Yderligere midler indskudt af Intramural Research Program, Division of Cancer Epidemiologi og Genetik, National Cancer Institute, National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer hermed, at en af ​​medforfatterne bliver nylig ansat i NOVA Research Selskabet ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. Den medforfatter arbejdede på Radiation Epidemiologi Branch /National Cancer Institute (REB /NCI), før hun skiftede til NOVA Research Company, hvor hun er ansat nu. På tidspunktet for Radiation Epidemiologi Branch /National Cancer Institute (REB /NCI) gjorde hun sit bidrag.

Introduktion

En af de vigtigste sundhedsmæssige konsekvenser af 1986 Tjernobyl-atomkraftværket ulykke er en dramatisk stigning i skjoldbruskkirtlen kræfttilfælde blandt dem, der var børn eller unge på det tidspunkt [1], [2]. Talrige epidemiologiske undersøgelser har fastslået, at dette primært er relateret til jod-131 (I-131) eksponering fra ulykken til skjoldbruskkirtlen [3] – [7]. Trods forskelle i studiepopulationer, design og dosimetriske tilgange, rapporterede estimater af relative risiko (RR) per enhed af absorberet strålingsdosis i grå (Gy) for dem, der udsættes i barndommen er bemærkelsesværdigt ens blandt de fleste undersøgelser (3-6 pr Gy) og forenelig med de risici, anslået for kræft i skjoldbruskkirtlen fra barndommen udsættelse for ekstern stråling [3] – [8]

undersøgelsen af ​​stråling carcinogenese hos mennesker kan drage fordel af tilfælde, hvor relationer er stærk og konsekvent, som i. situation, hvor skjoldbruskkirtlen bestråles i en ung alder. Muligheden for molekylær forskning af stråling-relaterede kræft i skjoldbruskkirtlen lettes af ressourcerne i Tjernobyl Tissue Bank (CTB), som systematisk indsamler biologiske prøver fra patienter med Tjernobyl-relateret thyroid patologi [9]. Tidligere post-Tjernobyl studier rapporterede genetiske forskelle mellem stråling-relaterede og sporadiske tumorer, herunder specifikke

RET /PTC

gen omlejringer [10] – [12]. Men efterfølgende analyser som anvender CTB prøver tilskrives foreningerne til den yngre alder af Tjernobyl-eksponerede patienter frem til deres stråling [13], [14]. Nylige undersøgelser ved hjælp af CTB materialer og high throughput teknologier har identificeret nye “stråling-specifikke ‘gener [15] – [20]. Måske den mest overbevisende fund stammer fra en rapport, der sammenligner udsatte og ikke-udsatte papillær kræft i skjoldbruskkirtlen (PTC) tilfælde med unge alder debut fra Ukraine, der findes en gevinst på kromosom band 7q11 baseret på komparativ genomisk hybridisering, bekræftet i uafhængige sager ved fluorescens

in situ hybridisering

(FISH) og kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR) [20]. Men resultaterne på genniveau er generelt uforenelige tværs undersøgelser potentielt på grund af små stikprøvestørrelser, brug af kontroller fra forskellige populationer, manglende metodologisk validering i uafhængige stikprøver, og forskellige analytiske tilgange. Vigtigere, ingen af ​​de tidligere undersøgelser havde enkelte strålingsdoser antage, at alle udsatte tilfælde fik den samme dosis. Afhængig af den sande dosis-udtryk forhold, kan denne antagelse medføre falsk positive eller falsk negative associationer.

For at forbedre forståelsen af ​​de molekylære konsekvenser af I-131 eksponering, vi evalueret for første gang forskellen genekspression i skjoldbruskkirtlen væv, defineret som en forskel i genekspression niveauer mellem tumor og tilsvarende normale thyreoideavæv, i forhold til de enkelte estimater i-131 skjoldbruskkirtel dosis. Vi antager, at hvis dosisrelaterede genekspression mønstre i tumorvæv virkelig afspejler en vigtig begivenhed i stråling carcinogenese snarere end en langvarig effekt af stråling, bør de adskiller sig fra mønstre observeret i normalt væv; dermed vores tilgang med at analysere differentierede dosis-udtryk relationer i tumor i forhold til parret normale prøver. Vores undersøgelse anvendte RNA prøver fra CTB af patienter, som gennemgik skjoldbruskkirtlen kirurgi for kræft i skjoldbruskkirtlen i ukrainsk-amerikanske kohorteundersøgelse bestående af ca. 13.000 ukrainske beboere 18 år på tidspunktet for ulykken med individuelle radioaktivitetsmålinger vedtages inden to måneder efter, at ulykke [21].

