PLoS ONE: Stat3 Downstream Gene Produkt chitinase 3-Like 1 er en potentiel biomarkør for Inflammation-induceret lungekræft i flere Mouse Lung Tumor Modeller og Humans

Abstrakt

Over-aktivering af signalet transducere og aktivatorer af transkriptionen 3 (Stat3) pathway i lunge alveolær type II (aT II) epitelceller inducerer kronisk inflammation og adenokarcinom i lungen af ​​CCSP-rtTA /(tetO)

7-CMV-Stat3C bitransgenic mus. En af STAT3 downstream gener produkter, chitinase 3-like 1 (CHI3L1) protein, viste øget koncentration i både bronchioalveolar skyllevæske (BALF) og blod af doxycyclin-behandlede CCSP-rtTA /(tetO)

7-CMV-Stat3C bitransgenic mus. Ved afprøvning i andre inflammationsinduceret lungekræft musemodeller blev CHI3L1 proteinkoncentration også stærkt forøget i BALF og blod af disse modeller med tumorer. Immunohistokemisk farvning viste stærk farvning af CHI3L1 protein omkring tumor områder i disse musemodeller. Analyse af almindelige legemer og lungekræft patienter viste en signifikant forhøjelse af CHI3L1 proteinkoncentration i humane serumprøver fra alle kategorier af lungekræft. Desuden rekombinant CHI3L protein stimulerede proliferation og vækst af Lewis lunge kræftceller. Derfor sekretorisk CHI3L1 spiller en vigtig rolle i inflammation-induceret dannelse lungekræft og potentielt tjene som en biomarkør for lungekræft forudsigelse. Baseret på vores tidligere publikation, og dette arbejde, dette er det første dyr undersøgelse forbinder overekspression af CHI3L1 til forskellige lunge tumor musemodeller. Disse modeller vil lette identifikation af yderligere biomarkører til at forudsige og kontrollere lungekræft under forskellige patogene forhold, som normalt ikke kan gøres i mennesker

Henvisning:. Yan C, Ding X, Wu L, Yu M, Qu P, du H (2013) Stat3 Downstream Gene Produkt kitinase 3-Like 1 er en potentiel biomarkør for Inflammation-induceret lungekræft i flere Mouse Lung Tumor modeller og mennesker. PLoS ONE 8 (4): e61984. doi: 10,1371 /journal.pone.0061984

Redaktør: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina

Modtaget: November 12, 2012; Accepteret: 16 Mar 2013; Udgivet: 22 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Yan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var tilvejebragt af NIH CA138759, CA152099 (C. Yan) og HL087001 (H. Du). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest dødelige årsag i human cancer population. De fem års overlevelse er kun omkring 15%. Der er et presserende behov for at identificere biomarkører, der kan bruges til at forudsige lungekræft forekomst. For nylig demonstrerede vi, at både lunge epitelcelle-initierede regional inflammation og myeloid celle-initieret systemisk inflammation kan inducere spontan lunge tumorigenese i multiple lungetumor dyremodeller [1], [2], [3], [4], [5] , hvilket indikerer, at inflammatoriske molekyler er potentielt anvendelige til lungekræft forudsigelse. Disse betændelse-induceret lunge tumor dyremodeller er ideelle og værdifulde systemer til identifikation og kontrol af lungekræft biomarkører. Under den patogene proces med kronisk inflammation og lunge tumorigenese i disse dyremodeller, et fælles træk er Stat3 over-aktivering i inflammatoriske myeloide afledte undertrykkende celler (MDSCs) og lunge epiteliale celler, hvilket antyder, at Stat3 spiller en kritisk rolle i inflammation-induceret lunge tumorigenesis . Faktisk, når en konstitutiv aktiv form af Stat3C er overudtrykt i alveolære type II epitelceller, inducerer nedstrøms inflammatoriske gener. Efterfølgende opregulering af disse inflammatoriske molekyler stimulerer og rekrutterer inflammatoriske celler (sådanne MDSCs) i lungen til dannelse af en inflammatorisk miljø. Vedvarende tilstedeværelsen af ​​disse inflammatoriske celler letter spontan adenokarcinom i lungen af ​​CCSP-rtTA /(tetO)

7Stat3C bitransgenic mus [1], [6].

