PLoS ONE: GAIP interagerende protein C-Terminus Regulerer Autophagy og exosomet Biogenese af kræft i bugspytkirtlen gennem metaboliske veje

abstrakt

GAIP-interagerende protein C terminus (GIPC) vides at spille en vigtig rolle i en række fysiologiske og sygdomstilstande. I den foreliggende undersøgelse har vi identificeret et hidtil ukendt rolle for GIPC som en master regulator af autofagi og eksocytotiske veje i cancer. Vi viser, at udtømning af GIPC-induceret autophagy i bugspytkirtelkræftceller, som fremgår af opregulering af autophagy markør LC3II. Vi rapporterer endvidere, at GIPC regulerer cellulære menneskehandel veje ved at modulere sekretion, biogenese, og molekylære sammensætning af exosomer. Vi identificerede også inddragelse af GIPC på metaboliske stress veje regulerer autofagi og microvesicular udgydelse, og bemærkede, at GIPC status bestemmer lastning af cellulære last i exosomet. Endvidere har vi vist overekspression af lægemidlet resistensgenet ABCG2 i exosomer fra GIPC-udtømte bugspytkirtelkræftceller. Vi viste også, at udtømning af GIPC fra kræftceller sensibiliserede dem til gemcitabin behandling, en allé, der kan udforskes som en potentiel terapeutisk strategi for at overvinde resistens i kræft

Henvisning:. Bhattacharya S, Pal K, Sharma AK , Dutta SK, Lau JS, Yan IK et al. (2014) GAIP interagerende protein C-Terminus Regulerer Autophagy og exosomet Biogenese af kræft i bugspytkirtlen gennem metaboliske processer. PLoS ONE 9 (12): e114409. doi: 10,1371 /journal.pone.0114409

Redaktør: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, USA

Modtaget dateret 25. april 2014 Accepteret: November 7, 2014; Udgivet: December 3, 2014

Copyright: © 2014 Bhattacharya et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health giver CA78383 og CA150190 (DM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Macroautophagy, almindeligvis betegnes som autophagy, er en vigtig kataboliske proces, celler gennemføre i forskellige biologiske og fysiologiske aktiviteter [1], [2]. Under normale cellulære betingelser, denne proces opretholder cellulær og vævshomeostase i en beskyttende måde ved genbrug og nedbrydende cellulære komponenter under celledød [2] – [5]. Tidligere blev det antaget, at autophagosome, en dobbelt-membraned vesikel, opsluger organeller tilfældigt [1], [2], [5]; imidlertid har nyere undersøgelser vist, at udvælgelsen af ​​organeller er instrueret af fragt specifikke faktorer [6]. Derudover autophagy spiller en vigtig rolle i mange sygdomsprocesser, herunder cancer [7]. I flere kræftformer, kan autofagi påvirke initiering og progression af sygdom [8], [9] og fremme tumor udvikling under metabolisk stress af iltmangel. Fordi mutationer af autofagi-relaterede gener er blevet rapporteret i humane kræftformer [10], [11], undersøgelser har fokuseret på genetisk og kemisk hæmning af autophagy som en terapeutisk strategi [12].

GAIP interagerende protein C- terminalen (GIPC) blev oprindeligt identificeret som et interagerende partner for GTPase-aktiverende protein RGS-GAIP for G-protein-koblet receptor subunit GI alfa [13]. PDZ-domænet af GIPC stabiliserer mange transmembrane proteiner, herunder Glut1 transportør, semaphorin-F, neuropilin-1, TAX viralt protein, dopamin D2 og D3, og IGF1R [14] – [19]. Mens størstedelen af ​​PDZ domæne-bindende ligander for GIPC er transmembrane proteiner, flere af dem er cytosoliske proteiner, såsom APPL1 og RGS19 [13], [20]. Funktionsmæssigt er den N-terminale region af GIPC involveret i dimerisering og den C-terminale region af GIPC interagerer med myosin VI (MYO6) [21], [22], synliggøre dens rolle som en adapter molekyle til lastning PDZ domæne målrettet laster på MYO6 motor protein til transport. GIPC er også involveret i handel med forskellige transmembrane proteiner til endocytiske vesikler og afgørende for handel med internaliserede integriner under celle migration, angiogenese, og cytokinese [23] – [25]. Forhøjede niveauer af GIPC ekspression er rapporteret i flere kræftformer, herunder pankreatisk og brystcancer, fremme deres cellulær proliferation og overlevelse [19], [26] – [30]. Omvendt, udtømning af GIPC i cancerceller hæmmer proliferation og fremmer apoptose. Knockdown af GIPC resultater i G

2 celle-cyklus anholdelse og nedsætter dødeligheden i MDA-MB231-celler, hvilket yderligere antyder rolle GIPC i cytokinese og celle migration [23], [31].

