PLoS ONE: ER Stress Negativt modulerer Ekspression af miR-199a /214 Cluster til Regulerer Tumor Overlevelse og Progression i Human Hepatocellulært Cancer

Abstrakt

Baggrund

Nylige undersøgelser har understreget sygdomsfremkaldende links mellem microRNA (miRNA) deregulering og tumor udvikling. I hepatocellulært carcinom (HCC), blev flere og flere miRNA identificeret som diagnostiske og prognostiske kræft biomarkører, samt yderligere terapeutiske redskaber. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge den funktionelle betydning og reguleringsmekanisme af miR-199a2 /214 klynge i HCC progression.

Metoder og Resultater

I denne undersøgelse viste vi, at miR-214, som samt miR-199a-3p og miR-199a-5P niveauer blev væsentligt reduceret i de fleste undersøgte 23 HCC væv og HepG2 og SMMC-7721 cellelinjer, sammenlignet med deres nontumor modstykker. For yderligere at undersøge rollen af ​​MIR-214 i hepatocarcinogenese, vi beskrevet, at ER stressinduceret pro-overlevelsesfaktor XBP-1 er et mål på MIR-214 ved anvendelse af Western blot-assay og luciferase reporter assay. Re-ekspressionen af ​​miR-214 i HCC-cellelinjer (HepG2 og SMMC-7721) hæmmede proliferation og induceret apoptose. Endvidere ektopisk ekspression af MIR-214 dramatisk undertrykt evne HCC-celler til at danne kolonier in vitro og udvikle tumorer i en subkutan xenotransplantation model af BALB /c athymiske nøgne mus. Desuden genindførelse af XBP-1s svækket miR-214-medieret undertrykkelse af HCC celler spredning, koloni og tumordannelse. For yderligere at forstå den mekanisme af miR-199a /214 klynge ned-udtryk i HCC, fandt vi, at thapsigargin (TG) og tunicamycin (TM) eller hypoxi-induceret udfoldet protein respons (UPR) undertrykker ekspressionen af ​​miR-199a /214 klynge i HCC-celler. Ved promotor analyse af miR-199a2 /214-genet, vi conjectured NFKB som en potentiel negativ regulator. Vi fandt endvidere, at UPR og LPS-induceret NFKB-aktivering undertrykte miR-199a2 /214 transskription, og denne undertrykkelse blev vendt af NFKB hæmning i HCC-celler.

Konklusioner

Vores undersøgelse tyder på, at modulation af miR-214 niveauer kan give en ny terapeutisk tilgang til behandling af cancer og afslørede, at UPR kan tilbyde en ny forklaring på, hvorfor den miR-199a /214 klynge blev nedreguleret i progressionen i HCC

Henvisning:. Duan Q, Wang X, Gong W, Ni L, Chen C, He X, et al. (2012) ER Stress Negativt modulerer Ekspression af miR-199a /214 Cluster til Regulerer Tumor Overlevelse og Progression i Human leverkræft. PLoS ONE 7 (2): e31518. doi: 10,1371 /journal.pone.0031518

Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: September 16, 2011; Accepteret: 9. januar 2012; Udgivet: 16 februar, 2012 |

Copyright: © 2012 Duan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.930.039, 81.000.097 og 30.770.882), og National Basic Research Program Kina (973 Program nr 2007CB512004). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

miRNA er en ny klasse af endogen, ikke-kodende RNA 19-25 nukleotider lange som medierer repression af mål-transkripter ved binding til komplementære frø sekvenser i 3′-utranslaterede regioner (UTR’er) af mål-mRNA’er [1 ]. Siden første observation, har mere end 1400 menneskelige miRNA blevet registreret i miRBase (v.17.0). Tidligere undersøgelser antydet dysexpression af miRNA er blevet observeret i forskellige typer af kræft, og er også forbundet med det kliniske resultat af kræftpatienter [2]. Desuden til evner miRNA opnå samtidig finjustering af talrige forskellige målgener gør dem grundlæggende regulatorer af cellulær signalering og implicerer dem i tumor progression [3], [4]. Men deres specifikke roller og funktioner i de større kræftformer og ondartet progression af kræft er endnu ikke fuldt belyst.

hepatocellulært carcinom (HCC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i hele verden og blandt de førende årsager til kræft- dødsfald i Asien, især i Kina [5]. Adskillige miRNA, såsom miR-101 [6], miR-122 [7], [8], [9] miR-373 [10], miR-221/222 [11], [12], [13], miR-195 [14], miR-30d [15], miR-125b [16], miR-18a [17], miR-139 [18], miR-223 [19] og miR-29 [20], har allerede blevet rapporteret at regulere HCC tumorprogression og metastase ved at regulere vigtige gener såsom Mcl-1, ADAM17, YAP, DDIT4, cyclin D1, CDK6, E2F3, Galphai2, LIN28B, østrogen receptor-α, Rho-kinase 2, Stathmin 1 og bcl-2 og så videre. Dog kan de eksisterende data ikke fuldt ud forklare kompleksiteten af ​​HCC.