Baseret på disse observationer, vi hypotesen, at Stat3 nedstrøms gener tjene som potentielle biomarkører for inflammationsinduceret lungekræft forudsigelse. Affymetrix GeneChip microarray analyse afslører omkring 800 STAT3 nedstrøms gener i lungerne af CCSP-rtTA /(tetO)

7Stat3C bitransgenic mus som vi rapporterede tidligere [1]. Ved afprøvning i dyr og mennesker, kan nogle af disse gener anvendes som biomarkører for lungekræft [1], [7]. Da de fleste af disse gener er intracellulære proteiner, er det vanskeligt at bruge dem i forbindelse med klinisk diagnose og prognose uden at gå gennem biopsi. Der er derfor et behov for at identificere opløselige og sekretoriske proteiner som biomarkører i serum eller bronchioalveolar lavage fluid (BALF) prøver for lungekræft forudsigelse og kontrol. Her rapporterer vi, at sekretorisk protein kitinase 3-Like 1 (CHI3L1), en Stat3 nedstrøms gen-produkt, er en potentiel biomarkør for lungekræft forudsigelse i forskellige dyr tumormodeller og mennesker.

Metoder

Animal Care

Alle videnskabelige protokoller involverer brug af dyr er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra Indiana University School of Medicine og fulgte retningslinjer fastsat af Ekspertpanelet for Eutanasi af den amerikanske Veterinary Medical Association. Protokoller indebærer anvendelse af rekombinant DNA eller biologisk farlige materialer er blevet godkendt af biosikkerhed udvalg Indiana University School of Medicine og fulgte retningslinjer fastsat af National Institutes of Health. Dyrene blev huset under (IACUC) -godkendte betingelser på en sikker dyr facilitet på Indiana University School of Medicine. Alle celle specifikke transgene mus er blevet beskrevet tidligere [1], [2], [3], [4], [5].

ELISA

For mus serum indsamling, den abdominale hulrum i doxycyclin-behandlede eller ubehandlede CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3, CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12, CCSP-rtTA /(TetO)

7 -CMV-Api6, c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-Api6 og c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12 bitransgenic mus blev åbnet efter bedøvelse med tredobbelt beroligende ved intraperitoneal (IP) injektion. mus blodprøver de blev indsamlet fra indre vena cava (IVC). Sera blev adskilt ved centrifugering ved 1.500 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. For bronchioalveolar skyllevæske (BALF) indsamling, blev luftrøret isoleret og kanyle med en 20 gauge luer stub adapter. Anvendelse af en 1 ml sprøjte blev bronchioalveolar lavage fluid (BALF) opsamlet ved perfusion af lungen med 1 ml prøve af 0,9% natriumchlorid og fratagelse tilbage væsker. BAL væsker blev centrifugeret i 5 minutter ved 1.000 rpm og 4 ° C for at fjerne cellepellets. CHI3L1 koncentrationer i mus og humant serum (50-100 pi) blev bestemt ved Mouse chitinase 3-like 1 Quantikine ELISA Kit og human chitinase 3-like 1 Quantikine ELISA Kits ifølge producentens anvisninger (R R 0,05. Konfidensintervaller (CIS) blev også konstrueret for alle skøn. For ROC analyse, når AUC er 1, 95% CI har både nedre og øvre grænser for en, fordi AUC = 1 svarer til total adskillelse af to grupper ved CHI3L1 og CI konstruktion er baseret på bootstrap procedure.

Resultater

Western blot analyse af CHI3L1 ekspression i BALF af CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus

Som vi rapporterede tidligere, CCSP-rtTA /( TetO)

