PLoS ONE: Astaxanthin Hæmmer JAK /STAT-3 Signaling at ophæve Cell Proliferation, Invasion og angiogenese i en Hamster Model af Oral Cancer

Abstrakt

Identifikation midler, der hæmmer STAT-3, en cytosolisk transskriptionsfaktor involveret i aktivering af forskellige gener impliceret i tumorprogression er en lovende strategi for cancer kemoforebyggelse. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​diætastaxanthin på JAK-2 /STAT-3 signaleringen i 7,12-dimethylbenz [a] anthracen (DMBA) -induceret hamster kindpose (HBP) carcinogenese model ved at undersøge mRNA og proteinekspression af JAK /STAT-3 og dets målgener. Kvantitativ RT-PCR, immunoblotting og immunhistokemiske analyser viste, at astaxanthin tilskud hæmmer vigtige begivenheder i JAK /STAT signalering især STAT-3 phosphorylering og efterfølgende nukleare translokation af STAT-3. Endvidere astaxanthin nedreguleret ekspression af STAT-3 målgener involveret i celleproliferation, invasion og angiogenese, og reduceret mikrovaskulær densitet, hvilket forhindrer tumor progression. Molekylær docking analyse bekræftede hæmmende effekter af astaxanthin på STAT signalering og angiogenese. Celledyrkningsforsøg med endotel cellelinie ECV304 dokumenteret rolle astaxanthin i at undertrykke angiogenese. Tilsammen vores data giver tyder på, at kosten astaxanthin forhindrer udviklingen og progressionen af ​​HBP karcinomer gennem hæmning af JAK-2 /STAT-3 signalering og dens downstream begivenheder. Således astaxanthin, der fungerer som en potent hæmmer af tumor udvikling og progression ved at målrette JAK /STAT signalering kan være en ideel kandidat til kræft chemoforebyggelse

Henvisning:. Kowshik J, Baba AB, Giri H, Deepak Reddy G, Dixit M, Nagini S (2014) Astaxanthin Hæmmer JAK /STAT-3 Signaling at ophæve Cell Proliferation, invasion og angiogenese i en Hamster Model af Oral Cancer. PLoS ONE 9 (10): e109114. doi: 10,1371 /journal.pone.0109114

Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 17, 2014, Accepteret: 8. september 2014; Udgivet: 8 oktober 2014

Copyright: © 2014 Kowshik et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Institut for Bioteknologi, New Delhi, Indien under 7. rammeprogram for Indo-EU Joint Collaborative projektet “FUNCFOOD«. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) protein er et latent cytoplasmatisk transkriptionsfaktor, som sender signaler fra celleoverfladen til kernen når det aktiveres af cytokiner og vækstfaktorer [1]. Især interleukin-6 (IL-6) eller epidermal vækstfaktor (EGF) stimulere phosphorylering af STAT3-protein af Janus kinase og aktiveret STAT3 danner en homodimer, der translokerer til kernen, hvor det regulerer ekspressionen af ​​gener kritisk for normale cellulære processer såsom celleudvikling, differentiering, proliferation, overlevelse, angiogenese, og immunfunktion [2] – [6].

Aberrant aktivering af JAK /STAT3 signalering er blevet dokumenteret i en lang række humane tumorer, herunder hæmatopoietiske maligniteter og faste tumorer, såsom hoved og hals, bryst og prostatakræft [7], [8]. Konstitutiv STAT3-aktivering bidrager til proliferation og onkogenese ved modulering af ekspressionen af ​​forskellige gener, der er nødvendige for tumorcelleoverlevelse, proliferation og angiogenese, samt invasion og metastase og almindeligt antyder dårlig prognose [9] – [11]. , JAK /STAT3 signalering spiller således en central rolle i tumorigenese og betragtes som en vigtig terapeutisk mål for nye lægemiddeludvikling.