For nylig blev miR-199a-3p /5p verificeret at være nedsat i HCC væv, og dens formindske korrelerer signifikant med overlevelsen af ​​HCC patienter, der skitserer en potentiel markør til at forudsige prognosen for HCC patienter [5], [21], [22]. Det er velkendt, at der er to gener, der potentielt koder for PRI-MIR-199a, det primære precursor af HSA-mir-199a. Det første gen er MIR199a1 på kromosom 19 (NCBI GeneID 406.976) og den anden er MIR199a2 på kromosom 1 (NCBI GeneID 406.977) [23]. Interessant, ved 3′-enden af ​​PRI-MIR-199a2 transkript, der er forløber sekvens for en anden miRNA pair HSA-mir-214 og HSA-mir-214 * [24]. MIR-199a2 og MIR-214 er blevet rapporteret at være fremstillet af en enkelt intron-mindre transkript af dynamin 3 modsatte (Dnm3os), der er indlejret i den modsatte streng i en intron af dynamin i muse og human [23], [24] . Endvidere er miPPR-199a2 region vist her for at være den autentiske MIR-199a2 promotor, som producerer det primære transkript huser MIR-199a-3p, MIR-199a-5p og MIR-214 sekvenser som en klynge [25]. Flere og flere undersøgelser dokumenteret, at miR-214 er involveret i human ovariecancer, livmoderhalskræft og melanom tumor progression [26], [27], [28], [29]. Men den nuværende viden om miR-214-ekspression og funktion i HCC er stadig temmelig uklart. Desuden mekanismerne bag miR-199a2 /214 deregulering i HCC er endnu ikke klart.

I den foreliggende undersøgelse, viste vi, at miR-199a-3p, miR-199a-5p og miR-214-ekspression var signifikant reduceret i HCC væv. XBP-1 blev vist at være et direkte mål for MIR-214 ved interaktion med 3′-UTR. Desuden blev den undertrykkende effekt af miR-214 i HCC tumor dannelse og vækst studeret

in vitro

in vivo

, og genindførelse af XBP-1s svækkede miR-214-medieret undertrykkelse. Vi yderligere identificeret, at NFKB aktiveres af udfoldet protein respons (UPR) undertrykker miR-199a2 /214 transskription, og viste, at aktivering af UPR og endoplasmatisk reticulum (ER) stress er en vigtig mekanisme er ansvarlig for miR-214 og miR-199a-3p /5p nedregulering i HCC udvikling.

Resultater

miR-199a /214 nedreguleres i HCC-cellelinjer og væv

for at undersøge rollen af ​​miR-199a /214 klynge i HCC, blev niveauer af mIR-214 og mIR-199a-3p /5p bestemt i 23 par HCC og tilstødende godartede væv under anvendelse real-time PCR. Resultaterne viste, at disse miRNA var alle signifikant nedreguleret og miR-199a-3p miR-199a-5p miR-214 sammenlignet med tilstødende nontumorous levervæv. Nedsat MIR-214 ekspression blev observeret i 65% af HCC (15 af 23 tilfælde), og konsekvent nedregulering af både MIR-199a-3p og MIR-199a-5p også blev påvist i så meget som 73% af HCC (17 af 23 tilfælde) (figur 1A og B). Parallelt i HCC cellelinier HepG2 og SMMC-7721, miR-199a-3p /5p og miR-214-ekspression markant nedsat sammenlignet med i human normal lever (figur 1C).