7-CMV-Stat3C mus er en spontan lunge tumor dyremodel. I denne model Stat3C-Flag-fusionsproteinet var stærkt inducerbar med doxycyclinbehandling (figur 1A), som bekræftede vores tidligere observation ved immunhistokemisk farvning i lungen [1]. Induktion af Stat3C induceret nedstrøms gener (herunder CHI3L1), lungebetændelse og adenocarcinom [1], [6]. For at teste, om CHI3L1 er et sekretorisk protein i denne musemodel, blev Western blot-analyse udført i BALF af CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus. Som vist i figur 1, den CHI3L1 proteinekspression niveau var påviselig i BALF af doxycyclin-ubehandlede mus (-DOX, bane 1, 2, og 3) som et bånd ved 39 kDa molekylvægt. Til sammenligning blev CHI3L1 proteinekspression niveau steg i en af ​​tre doxycyclin-behandlede mus uden tumor (+ DOX, bane 5), hvilket indikerer, at CHI3L1 ekspression var forhøjet før tumordannelse, og i alle fire doxycyclin-behandlede CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus med tumor (lungekræft, bane 7, 8, 9 og 10).

A) Ekspression af Stat3C-Flag i hele lunge CCSP-rtTA /(tetO) 7-CMV-Stat3C dobbelt transgene mus. Actin blev anvendt som kontrol. WT: vildtypemusen lunger; -Dox: Doxycyclin ubehandlede bouble transgene mus lunger; + Dox1 + Dox2: doxycyclin behandlet muselunger. B) Ekspression af CHI3L1 protein i BALF af CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C dobbelt transgene mus. Lane 1-3, doxycyclin-ubehandlede mus (Dox-); Lane 4-6, doxycyclin-behandlede mus uden at vise lungetumor (Dox +); Bane 7-10, doxycyclin-behandlede mus viser lunge tumor (lungekræft).

CHI3L1 Protein Koncentration i BALF og Serum fra CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus

for mere kvantitativ analyse og præcis forudsigelse, blev ELISA anvendes til at bestemme koncentrationen CHI3L1 i BALF af vildtype, doxycyclin-ubehandlet, behandlet uden tumor, og behandles med tumor CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus. Den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration var 8,3 ± 6,4 ng /ml i vildtype mus, 8,8 ± 10 ng /ml i doxycyclin-ubehandlet CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus. Til sammenligning blev den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration steg over 11 gange (100,0 ± 49,0 ng /ml, p 0,001) i doxycyclin-behandlede mus uden tumor, yderligere underbygger, at CHI3L1 ekspression var forhøjet før tumordannelse, og blev forøget mere end 17-fold (151,8 ± 67,3 ng /ml, p 0,001) i doxycyclin-behandlede mus med tumor (figur 2, øverste panel). AUC af ROC kurver er en (95% CI: 1-1, s 0,001) for at diskriminere doxycyclin-behandlede mus med tumor vs doxycyclin-ubehandlede mus, en (95% CI: 1-1, s 0,001) for doxycyclin-behandlede mus uden tumor vs. doxycyclin-ubehandlede mus og 0,74 (95% CI: 0,56-0,93, p = 0,1). for doxycyclin-behandlede mus med tumor vs. doxycyclin-behandlede mus uden tumor

Venstre: CHI3L1 proteinkoncentrationer i BALF og serum af doxycyclin-behandlede og ubehandlede bitransgenic mus. Højre: ROC (Receiver Operating Characteristic) kurve analyser til bestemmelse af arealet under kurven (AUC). Dox-: doxycyclin-ubehandlede mus; Dox +: doxycyclin-behandlede mus uden at vise lungetumor; Cancer, doxycyclin-behandlede mus med lungetumor. Mean ± SD i BALF (n 13), DOX -: 8,8 ± 10,0, DOX +: 100,0 ± 49,0, Cancer: 151,8 ± 67,3. Mean ± SD i serum (n 13), DOX -: 6,2 ± 3,7, DOX +: 33,5 ± 35,6, Cancer: 159,0 ± 90,0. De grå linjer repræsenterer middelværdier.