Exosomer er intracellulære vesikler (40-100 nm), der kræves for intercellulær kommunikation i flercellede organismer [23]. Den molekylære maskiner er involveret i exosome biogenese omfatter fire multiprotein komplekser kendt som endosomale sortering komplekse ansvar for transport (ESCRT) -0, -I, -II og-III og accessoriske proteiner såsom Alix og VPS4. Den ESCRT-0, -I, og -II komplekser genkende og udskille ubiquitinerede membranproteiner på endosomale begrænser membran, hvorimod ESCRT-III-komplekset er ansvarlig for membran spirende og den faktiske fjernelse af intraluminale vesikler (ILVs) [32]. For nylig, Alix (også kendt som PDCD6IP) blev funktionelt knyttet til exosome biogenese gennem dens interaktion med TSG101 og CHMP4 proteiner [33] – [35]. En nylig undersøgelse tyder på, at dannelse og udslip af arrestinpositive domæne-holdigt protein 1-medierede mikrovesikler (ARMMs) på plasmamembranen afhænger af rekrutteringen af ​​TSG101 protein [36].

Der er akkumulerende beviser for, at GIPC spiller en vigtig rolle i cellulær trafficking. Navnlig GIPC fungerer som et stillads til at styre receptormedieret handel [20], [22], [37] og efter receptorinternalisering, GIPC transient associeres med en pulje af endocytiske vesikler tæt til plasmamembranen [15]. Exosom biogenese samt dannelse af autophagosome involverer endocytotiske vesikler. Men der er ingen klare beviser for, at disse to mekanismer vesikel dannelse krydstale med hinanden [38]. I nærværende undersøgelse, afslører vi en unik regulerende rolle GIPC om autophagy gennem metaboliske veje og modulering af exosome sekretion. Vi viser også, at udtømning af GIPC fra kræftceller sensibiliserer dem til kemoterapeutiske lægemidler, såsom gemcitabin, en allé, der kan undersøges yderligere som en potentiel terapeutisk strategi mod resistens.

Materialer og metoder

celledyrkning GIPC knockdown cellelinier

pancreascancer cellelinier aspC-1 og Panc-1 blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640-medier (for AsPC-1) eller høj glucose DMEM (for PANC-1) tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS), 5% L-glutamin og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Celler blev holdt ved 37 ° C i en atmosfære indeholdende 95% luft-5% CO

2 (v /v). Stabile GIPC knockdown cellelinier blev dannet ved anvendelse lentivirus shRNA. Lentivirus partikler blev fremstillet ved anvendelse 293T-celler cotransficeret med gag-pol ekspressionsplasmid pCMVΔ8.91, den VSVG kuvert ekspressionsplasmidet PMD-G, og vektor-plasmidet pLKO.1 koder cDNA’er til ekspression af GIPC /Synectin shRNA (5 ‘-CCGGGCAAATGCAATAATGCCCTCACTCGAGTGAG-GGCAT-TATTGCATTTGCTTTTTG-3’). GIPC /Synectin shRNA i pLKO.1 blev købt fra Open Biosystems. Supernatanten blev opsamlet 48 timer efter transfektion og nedfrosset ved -80 ° C. PANC-1 eller AsPC-1-celler blev derefter inficeret natten over ved 37 ° C og stabile kolonier blev isoleret efter puromycinselektion (1 ug /ml). For at sikre effektiviteten af ​​GIPC /Synectin knockdown blev proteinlysater analyseret ved immunblot for GIPC /Synectin. Kontrolceller blev transduceret med en tom protein vektor. Retroviral pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B plasmid fra Addgene (Addgene plasmid 22418) blev anvendt til fremstilling retroviruspartikler ved hjælp 293T celler efter standardprocedure. AsPC-1 eller PANC-1-celler blev inficeret med retroviruspartikler og stabile kolonier blev isoleret efter puromycinselektion (1 ug /ml). Eksperimenter blev udført ved 70-80% cellekonfluens og bekræftet i mindst tre uafhængige forsøg.