(A) Box plot grafiske skærme af 23 HCC og matchede tilstødende godartede væv grupperet efter miR-199a-3p og miR-199a-5p udtryk. (B) Box plot grafiske skærme af 23 HCC og matchede tilstødende godartede væv grupperet efter miR-214 udtryk. (C) MIR-199a /b-3p og MIR-214-ekspression i human normal lever, HepG2, og SMMC-7721 HCC-cellelinier blev påvist under anvendelse realtid QRT-PCR. Kolonner, gennemsnit af tre uafhængige forsøg; barer, SD; * P. 0,05 vs kontrol

miR-214 direkte retter sig mod XBP-1 ved interaktion med 3′-UTR

Identifikation af miRNA-regulerede gen mål er et nødvendigt skridt til forstå miRNA funktioner. Selvom MIR-199a-3p og MIR-199a-5p er rapporteret at bidrage til leveren carcinogenese [5], [21], [22], rolle MIR-214 i HCC tumorigenese er ikke blevet belyst. Derfor vi næste søgt efter målet gener af miR-214 i HCC. Formodede miR-214 mål blev forudsagt ved hjælp af mål forudsigelse programmer, miRBase og Targetscan. Vi fandt, at sekvensalignment af HSA-MIR-214 med 3′-UTR af det humane XBP-1-genet identificeret en MIR-214-bindingsstedet (figur 2A). For at bekræfte at XBP-1 er et formodet mål for MIR-214, konstruerede vi to luciferase reporter vektorer med vildtype XBP-1 3’UTR og muteret XBP-1 3’UTR (den komplementære sekvens i frøet region miR- 214 bindingssted blev muteret). Når cotransficeret med MIR-214 efterligner i HepG2-celler, blev den relative luciferase aktivitet af et XBP-1 3’UTR luciferase reporter signifikant undertrykt ved -50% sammenlignet med transfektion af den negative kontrol. I modsætning hertil blev der ingen ændring i relativ luciferaseaktivitet observeret i celler transficeret med mutant reporter eller tom vektor (figur 2B). Disse resultater antyder, MIR-214 mål XBP-1 ved direkte binding 3’UTR af XBP-1.

(A) Sekvensalignment af human MIR-214 med 3′-UTR af XBP-1. Frøene sekvens af MIR-214 kampe 3′-UTR af XBP-1 for at skabe XBP-1 3′-UTR eller mutant luciferase reporter konstrukt. (B) MIR-214 inhiberer XBP-1 3′-UTR reporter, men ikke mutant reporter eller tom reporter aktivitet. HepG2-celler blev transient transficeret med angivne plasmider med MIR-kontrol, MIR-214 efterligner. Efter 36 h inkubation blev cellerne underkastet luciferase assay. Kolonner, gennemsnit af tre uafhængige forsøg; barer, SD. * P 0,05 vs MIR-con. (C) miR-214 reducerer XBP-1-ekspression i HepG2 (til venstre) og SMMC-7721 (højre) analyserede celler ved western blotting.

Vi fandt endvidere, at forbigående transfektion af HepG2 og SMMC-7721 celler med mIR-214 effektivt reduceret XBP-1 proteinniveauer detekteret ved Western blotting-analyse (figur 2C), som var uafhængig af ATF6 og IRE1 signalering (fig S1). Lignende resultater blev opnået i humane epiteliale livmoderhalskræft Hela celler (Figur S2). Disse data antyder, at MIR-214 direkte genkender 3’UTR af XBP-1 mRNA og inhiberer XBP-1 translation.

Desuden viste western blot-analyse, at XBP-1-protein-niveauet blev forøget i MIR-214- nedreguleret humane HCC væv sammenlignet med tilstødende nontumorous levervæv (Figur S3). Vores analyse viste, at XBP-1 var et potentielt mål for miR-214.

miR-214 regulerer HCC celledeling og apoptose

Tidligere undersøgelser har impliceret XBP-1 som en væsentlig overlevelse faktor for ER stress og tumorvækst [30], så vi valgte, om miR-214 udøve en modsat effekt i HCC til yderligere undersøgelse. For at bestemme virkningen af ​​miR-214 på HCC celleproliferation, HepG2 og SMMC-7721 celler, blev henholdsvis transficeret med miR-214 efterligner eller miR-kontrol og analyseret for cellevækst. CCK-8 proliferation assay viste, at cellevækst blev reduceret i MIR-214 efterligner-transficerede HCC-celler sammenlignet med MIR-kontrol-transficerede celler eller ubehandlede celler (figur 3A). Lignende resultater blev observeret ved Br-dU inkorporering assay i HepG2 og SMMC-7721 celler (figur 3B). Resultaterne af

in vitro Salg assays indikerede, at exogen MIR-214 inhiberede proliferationen af ​​hepatoma cellelinier væsentligt.