Vi yderligere testet den CHI3L1 koncentration i blodet. Sammenlignet med doxycyclin-ubehandlede mus (6,2 ± 3,7 ng /ml), blev den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration steg mere end 5 gange (33,5 ± 35,6 ng /ml, p 0,001) i doxycyclin-behandlede mus uden tumor (forudgående tumordannelse ), og blev øget mere end 26-fold (159.0 ± 90,0 ng /ml, p 0,001) i doxycyclin-behandlede mus med tumor (figur 2, nedre panel). AUC af ROC kurver er 0,95 (95% CI: 0,87 til 1, s 0,001) for at diskriminere doxycyclin-behandlede mus med tumor vs doxycyclin-behandles uden tumor mus, en (95% CI: 1-1, s 0,001) for doxycyclin-behandlede mus med tumor vs. doxycyclin-ubehandlede mus, og 0,89 (95% CI: 0,77 til 1, s 0,001) for doxycyclin-behandlede mus uden tumor vs. doxycyclin-ubehandlede mus. Dette resultat viser tydeligt, at forøgelse af koncentrationen CHI3L1 protein i BALF og blod er forbundet med Stat3C-induceret inflammation og lunge tumor. Det ser ud til, at CHI3L1 protein stigning fandt sted forud for spontan lunge tumor dannelse i CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C musemodel, derfor potentielt fungerer som biomarkører.

CHI3L1 Protein Koncentration i BALF og Serum for Regional inflammationsinduceret lung tumor dyremodeller

for at teste, om sekretorisk CHI3L1 protein er opreguleret i en bredere anvendelse, blev andre inflammation-induceret spontan lunge tumor musemodeller testet. Matrix metalloproteinase 12 (MMP12) er en rygning-induceret matrixmetalloproteinase. Over-ekspression af MMP12 i lunge alveolær type II epitelceller induceret lokal inflammation, emfysem og lunge tumor [3]. I CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12 spontan lunge tumor musemodel, den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration i BALF af doxycyclin-behandlede mus med tumor blev 3 gange højere (159,7 ± 22,4 ng /ml) sammenlignet med det i BALF af doxycyclin-ubehandlede mus (49,6 ± 22,8 ng /ml, p 0,001, figur 3A, øvre venstre panel). Der var ingen signifikant forskel mellem doxycyclin-behandlede mus uden tumor (49,4 ± 18,1 ng /ml, p = 0,954) og doxycyclin-ubehandlede mus. Et lignende resultat blev observeret i serum fra MMP12-induceret tumor mus (Figur 3A, nederste venstre panel). ROC-analyse viste imponerende evne CHI3L1 koncentration i diskriminere tumoren gruppen med den ikke-tumor gruppen og doxycyclin-ubehandlede gruppe. AUC er 1 (95% CI: 1-1, s 0,001) i doxycyclin-behandlede gruppe med tumor vs. behandlede gruppe uden tumor og i doxycyclin-behandlede gruppe med tumor versus doxycyclin-ubehandlet gruppe, og 0,52 (95% CI: 0,29-0,75, p = 0,46) i doxycyclin-behandlede gruppe uden tumor vs. dxycycline-ubehandlet gruppe (figur 3A, øvre højre panel). Et lignende resultat blev observeret i serum fra CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12 spontan lunge tumor musemodel (figur 3A, nederste højre panel)

Venstre:. CHI3L1 proteinkoncentrationer i BALF og serum af doxycyclin-behandlede og ubehandlede bitransgenic mus. Højre: ROC (Receiver Operating Characteristic) kurve analyser til bestemmelse af arealet under kurven (AUC). Dox-: doxycyclin-ubehandlede mus; Dox +: doxycyclin-behandlede mus uden at vise lungetumor; Cancer, doxycyclin-behandlede mus med lungetumor. A) CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12 mus. Mean ± SD i BALF (n 7), DOX -: 49,6 ± 22,8, DOX +: 49,4 ± 18,1, Cancer: 159,7 ± 22,4. Mean ± SD i serum (n 7), DOX -: 18,6 ± 10,9, DOX +: 18,2 ± 4,6, Cancer: 61,4 ± 33,5. De grå linier repræsenterer middelværdierne; B) CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Api6 mus. Mean ± SD i BALF (n 3), DOX -: 82,4 ± 37,1, DOX +: 93,8 ± 23,0, Cancer: 409,8 ± 49,2. Mean ± SD i serum (n 3), DOX -: 14,0 ± 7,2, DOX +: 30,7 ± 43,1, Cancer: 295,2 ± 194,0. De grå linier repræsenterer middelværdierne.