RNA-interferens, transfektion

Efter en 24 timers inkubation med antibiotika-frit medium, cellerne blev transficeret med anti-GIPC lille interfererende RNA (siRNA) ved anvendelse af DharmaFECT 2 transfektionsreagens (Dharmacon, Lafayette, CO). Tooghalvfjerds til 96 timer efter transfektion blev GIPC knockdown bekræftet ved Western blot analyse. En lignende siRNA tilgang for anti-Atg7 og anti-Beclin1 knockdown. For glucose sult eksperimenter blev både kontrol- siRNA og GIPC siRNA behandlede AsPC-1-celler holdt i glucose fri RPMI suppleret med 10% FBS i sidste 16 timer af den 96 timer eksperimentet. For autophagic flux eksperimenter, både kontrol siRNA og GIPC siRNA behandlet AsPC-1 og PANC-1-celler blev behandlet med angivne koncentrationer af pepstatin-A og E-64d til endelig 24 timer af 96 h eksperiment. Salg

Antistoffer og immunoblotanalyse

Helcellelysater blev fremstillet i NP-40 lysispuffer suppleret med en protease-inhibitor cocktail (Sigma, St. Louis, MO) og Halt phosphatase inhibitor cocktail (Thermo Scientific, Waltham, MA). Supernatanten blev opsamlet efter centrifugering ved 13.000 rpm i 10 min ved 4 ° C og separeret ved SDS-PAGE. Anti-GIPC, anti-PLCγ, og peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev købt hos Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer mod ABCG2, mTOR, phospho-mTOR, p70S6K, phospho-p70S6K, Atg7, Beclin1, AMPK-α, og phospho-AMPK-α blev indkøbt fra cellesignalering Technologies. Anti-CHMP4b og anti-TSG101 blev købt fra Abcam; anti-β-actin blev købt fra Sigma; og Alix antistof blev købt hos Thermo Scientific. Western blots blev fremkaldt under anvendelse af SuperSignal West Pico substrat (Thermo Scientific) og immunopræcipitationer blev udført som tidligere beskrevet [19].

Immunofluorescens Salg

Celler (2 x 10

4) blev podet på et dækglas i antibiotikum-frit medium i 24 timer. Celler blev derefter transficeret med GIPC siRNA eller krypteret siRNA (Dharmacon), og mediet blev skiftet 48 timer post-transfektion. Efter 96 timer blev cellerne vasket og fikseret med 4% paraformaldehyd. Efter blokering med 10% gedeserum i 15 minutter blev cellerne permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 ved stuetemperatur i 5 min. Objektglassene blev derefter farvet med primære antistoffer mod LC3 i 2 timer i 1% gedeserum. Efter inkubering af objektglassene med sekundære antistoffer konjugeret til AlexaFluor 488 (1:200; Life Technologies, Grand Island, NY) i 1 time blev objektglassene monteret med Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) indeholdende 4 ‘, 6-diamidino-2 -phenylindole (DAPI) og konfokal mikroskopi blev udført. I et andet sæt eksperimenter blev celler udtrykker mCherry-EGFP-LC3B podet i dækglas og transficeret med GIPC siRNA eller krypteret siRNA. Efter 96 timer blev cellerne vasket og fikseret med 4% paraformaldehyd. Objektglas blev monteret med Vectashield indeholdende DAPI som tidligere beskrevet.

glucoseoptagelse og intracellulære glucose måling assay

Stald celler, enten transficeret med GIPC shRNA eller kontrolvektoren, blev podet i plader med 6 brønde og dyrket i 48 timer. Glucoseoptagelse blev målt ved anvendelse af glukoseoptagelse cellebaserede Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) ved anvendelse af en fluorescens-mærket deoxyglucose analog. For en intracellulær glucosekoncentration måling blev Amplex Red Glucose Assay Kit (Life Technologies), der anvendes med en mindre ændring til fabrikantens protokol som tidligere [39] beskrevet. Cellerne blev opsamlet ved centrifugering, og den resulterende cellepellet blev vasket to gange i PBS og dispergeret i 1X reaktionspuffer fra kittet. Celler blev lyseret ved ultralydbehandling med tre cyklusser af 10 sekunder på, 30 sekunder ved 20% effekt under kontinuerlig opretholdt på is. Halvtreds pi reaktionsopløsning (10 mM Amplex Red, 10 U /ml HRP, 100 U /ml glucoseoxidase, 50 mM natriumphosphatpuffer, pH 7,4) blev tilsat til 50 pi cellelysat i en plade med 96 brønde og inkuberet i mørke ved 37 ° C i 30 min. Den fluorescens (excitation: 544, Emission: 590). Blev derefter målt ved hjælp af en SpectraMax pladelæser og værdier blev udtrykt som relative fluorescens Units (RFU) /mg protein