Identifikation af stoffer, der er målrettet STAT3 molekyle sandsynligvis have betydning i kræft kemoforebyggelse. Adskillige kosten antioxidanter indregnes at blokere tumor udvikling ved at målrette STAT3 signalering netværk [12] – [15]. Astaxanthin, et ikke-provitamin A carotenoid overvejende i mikroalger, svampe, planter, saltvandsprodukter og nogle fugle som flamingoer og vagtler er en potent antioxidant [16]. Astaxanthin viste sig at udvise den højeste antioxidant aktivitet blandt carotenoider og er meget udbredt i forebyggelse og behandling af forskellige sygdomme [17]. AXT er også blevet vist at udvise anti-inflammatoriske og anticancer egenskaber [18], [19].

For nylig har vi demonstreret, at kosttilskud af AXT inducerer iboende apoptose ved at inhibere PI3 /Akt, MAPK, NF-KB og Wnt /β-catenin signalering kredsløb i 7,12-dimethylbenz [a] anthracen (DMBA) -induceret hamster kindpose (HBP) carcinogenese model [20]. Disse fund fristet os til hypotesen, at AXT der inducerer apoptose kan blokere den modstående proces af celleproliferation og derved forhindre den sekventielle akkumulering af mutationer der til sidst fører til tumorinvasion og angiogenese. Endvidere AXT-induceret inaktivering af transkriptionsfaktorer NF-KB og β-catenin, centrale knudepunkter i onkogen signalering kunne også påvirke JAK /STAT3 pathway. I nærværende undersøgelse demonstrerer vi, at kosten AXT hæmmer tumor progression baseret på ophævelse af JAK /STAT3 vej og dens downstream mål cyklin D1, MMP-2, -9, og VEGF i den HBP carcinogenese model. Desuden AXT faldt mikrovaskulære tæthed, som spiller en væsentlig rolle i tumor udvikling og progression. Cellekultur eksperimenter med endotel cellelinje ECV304 blev også udført for at underbygge rolle astaxanthin i at undertrykke hypoxi-induceret angiogenese.

Materialer og metoder

Kemikalier

Akrylamid, kvæg serumalbumin (BSA), bromphenolblåt, 7,12-dimethylbenz [a] anthracen (DMBA), hydroxyurinstof, 2-mercaptoethanol, natriumdodecylsulfat (SDS) N, N, N ‘, N’ – tetramethylendiamin (TEMED) og Trizol blev indkøbt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA. Astaxanthin blev indkøbt fra Bio-Real, Sverige. DMEM-F12-medium, antibiotisk opløsning bestående af penicillin og streptomycin og Alamar blue var fra HiMedia Labs, Mumbai, Indien. Kalvefosterserum af sydamerikanske oprindelse var fra GIBCO, Invitrogen, NY, USA. Power SYBR Green PCR Master Mix blev opnået fra Applied Biosystems, Californien, USA. Antistoffer for IL-6, GAPDH, cyklin D1, PCNA, p21, MMP-2, MMP-9, TIMP-2, RECK, VEGF, VEGFR2, HIF1α, blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, USA. pJAK-2

tyr1007 /1008, JAK-2, pstat-3

tyr705, STAT-3 og histon (H2B) antistoffer og BrdU, STAT-3

tyr705, total cyklin D1 og pVEGFR2

tyr1175 ELISA-kits var fra Cell Signaling Technology, USA. CD-34-antistof blev indkøbt fra Novocastra, Tyskland. Matrigel var fra BD Biosciences, USA. Alle andre reagenser var af analytisk kvalitet.

Dyr og etik redegørelse

Otte til ti uger gamle mandlige syriske hamstre en vægt på 100-110 g blev anvendt i denne undersøgelse. Dyr blev opnået fra Central Animal House, Annamalai University, Indien. Dyrene blev huset fire til et bur og forsynet med standard pellet diæt og vand ad libitum. Den dyresundhed blev overvåget dagligt i løbet af undersøgelsen. Protokollerne for dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal etiske komité, Annamalai Universitet og udført i overensstemmelse med de betingelser, som udvalget til brug ved kontrol og tilsyn på Eksperimenter retningslinjer for dyr (CPCSEA).