(A) Relativ celle antal HepG2 og SMMC-7721 celler efter 48 timer post-transfektion blev vurderet ved anvendelse CCK-8 assay. (B) Cell vækst i HepG2 og SMMC-7721-celler ved 48 timer efter transfektion blev vurderet ved anvendelse Br-dU inkorporering assay. (C) Efter 48 timer MIR-214 efterligner transfektion blev cellerne mærket med Annexin V og analyseret ved flowcytometri. (D) Efter 48 timer agomir-214 behandling blev SMMC-7721 celler mærket med Annexin V og analyseret ved flowcytometri * P. 0,05 vs ubehandlede (HepG2 eller SMMC-7721) eller MIR-con-behandlede

Desuden testede vi, om opreguleret miR-214 inducerer HCC celle apoptose og celledød, ved at bestemme antallet af tidlige og sene apoptotiske HepG2-celler følgende behandlinger med miR-214 efterligner ved flowcytometrisk analyse. Som forventet blev der påvist få Annexin V-positive celler i miR-kontrol-behandlede eller ubehandlede celler, hvorimod miR-214 restaurering øgede procentdelen af ​​apoptotiske celler (ca. 20% i HepG2) som bedømt af Annexin V-farvning (figur 3C) . Konsekvent blev lignende virkninger også påvist i SMMC-7721-celler behandlet med kolesterol-konjugeret 2′-O-methyl-modificeret MIR-214 efterligner (agomir-214) (figur 3D). Disse resultater tyder på en vækst-hæmmende rolle miR-214 i HCC.

miR-214 regulerer HCC tumor dannelse og vækst in vitro og in vivo

De ovennævnte resultater fik os til at udforske den biologiske betydningen af ​​miR-214 i HCC tumorgenese in vivo. Som et første skridt blev kapaciteten af ​​kolonidannelse evalueret på SMMC-7721 celler transficeret med agomir-214 og agomir negative kontrol (agomir-NC). Resultaterne viste, at agomir-214-behandlede celler udviste meget færre og mindre kolonier sammenlignet med agomir-NC behandlede celler (figur 4A), som var i overensstemmelse med celleproliferationsassay. Endvidere agomir-NC og agomir-214-behandlede SMMC-7721-celler blev injiceret s.c. til enten bageste flanke af de samme nøgne mus, henholdsvis. Efter 4 uger blev størrelsen af ​​tumorknuder undersøgt. Vi fandt, at tumor størrelser og tumorvægt ved slutningen af ​​observation var betydeligt reducerede i agomir-214 behandlingsgruppen sammenlignet med den i agomir-NC behandlingsgruppe (figur 4B). Lignende resultater blev også fundet i HepG2-celle xenotransplantater trandfected med MIR-214 efterligner in vivo (figur S4 og S5) .Disse resultater antyder, at MIR-214 kan fungere som en formodet tumorsuppressor i HCC-celler.

(A ) XBP-1 genindført vendt undertrykkelsen af ​​kolonidannelse induceret af agomir-214 behandling i SMCC-7721 celler. (B) XBP-1 genindført vendt undertrykkelsen af ​​tumordannelse induceret af agomir-214 behandling i nøgen mus SMCC-7721 celler xenograftmodel. Tumorvægt 4 uger efter inokulation blev målt. (C) XBP-1 genindført vendt undertrykkelse af celler proliferation fremkaldt af agomir-214 behandling i SMCC-7721 celler. Resultaterne var reproducerbare i tre uafhængige forsøg. * P 0,05 vs agomir-NC-behandlet; # P 0,05 vs agomir-214 eller agomir-214 + vektor-behandlet

For yderligere at verificere en potent rolle for miR-214 /XBP-1-vejen i mediering af tumorceller overlevelse og i regulering. HCC tumorvækst, vi re-udtrykte XBP-1 i mIR-214 behandlede HCC-celler. Resultaterne viste, at gendannet XBP-1-ekspression ved transfektion pCMV-XL5-XBP-1s svækkede agomir-214 medieret XBP-1 suppression og tumor suppressor effekter

in vitro

in vivo

(figur S6 og 4A-C).

udfoldet protein reaktion nedregulerer mIR-199a /214-ekspression i HCC-celler Salg