exosome isolation

Exosomer var isoleret fra konditioneret medium af PANC-1 og AsPC-1-celler ved differentiel centrifugering. Cellerne blev dyrket til 70-80% konfluens og medierne blev udskiftet med medium indeholdende 10% føtalt bovint serum berøvet mikropartikler gennem centrifugering (60 min ved 100.000 ×

g

). Efter 72 timers inkubation blev supernatanter opsamlet og renset for cellerester og døde celler med to sekventielle spins ved 4 ° C, 3.000 x

g

i 10 min. Clearede supernatanter blev derefter yderligere centrifugeret ved 4 ° C, 60.000 x

g

i 70 min. De resulterende exosom pellets blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning, og derefter centrifugeret igen ved 4 ° C, 100.000 x

g

i 70 min. De endelige exosom pellets blev resuspenderet i PBS eller vand, afhængigt af forsøget.

Elektronmikroskopi

Frisk fremstillede exosomer resuspenderede i vand blev yderligere dispergeret i Trump fikseringsopløsning sammensat af 4 % (v) formaldehyd og 1% (v) glutaraldehyd i 0,1 M phosphatpuffer ved pH 7,2. Exosomerne blev derefter vasket med 0,1 M phosphatpuffer, 1% osmiumtetroxid i 0,1 M phosphatbuffer, destilleret vand, 2% (v) uranylacetat, destilleret vand, ethanol og absolut acetone i rækkefølge. Endelig blev exosomer placeret på en TEM gitter til undersøgelse ved hjælp af en

Philips Technai

T12.

Proteomics analyse

Protein identifikation blev udført via in-gel trypsin fordøjelse ved hjælp nanoLC- MS /MS med hybrid orbitrap /lineær ion trap massespektrometri. Kort beskrevet protein fra exosomerne af GIPC-deficiente stabile cellelinier blev opløst på en 4-12% NuPage-gel (MOPS-buffer) med 20 pi SDS-PAGE-prøvebuffer indeholdende 50 mM DTT. Gelerne blev farvet med BIOSAFE kolloid blåt farvestof (BioRad) og de ønskede bånd blev udskåret fra gelen til massespektrometrianalyse hjælp af følgende procedurer. Kolloidblåt farvet gel bånd blev affarvet i 50% acetonitril /50 mM Tris pH 8,1 indtil den er klar. Båndene blev derefter reduceret med 50 mM TCEP /50 mM Tris, pH 8,1 ved 55 ° C i 40 min og alkyleret med 20 mM iodacetamid /50 mM Tris pH 8,1 ved stuetemperatur i 60 minutter i mørke. Proteiner blev fordøjet

in situ

med 30 pi (0,005 ug /pi) trypsin (Promega Corporation, Madison WI) i 20 mM Tris pH 8,1 /0,0002% Zwittergent 3-16, ved 55 ° C i 2 timer, efterfulgt af peptid ekstraktion med 10 pi 2% trifluoreddikesyre og derefter 60 pi acetonitril. De samlede ekstrakter blev opkoncentreret til mindre end 5 pi på en Speed-Vac koncentrator (Savant Instruments, Holbrook NY) og derefter bragt op i 0,2% trifluoreddikesyre til identifikation protein ved nano-flow væskekromatografi elektrospray tandem-massespektrometri (nanoLC-ESI -MS /MS) under anvendelse af en ThermoFinnigan Orbitrap Elite Hybrid massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Tyskland) koblet til en Eksigent nanoLC-2D HPLC-system (Eksigent, Dublin, CA). Det fordøjede peptidblanding blev sat på en 250 nl OPTI-PAK fælde (Optimer Technologies, Oregon City, OR), custom-pakket med Michrom Magic C8 fast fase (Michrom Bioressourcer, Auburn, CA). Kromatografi blev udført under anvendelse af 0,2% myresyre i både et opløsningsmiddel (98% vand /2% acetonitril) og B opløsningsmiddel (80% acetonitril /10% isopropanol /10% vand), og en 2% B til 45% B-gradient i løbet 70 min ved 300 nl /min gennem en hånd-pakket PicoFrit (New mål, Woburn, MA) 75 um × 200 mm søjle (Michrom Magic C18, 3 um). Den Orbitrap Elite massespektrometer eksperiment blev sat til at udføre en FT fuld scanning fra 340-1500 m /z med opløsning sat til 120.000 (400 m /z), efterfulgt af lineær ion trap CID MS /MS-scanninger på de øverste femten ioner. Dynamisk udelukkelse blev sat til 1, og udvalgte ioner blev placeret på en liste over 30 sekunder