apoptoseinhibitor 6 (Api6) er en anden pro-inflammatorisk molekyle, der inducerer inflammation og lungetumor når overudtrykt i lunge alveolær type II epitelceller [5]. I CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Api6 spontan lunge tumor musemodel, den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration i BALF af doxycyclin-behandlede mus med tumor blev 409,8 ± 49,2 ng /ml, sammenlignes med den i BALF af doxycyclin-ubehandlede mus (82,4 ± 37,1 ng /ml, p 0,001, figur 3B, øvre venstre panel). Ligeledes var der ingen signifikant forskel mellem doxycyclin-behandlede mus uden tumor (93,8 ± 23.9 ng /ml, p = 0,364) og doxycyclin-ubehandlede mus. Et lignende resultat blev også observeret i serum fra Api6-inducerede tumor-mus (figur 3B nederste venstre panel). AUC fra ROC analyse er 1 (95% CI: 1-1, s 0,001) i doxycyclin-behandlede gruppe med tumor versus doxycyclin-behandlede gruppe uden tumor og i doxycyclin-behandlede gruppe med tumor versus doxycyclin-ubehandlet gruppe og 0,68 (95% CI: 0,45-0,90, p = 0,22) i doxycyclin-behandlede gruppe uden tumor vs. doxycyclin-ubehandlet gruppe (figur 3B, øvre højre panel). Et lignende resultat blev også observeret i serum fra CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Api6 spontane lunge tumor musemodel, figur 3B, nederste højre panel).

CHI3L1 Protein Koncentration i BALF og Serum af systemisk inflammation-induceret lung Tumor dyremodeller

i modsætning til lunge regionale inflammatoriske dyremodeller, når MMP12 eller Api6 var overudtrykt i myeloide celler, systemisk inflammation initieres fra misdannelser og funktionsfejl myelopoiese fra knoglemarv. Lung tumordannelse blev observeret i både MMP12 og Api6 bitransgenic musemodeller [2], [4]. Dette repræsenterer en anden cellulære mekanisme for dannelse lungekræft. I c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12 spontan lunge tumor musemodel, den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration i BALF af doxycyclin-behandlede mus med tumor (70,9 ± 36,5 ng /ml) blev 4-fold øges i sammenligning med i BALF af doxycyclin-ubehandlede mus (17,7 ± 13,8 ng /ml, p = 0,027, figur 4A, øvre venstre panel). Doxycyclin-behandlede mus uden tumor (42,1 ± 67,9 ng /ml, p = 0,043, figur 4 A) viste også den forøgede CHI3L1 koncentration end med doxycyclin-ubehandlede mus. Et lignende resultat blev observeret i serum hos c-fms-rtTA /(tetO)

7-CMV-MMP12 spontan lunge tumor musemodel med tumor (figur 4, nedre venstre panel), hvori den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration var mere end 6 gange højere i tumor mus end det doxycyclin-ubehandlede kontrolmus. AUC fra ROC-analyse var 0,82 (95% CI, 0,62-1, p = 0,05) i doxycyclin-behandlede gruppe med tumor versus doxycyclin-behandlede gruppe uden tumor, 0,94 (95% CI, 0,82-1, s 0,001 ) i doxycyclin-behandlede gruppe med tumor versus doxycyclin-ubehandlet gruppe, og 0,45 (95% CI, 0,17-0,73, p = 0,57) i doxycyclin-behandlede gruppe uden tumor vs. doxycyclin-ubehandlet gruppe (figur 4A, øvre højre panel ). Lignende resultater blev observeret for serumprøver af c-fms-rtTA /(tetO)

7-CMV-MMP12 spontane lunge tumor musemodel (figur 4A, nederste højre panel)