Behandling tidsplan

dyrene blev randomiseret i forsøgs- og kontrolgrupper og inddelt i 4 grupper på 5 dyr hver. I gruppe 1 blev de rigtige bukkale poser af hamstere malet med 0,5% DMBA i flydende paraffin tre gange om ugen i 14 uger [21]. Gruppe 2 dyr modtog foruden DMBA, en basal diæt indeholdende 15 mg /kg legemsvægt af astaxanthin [20], [22]. Gruppe 3 dyr modtog astaxanthin (15 mg /kg legemsvægt) alene i 14 uger. Gruppe 4 dyr modtog basal diæt alene og tjente som ubehandlet kontrol. Eksperimentet blev afsluttet på 14 uger, og alle dyr blev aflivet ved cervikal dislokation efter en nats faste. Kindposen væv blev straks opdelt og behandlet til distribution til hvert eksperiment.

Cellekultur

ECV 304-cellelinie blev anvendt og dyrket i DMEM basalt medium med 10% føtalt bovint serum med antibiotika. ECV304 er en endotelcelle cellelinie afledt fra humane navlevene-endotelceller (HUVEC’er) gennem spontan transformation [23]. Sammenlignet med primære HUVEC kulturer, brug af ECV304 celler har en praktisk fordel, da disse celler udviser forbedret og reproducerbar kapacitet til in vitro angiogenese er således et ideelt valg for cellekultur baseret angiogenese analyser [24]. Konfluente kulturer af ECV304-celler blev videredyrket og opretholdt i CO

2 inkubator ved 37 ° C. For matrigel assay blev cellerne opretholdt i DMEM basalt medium med 4% føtalt bovint serum. For hypoxisk tilstand, blev celler inkuberet i hypoxi kammer med 1% O

2.

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time RT-PCR

Totalt RNA fra kindposen væv blev ekstraheret hjælp Trizol-reagens som beskrevet tidligere [25]. RNA-koncentrationen blev bestemt ud fra den optiske tæthed ved en bølgelængde på 260 nm (under anvendelse af en OD260 enhed svarende til 40 ug /ml RNA). 5 ug af isolerede totalt RNA blev revers-transkriberet til cDNA i en reaktionsblanding indeholdende 4 pi 5 x reaktionspuffer, 2 pi dNTP-blanding (10 mM), 20 enheder RNase-inhibitor, 200 enheder af fugle-myeloblastosevirus (AMV ) revers transkriptase og 0,5 ug oligo (dT) primer (Promega, WI, USA) i et totalt volumen på 20 pi. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 42 ° C i 60 minutter, og reaktionen afsluttes ved opvarmning ved 70 ° C i 10 min. CDNA’et blev opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Kvantitativ RT-PCR blev udført under anvendelse Power SYBR Green masterblanding ifølge producentens instruktioner ved anvendelse en StepOne Plus thermocycler (Applied Biosystems). Til 1 × PCR Master Mix, blev 2,5 pi af hver cDNA tilsat i en 20 pi slutvolumen. PCR-betingelserne var som følger: 95 ° C i 5 minutter, 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 s ved 52 til 60 ° C (baseret på målet) og 60 sekunder ved 72 ° C. Relative kvantitative fold ændring i forhold til kontrollen blev beregnet under anvendelse af komparativ Ct-metoden, hvor Ct er cyklussen telefonnummer, hvor fluorescens først overstiger tærsklen. Ct-værdier fra hver prøve blev opnået ved at subtrahere værdierne for GAPDH Ct fra målgenet Ct-værdi. Specificiteten af ​​resulterende PCR-produkter blev bekræftet ved smeltekurver.

Western blotting

Proteiner blev ekstraheret fra vævsprøven hjælp lysis buffer indeholdende 62,5 mM Tris (pH 6,8), 10% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol og bromphenolblåt. Nuklear og cytoplasmatiske fraktioner blev adskilt som beskrevet af Legrand-Poels et al. [26]. Lige så stor mængde proteinekstrakter blev påsat SDS-PAGE og de opløste proteiner blev overført til polyvinylidendifluorid-membraner. Blottene blev derefter inkuberet i 2 timer i 1 x PBS indeholdende 5% fedtfri tørmælk. Membranerne blev derefter probet med primære og sekundære antistoffer ifølge producentens anvisninger. Proteinerne blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens påvisningsreagenser (Sigma). Densitometri blev udført på IISP flatbedscanner og kvantificeres med Total Lab 1.11 software.