Database søger

Tandem massespektre blev udvundet ved msconvert (version 3.0.4019, ProteoWizard). Og alle MS /MS prøver blev analyseret ved hjælp af Mascot (Matrix Science, London, UK, versionen 2.4.0), SEQUEST (Thermo Fisher Scientific, udgave 27, rev. 12) og X1 Tandem (The GPM, thegpm.org; versionen CYCLONE (2010,12 .01.1)). Mascot, SEQUEST, og X1 Tandem blev oprettet for at søge i februar 2012 Swissprot database, begrænset til menneske med en lokkedue omvendt database, og under forudsætning af fordøjelsen enzymet trypsin. Mascot og X1 Tandem blev søgt med et fragment ion masse tolerance på 0,60 Da og en forælder ion tolerance på 10,0 PPM. SEQUEST blev søgt med et fragment ion masse tolerance på 0,60 og en forælder ion tolerance på 0,01 Da. Oxidation af methionin og iodacetamid derivat af cystein, er specificeret i Mascot, SEQUEST, og X1 Tandem som variable modifikationer.

RNA-isolering og kvantitativ PCR-analyse

Totalt RNA blev isoleret fra cellelinjer og exosomer under anvendelse den miRCURY RNA Isolation Kit – Cell Plant (Exiqon, Woburn, MA) efterfulgt med spektrofotometri (NanoDrop, Thermo Scientific) til kvantificering og kvalitativ analyse. Lige mængder af total RNA blev revers-transkriberet ved oligo (dT) priming under anvendelse af iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA) ifølge producentens instruktioner. Real-time PCR blev udført under anvendelse af ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) og SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) som beskrevet tidligere [40]. Glut1 og β-actin-primere blev indkøbt fra SABiosciences (Frederick, MD).

Drug følsomhed assay

Kort fortalt 5 × 10

3-celler blev podet per brønd i tre eksemplarer i 96 -Nå fladbundede plader med 100 pi medium. Efter 24 timer blev forskellige koncentrationer af gemcitabin (ug /ml) tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 72 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden, 20 pi MTS-opløsning indeholdende PMS (MTS:. PMS = 20:01 vol-forhold) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 1 til 2 timer. Absorbansen ved 490 nm blev registreret ved anvendelse af en Spectrafluor PLUS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) og de halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) blev beregnet som koncentrationer svarende til en reduktion på 50% af cellulær vækst. Forud for lægemiddelfølsomhed testning, blev cellelevedygtighed bestemt ved MTS-assayet (Promega, Madison, WI).

Statistisk analyse

Dataene i søjlediagrammerne repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse for mindst tre uafhængige forsøg, som hver blev udført med tredobbelte prøver. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en Students t-test, med en to-halet værdi P 0,05 foreligger væsentlig