Som mIR-214 mål XBP-1 og XBP-1 er en vigtig effektor af UPR og eR stress [31], [32], vi yderligere undersøgt, om der kan være en sammenhæng mellem miR-214 ned-udtryk og aktiveringen af ​​UPR i HCC i hepatomaceller. For at validere virkningen af ​​UPR på MIR-214 ekspression i HCC-celler, to klassiske UPR inducer thapsigargin (TG) og tunicamycin (TM) blev anvendt til at inducere aktivering af UPR i HepG2-celler. Inkubation af HepG2 celler med TG (5 pmol /l) og TM (5 ug /ml) markant forhøjet den GRP94 og XBP1 splejsning proteinniveau, hvilket indikerer UPR aktivering. De realtid RT-PCR-resultater viste, at MIR-214-ekspression var betydeligt nedreguleret i HepG2 celler efter TG og TM behandling i 24 timer (figur 5A). Som MIR-199a-3p, MIR-199a-5p og MIR-214 sekvenser var en klynge, vi fandt også, at niveauerne af MIR-199a-3p og MIR-199a-5p blev reduceret sammenlignet med et køretøj gruppe (figur 5A). Derudover har vi yderligere testet effekten af ​​hypoxi-induceret UPR på niveauet af miR-199a /214 udtryk. Ekspressionsniveauerne af MIR-199a og MIR-214 var også lavere i HCC celler udsat for anoxia induceret af CoCl

2 (100 pmol /L) (figur 5B). Således MIR-199a og MIR-214 ekspressionsniveauer er nedreguleres af UPR under forskellige fysiologiske og patologiske tilstande.

(A) HepG2-celler behandlet med thapsigargin (TG, 5 pmol /L) og tunicamycin (TM , 5 ug /ml) i 24 timer blev analyseret ved Western blotting for GRP94 og XBP1 ekspressionsniveauer og analyseret ved real-time RT-PCR for mIR-199a-3p /-5p og mIR-214-ekspression. (B) HepG2 celler behandlet med CoCl

2 (100 uM) i 24 timer blev analyseret ved Western blotting for Grp94 og XBP1 ekspressionsniveauer og analyseret ved real-time RT-PCR for MIR-199a-3p /-5p og miR -214 ekspression. Kolonner, gennemsnit af tre uafhængige forsøg; barer, SD; * P. 0,05 vs ubehandlet (HepG2) eller DMSO-behandlet

NFKB er en potentiel negativ regulator af miR-199a-2 /miR-214 gen

Som det fremgår af Figur S7, miR-199a2 og miR-214 blev reguleret som en klynge fra PRI-miR-199a2 inden for de menneskelige Dnm3os gener; vi næste undersøgt MIR-199a2 promotorregion for transkriptionsfaktorbindingssites, og identificeret 3 potentielle formodede NFKB-bindingssteder i en 1,2-kb DNA-fragment opstrøms for præ-MIR-199a2 (fig S8). Så vi testede, om NFKB er involveret i reguleringen af ​​miR-199a2 /214 udtryk. Som vist i figur 6A, lipopolysaccharid (LPS) (10 ug /ml), en kendt inducer af NFKB-aktivitet, induceret NFKB-aktivering og inhiberede MIR-199a2 /214-ekspression i SMMC-7721 celler. I modsætning hertil transfektion af siRNA rettet mod menneskelige p65 reduceret NFKB udtryk og øget miR-199a2 /214 niveau SMMC-7721 celler (figur 6B). Disse data viste, at NFKB er en potentiel negativ regulator af miR-199a-2 /miR-214 klynge.

(A) LPS (10 ug /ml) behandling induceret NFkB p65 udtryk, dæmper miR-199a /214-ekspression i SMMC-7721 celler. (B) siRNA specifikt rettet human NF-kB P65 underenhed (100 nM) dereased NFkB p65 expresssion og forøget ekspression af miR-199a /214 i SMMC-7721 celler. (C) NF-KB aktiveres af ER Stress og hypoxi i HepG2-celler analyseret ved Western blotting. (D, E) miR-199a /214 udtryk i HepG2 celler behandlet med ER stress inducer (5 mmol /l TG og 100 uM CoC

2) og NFKB-hæmmere PDTC (100 uM). * P 0,05 vs ubehandlede (HepG2 eller SMMC-7721) eller DMSO eller siRNA con-behandlede; # P. 0,05 vs TG eller CoCl