Venstre:. CHI3L1 proteinkoncentrationer i BALF og serum af doxycyclin-behandlede og ubehandlede bitransgenic mus. Højre: ROC (Receiver Operating Characteristic) kurve analyser til bestemmelse af arealet under kurven (AUC). Dox-: doxycyclin-ubehandlede mus; Dox +: doxycyclin-behandlede mus uden at vise lungetumor; Cancer, doxycyclin-behandlede mus med lungetumor. A) c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12 mus. Mean ± SD i BALF (n 7), DOX -: 17,7 ± 13,8, DOX +: 42,1 ± 67,9, Cancer: 70,9 ± 36,5. Mean ± SD i serum (n 7), DOX -: 39,1 ± 25,6, DOX +: 57,7 ± 55,5, Cancer: 232,3 ± 110,6. De grå linier repræsenterer middelværdierne; B) c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-Api6 mus. Mean ± SD i BALF (n 6), DOX -: 69,6 ± 16,6, DOX +: 73,2 ± 28,1, Cancer: 189,9 ± 47,2. Mean ± SD i serum (n 6), DOX -: 25,2 ± 7,3, DOX +: 21,0 ± 11,7, Cancer: 69,5 ± 19,1. De grå linjer repræsenterer middelværdier.

I c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-Api6 spontane lunge tumor musemodel, den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration i BALF af doxycyclin -behandlet mus med tumor (189,6 ± 47,2 ng /ml) var -3 gange højere end den, BALF af doxycyclin-ubehandlede mus (69,6 ± 16,6 pg /ml, p = 0,002, figur 4B, øvre venstre panel). Ligeledes var der ingen signifikant forskel mellem doxycyclin-behandlede mus uden tumor (73,2 ± 28,1 ng /ml, p 0,001) og doxycyclin-ubehandlede mus. Et lignende resultat blev også observeret i serum fra Api6-inducerede tumor-mus (figur 4B, nedre venstre panel), hvori den gennemsnitlige CHI3L1 koncentration var 3 gange højere i tumor mus end det doxycyclin-ubehandlede kontrolmus. AUC fra ROC analysen er 1 i doxycyclin-behandlede gruppe med tumor versus doxycyclin-behandlede gruppe uden tumor, 1 i doxycyclin-behandlede gruppe med tumor versus doxycyclin-ubehandlet gruppe, og 0,6 (95% CI, 0,34-0,86, p = 0,35) i doxycyclin-behandlede gruppe uden tumor versus ubehandlede gruppe (figur 4B, øvre højre panel). Lignende resultater blev observeret for serumprøver af c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-Api6 spontane lunge tumor musemodel (figur 4B, nederste højre panel).

Lung immunhistologi

det er vigtigt at finde, hvor CHI3L1 udtrykkes i lungen af ​​ovennævnte spontane lunge tumor musemodeller. Lunge vævssnit fra doxycyclin-ubehandlede mus, -behandlede uden tumor, og-behandlede med tumor-mus blev immunhistokemisk farvet med anti-CHI3L1 antistof. I doxycyclin-ubehandlet CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus, CHI3L1 blev hovedsageligt udtrykt i epitelceller langs de ledende luftveje (figur 5 A a), distale bronchiolær epitelceller (figur 5A B), og alveolær type II epitelceller (figur 5 A c) (røde pile). CHI3L1 blev også udtrykt i alveolære makrofager. I doxycyclin-behandlede CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus, når inflammation blev induceret, men med nogen tumor udseende, udviste nogle områder vævsombygning (figur 5A e) og emfysem (figur 5A f). Næsten alle infiltreret makrofager blev farvet positivt med CHI3L1 (figur 5A e, grøn pil). I doxycyclin-behandlede CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus med tumor udseende, blev CHI3L1 ekspression påvist i tumorceller og omgivende makrofager (figur 5A g, h, i). Co-lokalisering af CHI3L1 i alveolære makrofager blev yderligere bekræftet i lungen af ​​doxycyclin-behandlede bitransgenic mus med anti-CHI3L1 og anti-F4 /80-antistoffer i immunfluorescensfarvning. Et repræsentativt resultat fra CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C mus blev præsenteret i figur 6.

A) Immunohistokemisk farvning i lungerne af doxycyclin-behandlede eller ubehandlede CCSP-rtTA /( TetO)

7-CMV-Stat3C mus; B) Immunhistokemisk farvning af tumor regioner i lungerne hos doxycyclin-behandlede CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12 mus, c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-MMP12-mus, og c-fms-rtTA /(TetO)

7-CMV-Api6 mus. -Dox: Doxycyclin-ubehandlede mus; + Dox:. Doxycyclin-behandlede mus

CCSP-rtTA /(TetO)

7-CMV-Stat3C bitransgenic mus blev behandlet (+ DOX) eller ubehandlet (-DOX) med doxycyclin. Immunfluorescensfarvning af lungesnit blev udført under anvendelse af anti-CHI3L1 og F4 /80-antistoffer. Co-lokalisering af både farvning blev observeret i den fusionerede billede. Bar repræsenterer 20 um.