Resultater

GIPC udtømning inducerer autophagy i bugspytkirtelkræftceller

Udnytte GIPC-depleterede aspC-1 og PANC-1 pancreatiske cellelinjer, undersøgte vi, om GIPC moduleret autofagi ved at vurdere autofagi-relaterede mikrotubulus-associeret protein let kæde 3 (LC3) konverteringer (LC3-i til LC3-II) via Western blot-analyse. Det er velkendt, at omdannelsen af ​​den lette kæde 3-I (LC3-I), ved konjugation til phosphatidylethanolamin (PE), danner konjugatet lette kæde 3-II (LC3-II), der derefter rekrutteret til membraner autophagosomes [13], [20]. LC3 ekspression er blevet meget anvendt til at overvåge og fastslå status for autophagy som mængden af ​​LC3II korrelerer med antallet af autophagosomes [41]. Efter en grundig undersøgelse af LC3-II-niveau i pancreas stabile cellelinier, vi observerede en forhøjet LC3-II-niveau i celler, der mangler for GIPC, hvilket indikerer aktivering af autophagy (figur 1A). Vi har også observeret en stigning i LC3-II (grøn) puncta dannelse i GIPC-depleterede celler ved immunofluorescens undersøgelse (figur 1B). GIPC knockdown i nærvær af lysosomale proteaseinhibitorer, Pepstatin-A og E-64d, yderligere øget LC3-II niveauerne i en dosisafhængig måde sammenlignet med GIPC knockdown alene, hvilket indikerer forbedring af autophagic flux (Figur S1A). Derudover brugte vi en tandem fusionsprotein mCherry-EGFP-LC3B indeholder syre-ufølsom mCherry og syre-følsomme EGFP som en autophagic flux reporter-system [42], [43]. Under autophagosome dannelse, er både EGFP og mCherry påvist i autophagosomes der vises som gul puncta. Men når autophagosomes sikring med lysosomer, er den grønne fluorescens tabt på grund af nedbrydningen af ​​EGFP ved sure lysosomale proteaser resulterer kun røde puncta. Derfor tilstedeværelse af både gule og røde puncta indikerer en funktionel autophagic flux proces. Her har vi brugt både AsPC-1 og PANC-1 cellelinjer stabilt udtrykker mCherry-EGFP-LC3B at vise stigning i både gule og røde puncta på GIPC knockdown som også indikeret en stigning i autophagic flux (Figur S1B). Disse resultater antydede, at GIPC knockdown inducerer dannelsen af ​​autophagosomes i bugspytkirtelkræftceller.

A) AsPC-1 og PANC-1-celler blev inficeret med lentivirus udtrykker shRNAs til GIPC og krypterede kontrol. En lige mængde af helcellelysater fra AsPC-1 og PANC-1 GIPC udtømte celler blev analyseret ved immunblotting (IB) med antistofferne for GIPC og LC3II. β-Actin anvendes som lastning kontrol. B) Et repræsentativt immunfluorescensanalyse af PANC-1-celler til ekspression af LC3 II (grøn) i GIPC depleteret PANC-1-celler sammenlignet med kontrolceller. Celler blev modfarvet med DAPI (blå).

Vi undersøgt yderligere effekten af ​​to autofagi-relaterede gener, Atg7 og Beclin1, om GIPC-medieret autophagic regulering. For at vurdere vekselvirkningen af ​​Atg7 og Beclin1, vi reduceret niveau af Atg7 og Beclin1 ved RNA-interferens (RNAi) i begge PANC-1 og AsPC-1-celler. Som vist i figur 2A og 2B, har vi ikke observere nogen signifikant ændring i Atg7 eller Beclin1 udtryk efter GIPC udtømning i både bugspytkirtelkræftceller. Som Atg7 og Beclin1 er to centrale komponenter til autophagosome biogenese, vi også observeret et fald i LC3 II konvertering fra LC3 I ved knockdown af Atg7 og Beclin1 i både bugspytkirtelkræftceller. I aspC-1 celler, bemærkede vi, at induktion af autophagy med udtømning af GIPC blev hæmmet betydeligt ved reduktion af Atg7 og Beclin1. Tværtimod i PANC-1 celler, Atg7 og Beclin1 kunne ikke påvirke LC3II konvertering underlagt GIPC udtynding. Vi nærmere associering GIPC med Atg7 og Beclin1 ved co-immunopræcipitationsforsøg og fundet Beclin1 at være i samme kompleks med GIPC (figur 2C), men fik ikke afgørende resultat for Atg7 (data ikke vist).

A) Immunoblotanalyse af Atg7 ekspression i AsPC-1 og PANC-1 cellelysater transficeret med siRNA til GIPC, Atg7 og krypterede kontrol. β-Actin anvendes som lastning kontrol. B) Immunoblotanalyse af Beclin1 ekspression i AsPC-1 og PANC-1 cellelysater transficeret med siRNA til GIPC, Beclin1, og krypterede kontrol. β-Actin anvendes som lastning kontrol. C) Co-immunpræcipitering (IP) i PANC-1 cellelysater transficeret med siRNA til GIPC, og scrambled styring med GIPC antistof. Immunkomplekser blev analyseret ved immunblotting (IB) med antistoffer mod Beclin1 og GIPC.