i den aktuelle undersøgelse, vi først foretaget en indledende screening i halvdelen af ​​tilfældene at identificere lovende gen kandidater, der var differentielt udtrykte i tumor og normale vævsprøver i forhold til i-131 dosis baseret kun hele genom-RNA microarrays (fase i). Vi derefter valideret toppen kandidater i tumor og normale vævsprøver fra anden halvdel af tilfældene bruger QRT-PCR (fase II). For de validerede kandidater vi desuden karakteriseret forholdet af genekspression separat i tumor og normalt væv.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Som et resultat af fire sekventielle screening eksamener, blev 110 fremherskende og hændelsen thyreoidea carcinomer diagnosticeret i ukrainsk-amerikanske kohorte mellem 1998 og 2008 på Laboratoriet for morfologi endokrine system af Institut for Endokrinologi og Metabolisme (IEM, Kiev, Ukraine) [3]. Den internationale Pathology panel, der er etableret i forbindelse med CTB-projektet, gennemgået alle patologiske diagnoser. For at mindske fænotypisk heterogenitet af sager, vi udelukkede 5 follikulært og 1 medullære skjoldbruskkirtlen karcinomer resulterer i 104 PTC’er berettiget til analyse; af disse 74 (71%) havde lagret RNA alikvoter fra tumor og /eller normalt væv i CTB. Sager inkluderet og ikke inkluderet i genekspression analyser var ens i mange karakteristika, herunder I-131 dosis og dermed vores undersøgelse prøve forventes at være upartisk. Alle vævsprøver blev taget intraoperativt efter patienter underskrevet informeret samtykke formularer godkendt af de institutionelle anmeldelse boards (IRB) i IEM og koordinerende center for CTB-projektet (Imperial College videnskabsetisk komité, London, UK). Årlig gennemgang af hele projektet blev også leveret af IRB af National Cancer Institute i USA.

Detaljerede operationelle procedurer for indsamling, dokumentation, og behandling af frossen tumor og normal skjoldbruskkirtel vævsprøver er tilgængelige fra . CTB hjemmeside [22] og blev udviklet i samarbejde med Laboratoriet for morfologi endokrine system af IEM og Wales Cancer Bank

Dosimetri

Dosimetriske metoder er blevet beskrevet andetsteds [23] – [ ,,,0],25]. Kort fortalt blev individuelle I-131 skjoldbruskkirtlen doser og deres usikkerheder estimeres ud fra kombinationen af ​​skjoldbruskkirtlen radioaktivitet målinger, data om kosten og livsstilsvaner, og overføre modeller miljømæssige hjælp af en Monte Carlo procedure med 1.000 erkendelser pr individuel [23]. Til analysen, brugte vi det aritmetiske gennemsnit af den enkeltes 1.000 erkendelser som det bedste skøn over I-131 dosis korrigeret for skjoldbruskkirtlen masser typiske for den ukrainske befolkning [3].

RNA Extraction og kvalitetskontrol

kan opnås Detaljerede oplysninger om RNA ekstraktion fra CTB hjemmeside [22]. Kort fortalt er frosset thyreoideavæv homogeniseret ved anvendelse af en vævs- lyser (Qiagen, Hilden, Tyskland). RNA ekstraheres ved hjælp af Qiagen column-baserede systemer. RNA fryses ved -80 ° C i standard 5 ug alikvoter i 20 pi. Kvalitet og mængde isolerede total RNA måles spektrofotometrisk (NanoDrop, PeqLab Biotechnology, Erlangen, Tyskland) og RNA integritet vurderes af 2100 Agilent Bioanalyser (Life Science Group, Penzberg, Tyskland). For vores analyse, vi brugte kun RNA prøver med et forhold A

260 /A

280 ≥ 2,0 (NanoDrop) og RNA integritet nummer (RIN) ≥7.5 eller ≥5.5 for hele genomet microarray og QRT-PCR-analyser, henholdsvis (IMGM Laboratories, Martinsried, Tyskland).