ELISA

Niveauerne af pstat

tyr705, total cyklin D1 og pVEGFR2

tyr1175 blev bestemt ved hjælp af sandwich-ELISA-kit (Cell Signaling Technology, USA) ifølge producentens instruktioner.

Immunhistokemi

Paraffin vævssnit blev deparaffinised, rehydreret og underkastet antigen-genvinding og endogen peroxidase blokering. Derefter blev snittene inkuberet med pstat-3 kanin monoklonale, PCNA, MMP-2 og VEGF kanin polyklonale antistoffer ved stuetemperatur i 3 timer. Objektglassene blev vasket med TBS og derefter inkuberet med biotin-mærket sekundært antistof efterfulgt af streptavidin-biotin-peroxidase (Dako, Carprinteria, CA, USA) i 30 minutter hver ved stuetemperatur. Immunpræcipitatet blev visualiseret ved behandling med 3,3′-diaminobenzidin og kontrastfarvning med hematoxylin. Vævene blev derefter fotograferet ved hjælp af en Inverted Fluorescent mikroskop (Leica Microsystem Vertrieb GmbH, Wetzler, Tyskland) fastgjort med digital kamera DFC295.

mikrovaskulære densitet (MVD)

mikrovaskulære tæthed blev vurderet ved immunhistokemisk farvning med anti-CD34 antistof. Områderne med størst neovaskularisering var placeret og billederne fanget i mindst fem forskellige områder. Mikrokar blev talt af to uafhængige efterforskere og data repræsenteret som antal fartøjer /synsfelt.

Molekylær docking

Molekylær docking blev gjort ved hjælp Schrödinger suite 2013. Astaxanthin blev hentet fra pubchem (www .ncbi.nlm.nih.gov /pccompound) og proteiner STAT-3 og VEGF blev hentet fra proteinet databank med FBF ID: 3CWG og 3V2A hhv. Receptor gitter generering og ligand docking blev udført ved anvendelse Glide Xp docking algoritme.

Alamar blue assay

Cellelevedygtighed blev målt ved Alamar Blue-assayet [27]. Kort fortalt blev Alamar blue (Resazurin natriumsaltet fra Himedia) opløst i phosphatbufret saltvand, pH 7,4 for at gøre en bestand på 5 mg /ml og en endelig bearbejdning koncentration på 0,1 mg /ml i celledyrkningsmedium. Resazurin er en redoxindikator, som måler reducerende miljø af cellen ved at reducere til en yderst fluorescerende resorufin. Astaxanthin ved forskellige koncentrationer (5, 10, 20, 50, 100, 200 og 400 uM) blev tilsat til cellerne, og efter 24 timer blev Alamar blåt farvestof tilsat, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Farveændringen blev overvåget kolorimetrisk ved 595 nm og 570 nm til at vurdere oxideret versus reducerede former henholdsvis af reagenset ved hjælp af multi-mode pladelæser.

BrdU assay

Cell proliferation blev analyseret ved at måle DNA-syntese med bromdeoxyuridin (BrdU) enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) kit (Cell Signaling Technology, USA), ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, 1 x 10

4-celler blev podet i en 96-brønds mikroplade og dyrket med eller uden astaxanthin (50 uM) i 24 timer. Cellerne blev derefter mærket med BrdU i 6 timer. Efter fiksering blev cellerne inkuberet med 100 pi anti-BrdU-antistof i 60 min. Efter vask blev 100 pi sekundært antistof tilsat og inkuberet i 30 minutter, derefter 100 pi substrat (tetramethylbenzidin) tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 min. Absorbansen ved 450 nm blev målt med en ELISA-læser.

Migration assay

Sammenflydende monolag af ECV 304 celler i 24-brønds plader blev ridset med en 200 pi pipettespids og inkuberet i normoxiske og hypoxiske tilstand med og uden 50 uM astaxanthin. 5 mM hydroxyurinstof blev også tilsat for at inhibere celleproliferation. Celler blev fotograferet under et mikroskop ved en forstørrelse på 4x på 0 og 24 timer [28].