Disse observationer var stort set gentagelig i andre MMP12 og Api6-inducerede spontan lunge tumor musemodeller. Uanset lungetumor initieret fra alveolære type II-celler eller myeloide celler, CHI3L1 var overudtrykt i tumorceller af disse MMP12 og Api6-inducerede spontan lung tumor musemodeller. Makrofager omgivende emfysem (figur 5B, c, g, k) og tumorceller (figur 5B b, e, f, i) blev også intenst farvet med anti-CHI3L1 antistof (grøn pil). Dette kan forklare, hvorfor CHI3L1 koncentrationen var højere i både BALF og blod tumor mus.

CHI3L1 Stimulation på cancerceller

For at teste, om CHI3L1 besiddelse af den stimulerende virkning på lungekræft celler, rekombinant CHI3L1 -GST fusionsproteinet og GST-protein blev fremstillet og oprenset fra bakterier (figur 7A). Rekombinant CHI3L1-GST-fusionsprotein eller kontrol GST-protein blev inkuberet med LLC-celler. CHI3L1-GST-fusionsprotein signifikant stimulerede cancercelleproliferation sammenlignet med virkningen af ​​GST kontrolprotein (figur 7B). Den apoptotiske aktivitet af CHI3L1-GST-fusion behandlede protein LLC-celler var reduceret sammenlignet med den for GST kontrolprotein (Fig 7C). Dette understøtter et begreb, CHI3L1 stimulerer lungekræft spredning og vækst

A) Renhed af rekombinant CHI3L1-Flag-fusionsprotein (øverste pil).; B) LLC-celleproliferation behandlet med GST eller CHI3L1-GST-fusionsprotein; C) Den apoptotiske aktivitet af LLC-celler behandlet med GST eller CHI3L1-GST-fusionsprotein ved Annexin V mærkning assay. *, P 0,05, **, P. 0,01

CHI3L1 Protein Koncentration i Serum fra human lungekræft

Siden CHI3L1 protein koncentration korrelerer meget godt med tumor forekomst i både regional inflammation og systemisk inflammation-igangsat spontan lung tumor musemodeller er det spændende at afgøre, om denne observation kan gentages i mennesker. Ca. 30 serumprøver fra humane patienter med lunge-adenocarcinom, lunge pladecarcinom og lunge småcellet cancer blev testet ved ELISA. Sammenlignet med humane serumprøver uden cancer (normal), blev protein-koncentrationen CHI3L1 signifikant forhøjet i humane serumprøver fra alle kategorier af patienter med lungecancer (figur 8, øverste panel). AUC er 0,83 (95% konfidensinterval, fra 0,69 til 0,92, P = 0,005) for adenocarcinom vs. Kontrol, 0,87 (95% konfidensinterval, 0,77-0,97, P 0,001) for pladecarcinom vs. kontrol, og 0,81 (95 % konfidensinterval, 0,72-0,94, P = 0,001) for småcellet karcinom vs kontrol (figur 8, nederste panel)

Top:. CHI3L1 protein koncentrationer i human serum. Nederst: ROC (Receiver Operating Characteristic) kurve analyse for at bestemme arealet under kurven (AUC). Mean ± SD i kontrol (n 30): 17,3 ± 7,8. Mean ± SD i adenocarcinom (n 30): 66,9 ± 64,8. Middel ± SD i pladecarcinom (n 30): 69,3 ± 69,0. Middel ± SD i småcellet lungecancer (n 30): 56,3 ± 58,8. De grå linier repræsenterer gennemsnitsværdierne. Kontrol:. Normal menneske uden cancer

Diskussion

CHI3L1 blev først identificeret som en downstream gen af ​​Stat3 i CCSP-rtTA /(tetO)

7Stat3C spontan lunge tumor mus model af Affymetrix GeneChip microarray [1].