Selvom CTB forudsat 137 RNA prøver for 71 personer med PTC, var vi i stand til at bruge 126 parrede (tumor /normal) RNA prøver svarende til 63 personer (figur 1 ). Eleven RNA prøver fra otte personer blev udelukket på grund af manglende supplerende væv (n = 5) eller på grund af mangel vores kvalitetskriterier angivet ovenfor (n = 6).

Whole Genome microarray analyse (fase I)

Genome bred udtryk profilering blev udført ved hjælp af Agilent oligo microarray (4 × 44 K-format) kombineret med en en-farve baseret hybridisering protokol om 64 parrede RNA prøver fra 32 tilfældigt udvalgte personer (halv prøven sæt) . For at sikre, at personer udvalgt til microarray genekspression analyse (n = 32), og dem er tilbage til validering analyse ved QRT-PCR (n = 31) var ens, vi bekræftet, at deres fordelinger af køn, alder, bopæl, og I- 131 dosis var ens.

Kemikalier, kits, og software til hele genomet microarray analyse blev leveret af Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland. 500 ng af total RNA pr prøve (tilsat en intern kontrol mærkning) blev indført i en RT-IVT reaktionen og cDNA blev derefter omdannet til mærket cRNA ved in-vitro transcription trin (én farve Quick-Amp mærkning kit). Kvaliteten af ​​mærket ikke-fragmenteret cRNA blev analyseret (RNA 6000 Nano LabChip kit), og cRNA blev renset og kvantificeret (NanoDrop ND-1000 Spetralphotometer). Endelig 1,65 ug af hvert mærkede cRNA prøve var fragmenteret og forberedt til en farve baseret hybridisering (genekspression hybridisering kit). Hybridisering fandt sted ved 65 ° C i løbet af 17 timer på separate mikroarrays bestående af 41.000 target gen-specifikke prober (~20,000 gener) og tusindvis af kontrol- prober. Efter tre vaske med stigende stringens, blev påvist fluorescerende signalintensiteter på Agilent mikromatrice scanner og udvindes af billeder ved hjælp af Agilent udvinding software. Fraktil normalisering blev anvendt på de data

Fase I:. Statistisk analyse af Microarray Data og Udvælgelse af Gene Kandidater Frie Validering

Vi analyserede forskellen genekspression i tumor i forhold til normalt væv, fremstillet ved subtrahere log

2 transformerede probesignaler af det normale væv (N) fra den tilsvarende tumorvæv (T), log

2 (T) -log

2 (N), i forhold til i-131-dosis anslår. Denne fremgangsmåde mindsker variabilitet i genekspression. Vi brugte den ikke-parametrisk Kruskall-Wallis test (P Kruskall) at sammenligne forskellen genekspression på tværs af tre kategorier dosis (≤0.30, 0,31-1,0, 1,0 Gy) med cut-off points omtrent svarer til de tertiles af dosisfordeling blandt sager, og lineære regressionsmodeller med trend test (P lineær) for kontinuerlig dosis. Kun de gentranskripter, der havde et opkald “til stede” i mindst 50% af RNA-prøver fra tumor og normalt væv blev inkluderet i analysen af ​​differentiel genekspression (~15,000). Vi korrigeret for flere sammenligninger ved hjælp af falske opdagelse sats (FDR) [26]. Da ingen af ​​de P-værdier forblev signifikant efter FDR korrektion, vedtog vi følgende kriterier for at vælge lovende kandidater til validering og kvantificering af QRT-PCR: (P Kruskall ≤0.001) eller (0,001 P Kruskall ≤0.01 og P lineær ≤0.01 ) eller (0,01 P Kruskall 0,05 og P lineær ≤0.001). Samlet, 106 kandidater ud af ca. 2.500 differentielt udtrykt gen-transkripter i forhold til dosis udvælgelseskriterier tilfredse. Vi yderligere indsnævret listen til 41 gener, som udviste de laveste P-værdier (P Kruskall 0,0005 eller P lineære 0,0005) og havde mindst en to-fold forskel (stigning /fald) i differential genekspression mellem højeste i forhold til laveste dosis kategori. Yderligere 34 gener med P Kruskall 0,005 blev inkluderet i validering, fordi der var bevis i litteraturen for genamplifikation (kopi nummer ændring, CNA 3) eller stærk op- /nedregulering i andre studier af kræft i skjoldbruskkirtlen i bestrålet populationer [19], [27]. Således blev 75 gener udvalgt til validering ved hjælp af QRT-PCR (tabel S1). Hertil kommer, at vurdere overensstemmelse mellem hele genomet microarray og QRT-PCR-målinger, vi kørte QRT-PCR (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) for disse gener blandt de 32 personer, der indgår i fase I.