Matrigel rørdannelse assay

forafkølet plader med 96 brønde blev overtrukket med 80 pi matrigel ( BD) og inkuberet ved 37 ° C i en halv time. Lige stort antal celler (20.000 /brønd) blev tilsat i hver brønd med og uden hypoksisk tilstand og i nærvær og fravær af astaxanthin (50 uM) og inkuberet i CO

2 inkubator ved 37 ° C i 14 timer. Billeder blev fanget i minimum fem forskellige felter og data repræsenteret endelig som antal rør /synsfelt [29].

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en ikke-parametrisk Mann-Whitney test (Stats Direct, Det Forenede Kongerige) for

in vivo

og Tukey posthoc test for

in vitro

eksperimenter. En sandsynlighed på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Tumor forekomst

tumorincidensen er blevet rapporteret i en tidligere undersøgelse [20]. Ved afslutningen af ​​forsøgsperioden var tumorincidensen 100% med en gennemsnitlig tumorbyrde af 82,25 mm

3 i hamstere malet med DMBA (gruppe 1). Kosttilskud af astaxanthin (15 mg /kg legemsvægt) til DMBA malede hamstere inducerede ikke nogen grove tumorer i bukkale pose og histologisk undersøgelse afslørede kun mild hyperplasi. I hamstere fodret astaxanthin alene og i kontrolgrupperne, epitel var normal, intakt, og kontinuerlig.

astaxanthin hæmmer JAK /STAT signalering ved at indskrænke phosphorylering af STAT-3

Som STAT 3 er konstitutivt aktiveret i en bred vifte af maligniteter, vi først analyseret mRNA ekspression af JAK-2 og STAT-3 ved kvantitativ RT-PCR-analyse. Vores resultater viste, at kosttilskud af astaxanthin signifikant reducerede mRNA-ekspression af nøglemolekyler involveret i JAK /STAT signalering sammenlignet med DMBA-malede dyr (figur 1A). Ingen signifikante forskelle blev observeret i dyr behandlet med astaxanthin alene i forhold til kontrol. Yderligere at undersøge den mekanisme, hvorved astaxanthin regulerer JAK /STAT signalering, vi næste bestemmes protein ekspression af IL-6, JAK-2, pJAK-2, STAT-3 og pstat-3 ved Western blotting. Vi fandt, at topisk påføring af DMBA signifikant øget udtrykkene for disse gener sammenlignet med kontrol. Samtidig kosten administration af astaxanthin inhiberede JAK /STAT signalering ved at sænke niveauerne af IL-6, JAK /STAT phosphorylerede former og efterfølgende translokation til kernen (figur 1B 1C). Dette blev yderligere bekræftet af nedsat niveau af pstat

tyr705 (ELISA) i AXT behandlede gruppe (figur 1D). Immunohistokemisk farvning bekræftede også, at astaxanthin tilskud medførte signifikant fald i ekspressionen af ​​pstat-3 sammenlignet med DMBA-malede dyr (figur 1E)

(gennemsnit ± SD, n = 3).. A. Transcript ekspressionsniveauet af JAK-2 og STAT-3 i forskellige forsøgsgrupper som bestemt ved kinetisk PCR. Dataene er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus kontrol. * P 0,05 versus DMBA. B. repræsentant immunoblotanalyse. Proteinprøver (100 ug /bane) løst på SDS-PAGE blev probet med tilsvarende antistoffer. GAPDH blev anvendt som lastning kontrol for cytosol og hele vævshomogenisater. Histon H2B blev brugt som lastning kontrolsystem for nukleare proteiner. Phosphorylerede proteiner normaliseret ved deres ikke-phosphoryleret form,. C. Densitometrisk analyse. Proteinet ekspression fra kontrol- lysater for tre bestemmelser blev betegnet som 100% i grafen. Hver søjle repræsenterer proteinekspression af tre bestemmelser

♣ p. 0,05 versus kontrol. * P 0,05 versus DMBA. D. Niveauer af pstat

tyr705 (ELISA). E. Repræsentative mikrofotografier af immunhistokemisk farvning af pstat-3 i kontrol- og forsøgsdyr (20X).