GIPC medierer autophagy gennem metabolisk stress veje

Glut1 er forbundet med glukoseoptagelse i cancerceller og GIPC er kendt at stabilisere Glut1 i cellemembranen som en PDZ-domæne-holdige interaktion partner [14]. I denne forbindelse, vi undersøgte, om banker ned GIPC i bugspytkirtelkræftceller ville destabilisere Glut1 og forstyrre glukoseoptagelse i disse celler. Som forventet, fandt vi et signifikant fald i Glut1 ekspression i både mRNA og proteinniveauet ved GIPC knockdown i AsPC-1 og PANC-1-celler (figur 3A 3B). Endvidere fandt vi, at den relative glukoseoptagelse for AsPC-1 og PANC-1-celler var signifikant reduceret i fravær af GIPC, sammenlignet med kontrolceller (figur 3C). For at bestemme om intracellulære niveauer af glucose var også afhængig af status for GIPC, monitorerede vi det intracellulære glucose niveau efter GIPC knockdown i de samme pancreatiske cancercellelinjer og fundet niveauer, der skal reduceres væsentligt sammenlignet med vildtype celler (figur 3D). Vigtigere er det, under stressbetingelser, cellulære AMP normalt regulerer intracellulære glucoseniveau. AMP-niveauer var forhøjet i glucose sult, hvilket igen, aktiveres yderligere kinaseaktiviteten af ​​AMPK-α gennem phosphorylering [44], [45]. For at undersøge denne mekanisme i bugspytkirtelkræft cellelinjer, undersøgte vi AMPK-α status ved immunoblot i GIPC stabil Knockdown celler. Vores resultater viste en høj grad af phosphoryleret AMPK-α upon GIPC depletion (figur 4A), hvilket antyder, at GIPC kan modulere AMPK pathways.

A) Kvantitativ PCR og B) Western blot-analyse af Glut1 at analysere effekten af GIPC-udtømning i Glut1 udtryk. β-Actin anvendes som lastning kontrol. Både Glut1 mRNA og protein niveauer faldt betydeligt efter GIPC udtynding i AsPC-1 og PANC-1 celler. C) Glucoseoptagelse blev signifikant reduceret i GIPC udtømte celler i sammenligning med kontrolcellerne i AsPC-1 og PANC-1-celler (** betegner p 0,01). D) Intracellulære glucose niveauer blev også signifikant reduceret i GIPC udtømte AsPC-1 og PANC-1 cellelinjer bekræfter rolle GIPC i glukosemetabolismen (** angiver p 0,01)

A) Immunoblot. af cellelysaterne fra GIPC forarmet og styre AsPC-1 og PANC-1 celler, som testes med p-AMPK-α, total AMPK-α. β-Actin anvendes som lastning kontrol. B) Endvidere immunoblot af cellelysater fra ovennævnte betingelse blev undersøgt med p-mTOR, total mTOR, p-p70S6K og total p70S6K. β-Actin anvendes som lastning kontrol.

Vi undersøgte yderligere den molekylære mekanisme af autophagy ved at undersøge downstream molekyler af AMPK-α-vejen. Vi observerede nedsatte niveauer af mTOR fosforylering efter GIPC knockdown i AsPC-1 og PANC-1 celler; imidlertid havde samlet mTOR-ekspression ikke ændres. Derudover observerede vi et fald på kendt nedstrømseffektor af mTOR, phospho-p70S6K at p70S6k-forhold, i GIPC-depleterede cellelysater sammenlignet med kontrol parentale celler (figur 4B). Fjernelse af ekstracellulær glucose yderligere forbedret AMPK-α phosphorylering og nedsat mTOR phosphorylering samt p70S6K phosphorylering (fig S2). Imidlertid blev LC3 niveauer faldt ved fjernelse af ekstracellulært glukose som bestyrker med tidligere rapporter [46] tyder ekstracellulær glukose fjernelse dræber cellerne enten ved apoptose eller nekrose i stedet for at fremkalde autophagy som en prosurvival effekt. Tilsammen vores resultater tyder på, at GIPC styrer autophagy gennem regulering af metaboliske veje i pancreas adenocarcinom celler.