Fase II: Kvantitativ RT-PCR analyse

for at validere vores microarray resultater, vurderet vi genekspression ved QRT-PCR (TaqMan primer probeassays) på 62 parrede RNA prøver fra de resterende 31 personer. Alle kemikalier til QRT-PCR ved hjælp TaqMan kemi blev leveret af Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland. På grund af tekniske årsager individuel primer probe assays var enten køre på en 96-brønds QRT-PCR platform eller bruge en anden platform kaldet lav densitet array (LDA). Tyve fire af de 75 gener blev målt i duplikater, fordi ledig plads på platformene og for at forbedre statistikken. En 0,75 ug RNA portion af hver enkelt var revers transskriberet under anvendelse af en totrins PCR-protokol (høj kapacitet Kit). 50 pi cDNA (svarende til ca. 0,25 ug RNA) blev blandet med 50 pi 2 x RT-PCR Master Mix og pipetteres i 2 af 8 påfyldningsportene af LDA. Kort blev centrifugeret to gange (1.200 rpm, 1 min, Multifuge3S-R, Heraeus, Tyskland), forseglet og overført til 7900 QRT-PCR instrument. Den QRT-PCR blev kørt i to timer efter QRT-PCR-protokol til 384-brønds LDA format. Taqman kemi for 96-brønd platform blev anvendt på lignende måde bortset fra volumen pr reaktionen blev indstillet til 20 pi. Alle tekniske procedurer for QRT-PCR blev udført i overensstemmelse med standardprocedurer implementeret i vores laboratorium i 2008, hvor Bundeswehr Institute of Radiobiologi blev akkrediteret i henhold til DIN EN ISO 9001/2008.

Vi løb fire RNA prøver i tredobbelte på tre forskellige LDA’er at fastsætte en øvre grænse for den lineære-dynamiske område af tærskelværdierne cyklusser (CT). Den øvre grænse for CT var 30, så vi brugte kun CT-værdier 30 til analyse. Ct-værdier blev normaliseret i forhold til medianen genekspression af de undersøgte gener. Denne fremgangsmåde viste sig at være mere robust sammenlignet med anvendelsen af ​​18S rRNA-dubletter spottet på hver LDA til normalisering formål. Den gennemsnitlige variationskoefficient (CV) på QRT-PCR-målinger var 2,5% og 95% af tredobbelte målinger havde CV 4% (fig S1). Differentiel genekspression reflekterende fold-change forskelle i RNA kopiantal i tumorvæv i forhold til de tilsvarende normale væv (anvendt som kalibrator) blev beregnet ved at subtrahere de tilhørende CT-værdier (delta-delta-CT-tilgang).

Pålidelighed og Sammenligning af resultatet af forskellige teknikker i fase i og fase II

Begge metoder målt på 32 personer, der indgår i fase i afslørede sammenlignelige resultater i 70,6% (figur S2A). Mean differential genekspression fra hele genomet microarray undersøgt på fase I individer blev også meget korreleret med QRT-PCR målinger undersøgt på fase II individer (sammenligning af forskellige metoder på forskellige individer, r

2 = 0,81, figur S2B). Endelig QRT-PCR målinger af personer, der indgår og ikke indeholdt i fase I blev også højt korreleret (r

2 = 0,98, figur S3), støtte pålideligheden af ​​de metoder,

Fase II:. Statistisk analyse af QRT-PCR

for at bekræfte fase i resultater, analyser fase II bruges kun individer (n = 31) ikke medtaget i fase I. efter en magt eller log transformation og /eller fjernelse af outliers for udvalgte gener, normaliseret CT-værdier for alle gener blev normalfordelt. Vi først beregnet restprodukter fra standard lineære modeller monteret på genekspression værdier

y

justering for alder ved skjoldbruskkirtlen kirurgi (3 kategorier), køn, og regionen eller bopælsland (Chernigov, Zhytomyr, Kiev), (1) hvor μ er det samlede gennemsnit ekspressionsniveau. Vi vurderede derefter forholdet mellem I-131 dosis og genekspression i lineære mixed modeller med individuelle prøver som resultatet variabel. Disse modeller tegner sig for korrelationer af tumoren og normale målinger væv taget på den samme person, og også rumme dublerede målinger på den samme person for samme vævstype.