astaxanthin hæmmer celledeling, invasion og angiogenese via hæmme JAK /STAT vej

Som STAT-3-aktivering regulerer transskriptionen af ​​gener involveret i celleproliferation, invasion, og angiogenese, Derefter undersøgte vi virkningen af ​​astaxanthin på markører af celleproliferation. Kosttilskud af astaxanthin reducerede signifikant mRNA og protein ekspression af cyclin D1 og PCNA. Endvidere AXT øget nuklear p21-ekspression i forhold til den cytosoliske fraktion. Desuden AXT tilskud nedsat total cyclin D1 niveau (ELISA) sammenlignet med DMBA gruppe (figur 2). Imidlertid ingen statistisk signifikante forskelle blev bemærket mellem hamstere fodret astaxanthin alene og kontrolgruppen

(gennemsnit ± SD, n = 3).. A. Transcript ekspressionsniveauet af p21, cyclin D1 og PCNA i forskellige forsøgsgrupper som bestemt ved kinetisk PCR. Dataene er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus kontrol. * P 0,05 versus DMBA. B. repræsentant immunoblotanalyse. Proteinprøver (100 ug /bane) løst på SDS-PAGE blev probet med tilsvarende antistoffer. GAPDH blev anvendt som lastning kontrol for cytosol og hele vævshomogenisater. Histon H2B blev brugt som lastning kontrolsystem for nukleare proteiner. C. Densitometrisk analyse. Proteinet ekspression fra kontrol- lysater for tre bestemmelser blev betegnet som 100% i grafen. Hver søjle repræsenterer proteinekspression af tre bestemmelser

♣ p. 0,05 versus kontrol. p 0,05 versus DMBA. D. Niveauer af total cyclin D1 (ELISA). E. Repræsentative mikrofotografier af immunhistokemisk farvning af PCNA i kontrol- og forsøgsdyr (20X).

For at bestemme om hæmning af JAK /STAT vej af astaxanthin hæmmer invasion, vi næste analyseret ekspression af MMP-2 , MMP-9 og deres inhibitorer. Kosten administration af astaxanthin modulerede signifikant mRNA og protein ekspression af disse molekyler sammenlignet med gruppe 1 dyr. For yderligere at validere, at astaxanthin regulerer matrixmetalloproteinaser undersøgte vi også protein ekspression af MMP-2 ved immunohistokemisk analyse. Vores resultater viste, at astaxanthin administration markant nedsat ekspression af MMP-2 i forhold til gruppe 1 dyr. . På den anden side, blev ingen signifikante forskelle observeret i dyr fodret astaxanthin alene sammenlignet med kontrol (figur 3)

(gennemsnit ± SD, n = 3). A. Transcript ekspressionsniveauet af MMP-2, MMP-9 og TIMP-2 i forskellige eksperimentelle grupper som bestemt ved kinetisk PCR. Dataene er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus kontrol. * P 0,05 versus DMBA. B C. repræsentant immunblots og søjlediagram, der repræsenterer det protein ekspressionen af ​​MMP-2, MMP-9, TIMP-2 og RECK for mindst tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus kontrol. * P 0,05 versus DMBA. D. Repræsentative mikrofotografier af immunhistokemisk farvning af MMP-2 i kontrol og forsøgsdyr (20X).

Som neovaskularisering spiller en stor rolle i tumorvækst og er en af ​​de store downstream begivenheder udløst af JAK /STAT pathway, undersøgte vi virkningen af ​​astaxanthin på angiogenese. Som vist i figur 4, kosttilskud af astaxanthin moduleret signifikant ekspressionen af ​​VEGF, VEGFR2 og nedsat HIF-1α cellekernetranslokering sammenlignet med DMBA-malede dyr. Endvidere AXT tilskud faldt niveauet af pVEGFR2 (ELISA). Immunohistokemisk farvning også bekræftet nedsat ekspression af VEGF i hamstere fodret astaxanthin sammenlignet med DMBA-malede dyr. Ingen signifikante forskelle blev observeret hos dyr behandlet med astaxanthin alene sammenlignet med kontrol

(gennemsnit ± SD, n = 3).. A. Transcript ekspressionsniveauet af HIF-1α, VEGF og VEGFR2 i forskellige forsøgsgrupper som bestemt ved kinetisk PCR. Dataene er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus kontrol. * P 0,05 versus DMBA. B. repræsentant immunoblotanalyse. Proteinprøver (100 ug /bane) løst på SDS-PAGE blev probet med tilsvarende antistoffer. GAPDH blev anvendt som lastning kontrol for cytosol og hele vævshomogenisater. Histon H2B blev brugt som lastning kontrolsystem for nukleare proteiner. C. Densitometrisk analyse. Proteinet ekspression fra kontrol- lysater for tre bestemmelser blev betegnet som 100% i grafen. Hver søjle repræsenterer proteinekspression af tre bestemmelser