GIPC påvirker exosome sekretion og biogenese

Med exosomer indsamlet fra de stabile transfektanter, vi udførte enzymatiske assays for acetylcholinesterase aktivitet som beskrevet tidligere [14]. Dette assay viste en større overflod af exosomer i de konditionerede medier af GIPC-deficiente cellelinjer. En 3,5 eller større fold forøgelse i exosom-produktion blev observeret i konditionerede medier indsamlet fra GIPC-depleteret AsPC-1-celler sammenlignet med kontrollen (figur 5A). Vi opnåede tilsvarende resultat med GIPC-depleterede PANC-1-celler samt (data ikke vist). Vi bestemt også koncentrationen af ​​total RNA i disse exosomer som en anden målestok for exosome overflod og fundet lignende resultater (figur 5B 5C). Nanopartikel sporing analyse under anvendelse af NanoSight LM10 bekræftede størrelsesfordelingen af ​​vores exosom præparater. Med en tilstand på ca. 100 nm, deres størrelse var i overensstemmelse med den nuværende exosom definition (figur 5D).

Exosomer blev isoleret fra kulturmedier af AsPC-1 og PANC-1 GIPC forarmet og kontrol cellekultur. For kvalitativ måling samme mængde celler blev podet i dyrkningsplader. A) En sammenligning af aktiviteten af ​​acetylcholinesterase er afbildet for exosomer indsamlet fra GIPC udtømt og styre AsPC-1 cellelinje. B & C) En sammenligning af total RNA indhold exosomet præparat fra AsPC-1 og PANC-1-cellekultur vises. D) En repræsentativ størrelsesfordeling profil exosomet præparat opnås under anvendelse Nanosight. E) En repræsentant transmission elektronmikrografi (TEM) af exosomer er præsenteret i denne figur. Scale bar er 500 nm. F) En højere forstørrelse TEM billede af exosomer præsenteres. Skalaen bar er 200 nm. G) Immunoblot udført med celler lysater indsamlet fra GIPC Knockdown celler samt kontrol celler blev undersøgt med TSG 101, Alix, og CHMP 4B. PLC γ anvendes som lastning kontrol.

Vi udførte derefter morfologiske karakterisering af exosomet præparat med en ultra-strukturel analyse af exosom pellets af tungmetal negativ farvning og transmissionselektronmikroskopi (TEM). Analyse af TEM billeder bekræftede exosom dimensioner i vores prøver. Figur 5E repræsenterer den typiske morfologi af den samlede exosome population i en lavere TEM forstørrelse. Yderligere analyse af TEM billeder ved højere forstørrelse bekræftede den typiske skålformede form strukturen af ​​exosomer (figur 5F). Disse analyser bekræftede, at tilstedeværelsen eller fraværet af GIPC ikke påvirkede exosome morfologi.

For at bekræfte, om de øgede exosomer i GIPC-udtømte celler korrelerede med aktivering af exosomet biosyntesen maskiner, tjekkede vi udtryk for vigtige gener ( Alix, TSG101, CHMP4B) involveret i exosome biogenese ved immunoblot. Vi observerede en øget udtryk af Alix, TSG101, og CHMP4B i GIPC Knockdown celler sammenlignet med kontrol-celler (Figur 5G).

GIPC påvirker exosome indhold og sensibiliserer bugspytkirtelkræft cellelinjer til kemoterapeutiske lægemidler

at sammenligne exosome indhold i GIPC knockdown og vild type celler, vi udførte proteomics analyser på de exosomer indsamlet fra de PANC-1 stabile cellelinier. For proteomanalyse, blev protein ekstraheret fra de udskilte exosomer og vi fandt, at indholdet af exosomer spænder varieres afhængig af GIPC status. Til støtte for robusthed og følsomhed af vores analysemetoder, proteomics data bekræftede fravær af GIPC protein i exosomer isoleret fra GIPC mangelfulde celler, men ikke i kontrolprøver. Dette også påvist for første gang tilstedeværelsen af ​​GIPC i exosomer. Endvidere proteomisk analyse af exosomer isoleret fra PANC-1 stabile celler afslørede en signifikant berigelse af gener involveret i lægemiddelresistens (data ikke vist).