Modellerne var (2) hvor r

ij betegner den tilbageværende fra model (1) for forsøgspersoner i (i = 1, 2, …, 31) på j

th prøve (j = 1, 2 for tumor og normalt væv), og ε

ij er normalfordelte fejlled, der også omfatter korrelationer fra gentagne målinger på samme prøve. Dosis effekt i tumorprøver kvantificeres ved dosis

tumor, og dosis effekt i normalt væv er givet ved dosis

normal. For at vurdere forskelle i dosis effekt ved vævstype, testede vi nulhypotesen H

0: dosis

tumor = dosis

normal. Igen blev jeg-131 dosis bruges på to måder: i 3 uafhængige dosisgrupper, hvilket fører til en 2 frihedsgrad Wald test P-værdi for H

0, og ved hjælp af de 3 bestilte dosisgrupper, svarende til en 1 grad frihed test for H

0.The plots viser residualerne og monteret dosis skråninger for normalt og tumorvæv. Fold ændringer i udtryk i forbindelse med dosis blev beregnet som to til magten af ​​forskellen i skråninger, dvs. 2 (dosis

tumor – dosis

normal). Parametre for de blandede modeller blev estimeret ved hjælp af den begrænsede maksimale sandsynlighed metoden indarbejdet i PROC MIXED, SAS 9.1.3 [28].

Resultater

Karakteristik af PTC Cases

Af 63 tilfælde i vores undersøgelse, 56% var kvinder og 54% var beboere i Chernigov regionen (tabel 1). Alder ved ulykkestidspunktet varierede fra 0 til 18 år (gennemsnit 7,9 år) og kræftsygdomme blev diagnosticeret 12.5-21.6 år efter ulykken (gennemsnit 16,5 år). Mean I-131 skjoldbruskkirtel dosis 1,25 Gy på mellem 0,008 og 8,6 Gy. Midler til de 3 kategorier dosis var 0,11, 0,57, og 2,62 Gy hhv. Den mest almindelige histologiske undertype af PTC blev blandet (48%), og resten bestod af follikulær (25%), klassisk papillær (19%), og faste (8%) undertyper. Gennemsnittet af de største tumor diameter var 16,0 mm, med en række 6,0-45,0 mm.

Whole Genome Microarray

Af 19,596 gen mRNA (41,079 udskrifter) spottet på hele genom microarray i gennemsnit 73,4% (interval: 63,3% -91,0%) var skelnes fra baggrunden (udtrykt). Det samlede antal gentranskripter differentielt udtrykt i forhold til I-131-dosis var 2500; af disse udvalgte vi 75 gen kandidater til validering af QRT-PCR (tabel S1)

QRT-PCR

Af 75 gener analyseret, 15 udviklede ingen forstærkning plots, 5 givet resultater i 10 personer, og 6 udviste høj variabilitet sandsynligvis forårsaget af en utilstrækkelig primer-probe design gør disse 26 gener uninformative. For 11 af de resterende 49 gener, den dosisrelaterede ekspression i tumorvæv var statistisk signifikant forskellig fra den dosisrelaterede ekspression i normalt væv, når dosis blev anvendt som en kategorisk eller ordenstal variabel i de lineære blandede modeller (tabel 2). Foreninger signifikante for både kategorisk og ordinal dosis blev fundet for de følgende 6 gener:

ACVR2A

,

CA12

,

CDK12

,

FAM38A

,

LMO3

,

MTA1

(tabel 2). Tre gener (

SLC19A1

,

SLC43A3

,

ZNF493

) havde statistisk signifikante forskelle i differential genekspression for kategoriske dosis (2 frihedsgrader tests), men ikke for ordinal dosis, hvilket tyder på ikke-lineære dosis-ekspressionssystemer relationer; og to gener (

AJAP1

,

GALNT7

) havde en statistisk signifikant forskel i dosis-udtryk forholdet til ordinal dosis, men ikke for kategorisk dosis. For

SLC43A3

sammenhængen mellem genekspression og dosis var begrænset til tumorvæv (2 frihedsgrader test) og for

FAM38A (

2 grad af frihed og en grad af frihed tests),

SLC43A3 Hotel (2 frihedsgrad test),

LMO3

(1 frihedsgrad test),

MTA1

(1 frihedsgrad test) til normalt væv (figur 2 og 3). For

CA12

,

GALNT7

,

LMO3

, og

SLC43A3

der er god adskillelse i udtryk mellem tumor og normalt væv på hvert dosisniveau samt som en antydning af modsatrettede tendenser med dosis. Men i de fleste tilfælde, betydelige forskelle i dosis-respons efter vævstype syntes at skyldes heterogenitet dosis-respons mønstre i fravær af en monoton dosis-respons i begge vævstype.