♣ p. 0,05 versus kontrol. * P 0,05 versus DMBA. D. Niveauer af pVEGFR2

tyr1175 (ELISA). E. Repræsentative mikrofotografier af immunhistokemisk farvning af VEGF i kontrol og forsøgsdyr (20X).

Som AXT faldt HIF-1α og VEGF udtryk, de centrale aktører i neovaskularisering, vi næste søgte at afgøre, om hæmning af disse molekyler ved AXT har nogen effekt på vaskulaturen ved måling af mikrovaskulær densitet. DMBA malede dyr viste høj vaskularitet med en gennemsnitlig MVD på 185 sammenlignet med kontroldyr. Kosttilskud af AXT væsentligt reduceret antallet af fartøjer i forhold til DMBA-malede dyr, hvilket indikerer antiangiogene potentiale af astaxanthin (figur 5).

A. Repræsentative mikrofotografier af mikrovaskulære tæthed i kontrol og forsøgsdyr (40X). B. Bar graf repræsenterer antal fartøjer for mindst tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus kontrol. * P 0,05 versus DMBA. C. Søjlediagram repræsenterer fartøj længde for mindst tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus kontrol. p. 0,05 versus DMBA

For yderligere at bekræfte hæmning af STAT-3 signalering og angiogenese ved astaxanthin, vi udførte molekylær docking studie for astaxanthin med STAT-3 og VEGF. AXT viste sig at binde med STAT-3 og VEGF med en docking score på -5,081 og -2,94 hhv. AXT interagerer med dimerisering site af STAT-3 til dannelse af hydrogenbindinger med Met 1482, Glu 1523 Arg 1593 og Asn 539 og interagerer med VEGF gennem hydrogenbinding med Asp 41 rest (figur 6).

A. Repræsenterer AXT formular hydrogenbinding med Met 1428, Glu 1523, Arg 1593 og Asn 538 af STAT-3. B. Repræsenterer AXT formular hydrogenbinding med ASP 41 i VEGF.

For at teste antiangiogene potentiale astaxanthin

in vitro

vi brugte ECV 304 celler. Angiogenese er en kompleks proces, der involverer celleproliferation, migration, og dannelse rør. Først, vi bestemt koncentrationen af ​​astaxanthin, hvor det hæmmer levedygtighed ECV celler med 50% (IC

50). Vi brugte varierende koncentrationer af astaxanthin fra 5 til 400 uM. Vi fandt, at astaxanthin ikke reducerer levedygtigheden af ​​ECV 304 celler til 50% ved de testede koncentrationer. Cellernes levedygtighed var 100% op til 50 uM af astaxanthin som vist i figur 7; derfor astaxanthin ved 50 uM koncentration blev anvendt til yderligere eksperimenter. For at teste, om astaxanthin inhiberer proliferation af endotelceller, udførte vi Alamar blue assay og BrdU assay. Hypoxi-induceret celleproliferation blev ikke påvirket af astaxanthin som bekræftet af både BrdU assay samt Alamar blue assay (figur 7).

A. IC

50 værdi for astaxanthin på ECV304-celler (Alamar Blå assay). B. Virkning af astaxanthin (50 uM) på hypoksi-induceret celleproliferation (Alamar blue assay). * P 0,05 versus normoxi. C. Virkning af astaxanthin (50 uM) på hypoksi-induceret celleproliferation (BrdU-assay). * P. 0,05 versus normoxi

Migration af endotelceller er et af de vigtigste skridt i angiogenese og metastase; derfor vi næste bestemmes effekten af ​​astaxanthin om migration. Vores resultater viste, at 50 pM astaxanthin signifikant hæmmet migration af endotelceller. Som vist i figur 8, hypoxiske ECV celler migreret ca. 437 um efter 24 timer; mens AXT behandlede hypoxiske celler migreret kun omkring 192 um, med angivelse af anti-migration potentiale astaxanthin