2 behandling

Yderligere fandt vi, at udsættelse for TG-induceret NFKB aktivering i HepG2-celler (figur 6C), og undertrykte miR-199a2 /214 udtryk ( Figur 5A). I overensstemmelse med disse resultater, den potente NFKB hæmmer pyrrolidindithiocarbamatopløsning (PDTC) (100 uM) betydeligt vendt undertrykkende effekt af UPR på miR-199a2 /214 udtryk (figur 6D), fremhæver betydningen af ​​UPR /NFKB vej i miR-199a2 /214 udtryk.

desuden vi også undersøgt, om NFKB er i stand til at regulere miR-199a /214 udtryk ved iltmangel. Resultaterne viste, at 100 pmol /L CoC

2 behandling inducerede også NFKB og faldt MIR-199a2 /214 niveauer i HepG2-celler samtidigt, og inhibering af NFKB svækket reduktionen af ​​MIR-199a2 /214 niveauer observeret efter anoxisk behandling (figur 6C og E). foreslog således disse data, at UPR formidlede den negative regulering af miR-199a2 /214 selvom aktivering NFKB at deltage i HCC progression.

Diskussion

miRNA er negative regulatorer af genekspression og kan fungere som tumorsuppressorer eller onkogener [33]. Nogle særlige miRNA blev rapporteret at være differentielt udtrykt i forskellige cancer, såsom MIR-199a /214 klynge. Øget niveau af miR-214 blev fundet i ovariecancer [28], mavekræft [34] og melanom [26], overtalelse kemoterapi modstand eller tumormetastaser. Men i livmoderhalskræft [27], [29] og brystkræft [35], blev MIR-214-ekspression reduceres, hvilket antyder en tumorsuppressorgen-lignende funktion. Den mulige forklaring var, at de enkelte miRNA målrettet mod flere mål i forskellige celler. Adskillige miR-214 mål er kendetegnet ved forskellige tumortyper (kræft i æggestokkene, livmoderhalskræft og melanom), herunder MEK3, JNK1 [29], PTEN [28], [36], plexin-B1 [27], EZH2 [35], [37], og TFAP2C [26] og så videre. I vores undersøgelse har vi yderligere identificeret XBP-1 som et nyt mål for miR-214 ved at binde sin 3′-UTR i HCC celler. Endvidere fandt vi, at udtrykkene for EZH2 og plexin-B1 ikke var negativt korreleret med MIR-214 i MIR-214-nedreguleret HCC tumorprøver (data ikke vist). Baseret på disse observationer, antog vi, at XBP-1, men ikke EZH2 og plexin-B1, er det “primære” mål for miR214 i HCC, afhængigt af de forskellige cellulære kontekst.

Som vi ved, XBP- 1, en større transkriptionel regulator af det udfoldede protein reaktion, regulerer en delmængde af eR resident chaperone gener i udfoldet protein reaktion at beskytte cancerceller fra en utilstrækkelig miljø, såsom hypoksi eller glucose deprivation [31], som er almindeligt forekommende ved mest solide tumorer, herunder HCC. Klonogen overlevelse af XBP-1-deficiente tumorceller blev signifikant reduceret under alvorlig hypoxi /anoxi in vitro og XBP-1-knockout tumorceller var ude af stand til at vokse som tumorer in vivo [30], hvilket antyder, at XBP-1 er afgørende for overlevelse tumor celle under hypoxiske betingelser og solid tumordannelse og vækst. Tidligere undersøgelser viste, at forøgelsen af ​​splejsning af XBP-1 mRNA, hvilket resulterer i aktiveringen af ​​XBP-1product, samt Grp78 og ATF6, forekom i HCC væv med øget histologisk klassificering [38]. Ligeledes fandt vi, at XBP-1-protein-niveauet blev forøget i MIR-214-downexpressed humane HCC væv. Samlet set viser disse undersøgelser, at nedreguleres MIR-214 i HCC cancer inducerer overekspression af XBP-1, som igen accelererer tumorigenese. Interessant nok blev lignende resultat af miR-214-medieret XBP-1 repression også nået i Hela celler. Det er i overensstemmelse med de seneste rapporter om, at miR-214 er nedreguleret i human livmoderhalskræft og negativt regulerer Hela celledeling [27], [29]. Det vil være interessant nu at bestemme, om overekspression af miR-214 eller modulation af sin målretning kunne give en ny behandlingsmetode for miR-214-mangelfuld tumor, såsom HCC, livmoderhalskræft og brystkræft.