Bemærk: gennemsnit af tilbageværende genekspression efter fjernelse af virkningerne af alder, regionen, og køn afbildes separat for normalt væv (venstre del af grafen) og tumorvæv (højre del af grafen) mod middelværdien af ​​tre i-131 dosis kategorier (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Cirkler med grå fills svarer til betyde genekspression værdier for normalt væv og pladser med sorte udfyldninger svarer til betyde genekspression værdier for tumorvæv. Fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller. P-værdier for association med dosis er baseret på en 2 frihedsgrader test og en 1 frihedsgrad trend test henholdsvis og givet separat for normalt og tumorvæv i bunden af ​​hvert panel.

Bemærk: Mean af resterende genekspression efter fjernelse af virkningerne af alder, regionen, og køn afbildes separat for normalt væv (venstre del af grafen) og tumorvæv (højre del af grafen) mod middelværdien af ​​tre i-131 dosis kategorier (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Cirkler med grå fills svarer til betyde genekspression værdier for normalt væv og pladser med sorte udfyldninger svarer til betyde genekspression værdier for tumorvæv. Fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller. P-værdier for association med dosis er baseret på en 2 frihedsgrader test og en 1 frihedsgrad trend test henholdsvis og givet separat for normalt og tumorvæv i bunden af ​​hvert panel.

Discussion

Fordi forholdet mellem bestråling i en ung alder og risiko for kræft i skjoldbruskkirtlen er stærk og påfaldende ensartet, denne tumor giver en fremragende model til at studere stråling carcinogenese hos mennesker. Her har vi ansat målingsbaserede individuelle I-131 doser anslået til en kohorte af ukrainske beboere, som var 18 på tidspunktet for ulykken i Tjernobyl og RNA prøver fra frisk frossen thyreoideavæv leveres af CTB. For første gang har vi gennemført analyser af dosis-afhængig genekspression i papillær thyreoideakarcinom forhold til normal thyroid væv fra de samme individer over hele genomet og bekræftede resultater for 11 gener ved QRT-PCR i RNA prøver fra et separat sæt sager . bør overvejes

Flere punkter, når man sammenligner vores resultater til tidligere undersøgelser. Transkriptionel profilering ved hjælp microarrays der tillader samtidig evaluering af tusindvis af gentranskripter har været flittigt brugt til at få indblik i de molekylære forandringer som følge af ioniserende stråling [29] – [35]. Det blev dog først og fremmest anvendes til forskellige celletyper

in vitro

: kulturer af humane keratinocytter [31], lymfoblastoide celler [34], osv Enkelte studier, herunder dyremodeller eller patienter i behandling med strålebehandling undersøgt genekspression snart efter

in vivo

bestråling [32], [33], [35]. De gener, der udstillede dosisrelaterede ændringer efter udsættelse for ioniserende stråling i disse undersøgelser er mest sandsynligt at være nyttige som tidlige biologiske endepunkter og /eller biomarkører for eksponering. Deres nytte i form af langsigtet kræftrisiko hos mennesker stadig at blive etableret. Der var også nogle mekanistiske undersøgelser, som sammenlignede genekspression i stråling kræftformer med genekspression i sporadiske kræftformer eller tilsvarende normale væv [15] – [20], men ingen af ​​disse involverede skøn individuelle dosis. Vores undersøgelse har forsøgt at bygge bro over denne kløft. Brug enkelte I-131 estimater doser, vi evalueret dosis i tre kategorier, uden antagelser om dosis-respons form og under forudsætning af en lineær dosis-respons. Fordi forskellige radiobiologiske mekanismer kan opstå med stigende strålingsdoser herunder celle drab og induktion af vedvarende kromosomale rearrangementer, der selv er kendt for at følge ikke-lineær sammenhæng [36], [37], en krum forhold til forskellen genekspression er plausibel. I overensstemmelse med denne idé, i hvert fald nogle gener (

SLC19A1

,

SLC43A3

,

ZNF493

) udstillet et forslag af ikke-linearitet i differential dosis-respons.