A B. Repræsentative mikrofotografier af migration assay i kontrol- og hypoxisk ECV celler ved 0 t og 24 timer (4x). C. Søjlediagram repræsenterer afstand migreret til mindst tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus normoxi. p. 0,05 versus hypoxi

Den vigtigste trin under angiogenese er dannelsen og sammenlægning af rør produceret af endotelceller danner et komplekst netværk af fartøjer, derfor vi næste bestemmes effekten af ​​AXT på dannelse rør af udførelse matrigel kanaldannelse assay. Under hypoxiske tilstand, der var signifikant stigning i antallet af rør dannet samt rørlængde forhold til normoxisk tilstand. Astaxanthin behandling betydeligt reduceret antallet af rør og rør længde under hypoxisk tilstand. Ingen signifikante forskelle blev observeret i celler behandlet med astaxanthin under normoxiske betingelser (figur 9).

A. Repræsentative mikrofotografier af matrigel kanaldannelse assay i kontrol og hypoxisk ECV celler (4x). B. Bar grafen repræsenterer nej. af rør til mindst tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus normoxi. * P 0,05 versus hypoksi. C. Søjlediagram repræsenterer rør længde for mindst tre uafhængige forsøg

♣ p. 0,05 versus normoxi. * P. 0,05 versus hypoxi

For at kende den mekanisme, hvormed AXT hæmmer migration og rør dannelse af endothelceller, vi analyserede udtryk for pro-angiogene molekyler i normoxisk og 4 timer, 8 timer, og 16 h hypoxisk ECV celler. Immunoblot analyse afslørede en stigning i HIF1α ekspression fra 4 timer, der blev opretholdt op til 8 timer hypoxi. VEGF og MMP-2-ekspression øges fra 8 h fremefter og varede indtil 16 timer. Behandling med AXT reduceret hypoxi-inducerede stigning i ekspressionen af ​​disse molekyler (figur 10)

A B. Repræsentative immunoblots og søjlediagram, som viser protein ekspression af HIF-1α, VEGF og MMP-2 for mindst tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 versus hypoxi

Diskussion

Flere undersøgelser har dokumenteret, at afvigende aktivering af STAT-3 signalvej bidrager til neoplastisk transformation i forskellige maligniteter, og har valideret stati- 3 som et lovende mål for cancerterapi [11], [30], [31]. Udviklingen af ​​midler, der er målrettet STAT-3 med tilstrækkelig styrke og tumor selektivitet har vist sig at være en vanskelig opgave. Undersøgelser af andre og os har indikeret, at fytokemikalier er involveret i kræft kemoforebyggelse ved at modulere signal- kredsløb afvigende i kræft [32] – [35]. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at astaxanthin inhiberer JAK /STAT-3 signalvejen samt dens målgener i HBP carcinoma model.

Funktionerne af STAT-3-protein hovedsageligt afhænge af dens phosphorylering og subcellulære lokalisering. I ustimulerede celler, de STAT-3-proteiner er til stede i den inaktive form i cytosolen. Aktivering af STAT-3 kan ske gennem phosphorylering af dens tyrosinrest ved cytokin eller vækstfaktor receptor signalering. Phosphoryleret STAT-3 derefter dimeriserer og translokerer til kernen, hvor den binder til IFN-gamma-aktiveret websted (GAS) i DNA og aktiverer transkriptionen af ​​målgener [12]. STAT-3 viser sig at være konstitutivt aktive i forskellige carcinomer og inhibering af STAT-3-aktivering korrelerer med suppression af maligne celler både

in vitro

in vivo

[36], [37] . Resultaterne af denne undersøgelse dokumenterer, at astaxanthin tilskud ophæver konstitutiv aktivering af STAT-3 ved at forhindre dets phosphorylering og efterfølgende nukleare translokation. Endvidere interaktionen af ​​AXT med dimerisering site af STAT-3 ved molekylær docking studier validerer også inhiberingen af ​​STAT-3 ved AXT. Astaxanthin blev vist at inhibere rotte hepatocellulært carcinom CBRH-7919 celler ved at modulere JAK /STAT-3 signaleringen [38].