i den anden hånd, vores undersøgelse viste, at en signifikant nedregulering af mIR-199a /214 klynge blev observeret i humane HCC væv og HCC-cellelinier sammenlignet med normal lever, i overensstemmelse med tidligere observationer fra profilering af miRNA ekspression i HCC [ ,,,0],9], [39], [40], [41], [42]. Men hvad er den mekanisme af miR-199a /214 klynge ned-udtryk i HCC? Voksende beviser har afsløret, at under ER stress, UPR betegner en adaptiv mekanisme, som understøtter overlevelsen og kemoresistens af tumorceller, og har også været på vej som et middel til tumorceller for at øge overlevelsen under betingelser med metabolisk stress, hypoxi, og måske endda kemoterapi [43]. Yderligere er aktivering af MEK /ERK og mTOR blevet rapporteret at spille en kritisk rolle i regulering celleoverlevelse eller celledød signalering induceret af ER stress [44], [45], [46]. Som UPR transkriptionsfaktor XBP-1 blev identificeret som et mål for miR-214 og de seneste undersøgelser har afsløret de vigtige funktioner af miR-199a /b-3p i HCC carcinogenese og progression ved at målrette mTOR og c-Met eller PAK4 /Raf /MEK /ERK Pathway i HCC celler [5], [21], besluttede vi for yderligere at undersøge sammenhængen mellem UPR aktivering og miR-199a /214 ned-udtryk. Resultat viser, at miR-214 og miR-199a-3p /5p var signifikant nedreguleret i HepG2 celler efter TG og TM behandlinger eller iltmangel, hvilket yderligere antyder, at UPR aktiveret XBP-1 eller mTOR og ERK vej til at beskytte tumorcelleoverlevelse selvom undertrykkelse af miR-199a2 /214 klynge i HCC.

for at starte optrevling de regulatoriske mekanismer i miR-199a2 /214 udtryk under UPR forhold nærmere, vi yderligere fundet, at UPR aktiveret NFKB med samtidig undertrykkelse af miR- 199a2 /214 transskription, og denne undertrykkelse blev vendt ved NFKB inhibitor PDTC i HepG2-celler, som foreslog, at NFKB er en potentiel negativ regulator af miR-199a-2 /miR-214 klynge. NFKB er en vigtig transkriptionsfaktor, der er opstået som en nøgle modulator af ændrede gen programmer og malign fænotype i udviklingen af ​​cancere [47]. Tidlige undersøgelser indikerede, at mange cancere, såsom brystcancer, lungecancer og lymfom, og HCC, konstitutivt udtrykker høje niveauer af NFKB [48], [49]. Derudover hypoxi i HCC-celler og væv induceret NFKB overekspression og /eller konstitutiv aktivering [50], [51]. Der var en regulerende Sp1 /NFkB /HDAC /MIR-29b netværk til at kontrollere onkogen ekspression i akut myeloid leukæmi (AML) [52]. I vores undersøgelse viste vi, at NFKB og XBP-1 overvejende blev udtrykt, men MIR-214 blev reduceret betydeligt i humane HCC væv, MIR-214 direkte målrettet mod XBP-1, og UPR eller hypoxi-induceret NFKB-aktivering negativt styrer MIR-199a /214 klynge transskription i HCC-celler. Derfor er en ny UPR /NFKB /MIR-214 /XBP-1 regulatorisk kredsløb blev foreslået i HCC progression, hvori NFKB blev aktiveret ved UPR og deltog i den negative regulering af MIR-199a /214 at regulere HCC progression (Figur 7) . Denne reguleringsmekanisme dels forklares hvorfor PDTC behandling hæmmede NFKB aktivering forfremmet HCC celler apoptose og undertrykte tumorvækst [53], mens LPS behandling induceret NFKB aktivering og fremmet tumorcelleproliferation og metastatisk vækst [54], [55], [56], [57]. Bestemt, er der behov for flere beviser på NFKB-binder site i promoteren af ​​miR-199a /214 klynge i fremtiden til at understøtte denne hypotese og flere undersøgelser er nødvendige for at belyse, om ER stress aktiverer også andre faktorer (egSp1) sammen involveret i nedregulering af miR-199a /214 i HCC. Ikke desto mindre, yderligere forståelse af den molekylære mekanisme og netværk, hvormed miR-199a /214 klynge funktioner kan give nye muligheder for forskning, der kan støtte tidlig diagnosticering og behandling af denne meget ondartet svulst.