De 11 gener, der blev valideret i en uafhængig tilfælde fastsat af QRT-PCR i vores undersøgelse (tabel S2) er alle placeret på forskellige kromosomer og tilhører forskellige biologiske veje, herunder celleadhæsion (

AJAP1

,

FAM38A

), energi metabolisme (

CA12

), transskription eller DNA methylering (

LMO3

,

ZNF493

,

MTA1

,

SLC19A1

), og vækst /differentiering (

CDK12

,

ACVR2A

). Alle disse veje har været impliceret i cellulære reaktioner på ioniserende stråling [31], [34]. Endnu vigtigere, fire specifikke gener (

CA12

,

GALNT7

,

LMO3

, og

SLC43A3)

tidligere blev rapporteret af Stein et al. skal entydigt dereguleret i post-Tjernobyl skjoldbruskkirtelkræft [19] og et gen (

FAM38A

) er tidligere identificeret af Ory et al. i en undersøgelse af kræft i skjoldbruskkirtlen efter bestråling for en første primær kræft i barndommen [27]. Ud over at finde disse fem gener udtrykkes forskelligt i et selvstændigt sæt af bestrålede sager, vi dokumenteret, at deres differentieret udtryk synes at være dosisafhængig. Derfor er disse gener er særligt attraktive kandidater til yderligere validering undersøgelser, der fokuserer på mekanismer stråling carcinogenese. Ingen af ​​de lovende gener identificeret i vores undersøgelse blev placeret i 7q11.22-11.23; gevinst i denne kromosomale region blev rapporteret i unge debuterende post-Tjernobyl PTC [20].

Flere spor frem fra vores undersøgelse, der kunne vejlede fremtidige studier af stråling carcinogenese. Dosis-afhængighed for differentiel genekspression opdaget året efter eksponering sandsynligvis repræsenterer en sen og /eller langvarig virkning af stråling. En mekanisme, ved hvilken stråling-induceret ændringer kan fastholdes over tid er ved arv af DNA-skader [38]. Det er blevet rapporteret, at ioniserende stråling kan fremkalde en specifik type af DNA-skade, navnlig kopiantal ændringer (CNA’er) [39]. Talrige undersøgelser af sporadiske kræftformer har fastslået, at CNAs kan forme væv transcriptomes og indflydelse genekspression [40]. Derfor, hvis der opretholdes stråling-induceret CNAs under tumorigenese, dosisafhængig differential genekspression kan være delvist tilskrives dosisrelateret ændringer i CNAs. Denne idé finder en vis støtte i undersøgelser, der rapporterede overlap i CNAs og gener unikt dereguleret i post-Tjernobyl tumorer [19] og betydelig overekspression af et gen blandt flere undersøges inden for vundet 7q11.22-7q11.23 region [20]. En anden spirende mekanisme, gennem hvilken stråling kan fremkalde og forevige langvarige ændringer i genekspression er epigenetik [41], [42]. Epigenetiske ændringer indirekte påvirker DNA ved at ændre DNA-methylering, chromatin remodeling, og microRNA (miRNA) ekspression frem for DNA-struktur. Vores fund af dosisafhængig udtryk for visse gener (

FAM38A

,

SLC43A3

,

LMO3

,

MTA1

) i normal thyreoideavæv kan være relateret til stråling-induceret epigenetiske ændringer. Desuden kan dosisrelaterede udtryk ændringer i normalt væv giver en ekstra mulighed for at vurdere individuelle følsomhed over for stråling eksponering [43], [44]. Samtidig evaluering af genekspression, CNAs, og epigenetiske ændringer kan give et fingerpeg om de komplekse virkninger af ioniserende stråling og stråling carcinogenese.

Vores undersøgelse har flere unikke styrker. Først brugte vi individuelle I-131 estimater dosis baseret på radioaktivitet målinger kort efter ulykken [3], [6]. For det andet, opstod sager inden en velkarakteriseret kohorte screenet for kræft i skjoldbruskkirtlen efter en standardiseret protokol og uanset dosis, minimere indvirkningen af ​​umålt confounding.