MIR-214 /XBP-1-vejen blev vist i dette arbejde, mens miR-199a-3p /mTOR og miR-199a-5p /DDR1 veje blev rapporteret af andre undersøgelser.

sammenfattende vores resultater viste, at eR stress undertrykker ekspressionen af ​​mIR-199a /214 klynge ved at aktivere NFKB at opregulere pro-overlevelse XBP-1-ekspression, der foreslog en hidtil ukendt UPR /NFKB /mIR-214 /XBP-1 regulatorisk kredsløb, hvis dysfunktion kan bidrage til tumor overlevelse og progression af HCC. Vores undersøgelse giver ny indsigt i tumorsuppressoraktivitet tillagt ved miR-199a /214, og de potentielle mekanismer hepatocarcinogenese.

Materialer og metoder

Materialer og reagenser

Materialer var opnået fra follow leverandører: antistoffer mod XBP-1, ATF6, NFkB, GAPDH og β-actin var fra Santa Cruz bioteknologi Inc. (Santa Cruz, CA); antibodie mod GRP94 fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA); antistof aganist p-IRE1 var fra Thermo Scientific Pierce Antistoffer (Rockford, IL); celletælling kit-8 blev opnået fra Beyotime Institute of Biotechnology (Nantong, Kina); Br-dU celleproliferation ELISA-kit blev opnået fra Roche (Penzberg, Tyskland); pCMV6-XL5-XBP-1s plasmid blev indkøbt fra Origene (Rockville, MD); miRNA negativ kontrol (MIR-con og anti-MIR-con), MIR-214 efterligner og anti-MIR-214, agomir-214 og agomir-NC, antagomir-214 og antagomir-NC, siRNA rettet mod human NFKB /p65 blev opnået fra RiboBio (Guangzhou, Kina); Alle andre kemikalier og reagenser blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich China Inc., Shanghai, Kina), medmindre andet er angivet.

Menneskelige tumorprøver

I alt 23 snap-frosne normal og maligne levervæv (14 mænd og 9 kvinder; median alder, 65,0 y, rækkevidde, 50-78 y) blev indsamlet ved Tongji hospital (Wuhan, Hubei Kina). Humane normale levervæv blev opnået fra distal normalt levervæv af liver hæmangiom patienter. Denne undersøgelse blev godkendt af Klagenævnet for Tongji Hospital og Tongji Medical College. De emner rekrutteret til undersøgelsen forudsat skriftligt informeret samtykke. Undersøgelsen overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Vævsprøver blev opnået og opbevares nedfrosset i flydende nitrogen og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

Cellekultur

Menneskelig hepatom HepG2 og humane cervikale cancercellelinie Hela blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), og human hepatoma cellelinje SMMC-7721 var fra Udvalget om Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og vedligeholdes som anbefalet af kilden. Celler blev dyrket i DMEM, justeret til at indeholde 4 mM L-glutamin, 1,5 g /l natriumbicarbonat, 4,5 g /l glucose, 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin, og 65units /ml streptomycin. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2.

Cell transfektion og behandlinger

HepG2 og SMMC-7721-celler blev transficeret med miRNA /siRNA negativ kontrol (mIR-con og Sir-con), mIR-214 efterligner eller siRNA targeting human NFKB /p65 (RiboBio, Guangzhou, Kina) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved at følge fabrikantens protokol. SiRNA sekvenser for human NFKB /p65 var: 5′- GCC CUA UCC CUU UAC GUC A-3 ‘[58]. SMMC-7721 celler blev behandlet med 100 nM agomir-214 og agomir-NC, antagomir-214 og antagomir-NC og blev opsamlet 24 timer efter behandling for xenotransplantation i nøgne mus modle og Br-dU inkorporering assay. HepG2-celler blev behandlet med 5 ug /ml thapsigargin og 5 pmol /L tunicamycin og opsamlet 24 timer efter behandling for western blotting (WB) analyser og RNA-ekstraktion. Hypoxiske betingelser blev oprettet ved hjælp af 100 uM CoCl

2 i 24 timer før celle samling.

Western blot-analyse

Proteiner fra cellelysater (20 ug) blev adskilt med 10% SDS -polyacrylamid-gelelektroforese og overført til en polyvinylidendifluoridmembran. Efter blokering i 5% fedtfri mælk, blev protein-blots inkuberet med et specifikt antistof efterfulgt af inkubation med et peroxidase-konjugeret sekundært antistof i blokerende buffer.