PLoS ONE: Identificering af Sestrin3 Involveret i in vitro Resistance af kolorektal cancer celler til Irinotecan

Abstrakt

Irinotecan, en analog af camptothecin, anvendes ofte som enkeltstof eller i kombination med andre anticancer lægemidler til behandling af kolorektal cancer. Imidlertid er lægemiddelresistens af tumorer er en stor hindring for vellykket cancerbehandling. I denne undersøgelse har vi konstateret, at celler erhverver kronisk modstand mod irinotecan. Vi profileret deres differentiel genekspression ved hjælp microarray. Efter gen ontologi (GO) og Kegg pathway analyse af microarray data, vi specifikt undersøgt, om Sestrin3 kunne mindske irinotecan modstand. Vores resultater viste, at Sestrin3 forbedret anticancer effekt af irinotecan

in vitro

i LoVo celler, der var resistente over for irinotecan. Irinotecan-resistente LoVo celler viste lavere reaktive ilt arter (ROS) produktion end deres irinotecan-sensitive stamcellerne. ROS produktionen blev forøget med Sestrin3 knockdown i irinotecan-resistente LoVo celler. Vores resultater viser, at Sestrin3 kunne være et godt mål til at udvikle lægemidler, der kan hjælpe til at overvinde modstanden mod irinotecan

Henvisning:. Choi SH, Hong HK, Cho YB, Lee WY, Yoo HY (2015) Identifikation af Sestrin3 involveret i

In vitro

Resistance af tyk- og endetarmskræft Cells til Irinotecan. PLoS ONE 10 (5): e0126830. doi: 10,1371 /journal.pone.0126830

Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: November 4, 2014 Accepteret: April 8, 2015; Udgivet: May 14, 2015

Copyright: © 2015 Choi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle microarray data filer er tilgængelige fra GEO-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) via tiltrædelse nummer GSE59501

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Korea Sundhedsteknologi R Velfærd, Republikken Korea (HI14C3418), National Research Foundation Korea (NRF-2013R1A1A2060410) og Samsung Medical Center tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forekomsten af ​​kolorektal cancer er over en million om året på verdensplan, med en dødelighed på op til 33% i de udviklede nationer [1]. Tyktarmskræft er den femte mest almindelige kræftform. Kemoterapi er blevet anerkendt som værende effektive til behandling af spredt kolorektal cancer. Typisk har fluorouracil (5-FU) blevet anvendt som et enkelt terapi. Men i de sidste to årtier, klinisk praksis har brugt cytotoksiske lægemidler såsom fluorpyrimidin, irinotecan og oxaliplatin. Standard kombinationsforløb med kemoterapi er FOLFIRI (folinsyre, fluorouracil, og irinotecan), CapIri (capecitabin og irinotecan), FOLFOX (folinsyre, fluorouracil, og Oxaliplatin), eller CapOx (capecitabin og oxaliplatin). Erstatning af irinotecan med oxaliplatin har bidraget til forbedret overlevelse [2, 3]. Irinotecan (CPT-11), et derivat af naturligt camptothecin, er en vigtig terapeutisk lægemiddel til metastatisk kolorektal cancer (CRC) patienter [4]. Irinotecan er kemisk omdannes til dets aktive form, 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38), som inhiberer DNA-topoisomerase. Med blokering af topoisomerase på replikationsgaflen af ​​SN-38 inducerer en permanent DNA dobbeltstrenget brud, som frembringer en DNA-skade respons (DDR). DNA-beskadigelse er primært føles af kinaserne ATR og ATM, den øgede aktivitet, som fører til aktivering af kontrolpunkt kinaser chk1 /Chk2 og den efterfølgende phosphorylering af p53. Phosphoryleret p53 er mere stabil, hvilket kan aktivere apoptose eller regulere cellecyklusstandsning. p53 spiller også en rolle i antioxidant respons, som blev opdaget gennem identifikation af en roman Sestrin (

SESN

) gen-familien, som er involveret i reaktive ilt arter (ROS) regulering [5]. Baseret på primær og sekundær struktur analyse ved hjælp af PSI-BLAST og 3DPSSM programmer,

SESN

familie er rapporteret at kode antioxidant proteiner [6, 7]. Sestrin proteiner har en høj grad af homologi med

Mycobacterium tuberculosis

protein AhpD, deling ligheder i deres N-terminale domæner [5]. De er ansvarlige for at katalysere reduktionen af ​​peroxiredoxins (Prdx) som metaboliserer peroxider [8]. Den AhpD protein, en komponent af alkyl-hydroperoxid reduktase deltager i forsvar mod ROS, er ansvarlig for regenerering af ahpC, et medlem af en konserveret familie af thiol-specifikke peroxidaser (Prxs) [9].

Sestrin1

Sestrin2

gener transkriptionelt reguleres under kontrol af p53, mens

Sestrin3

er reguleret af AKT /FOXO akse gennem FOXO1 /FOXO3a-medieret gen ekspression [5, 10].

Sestrin3

er også involveret i ROS afgiftning samt i at forsinke cellulær ældning gennem FOXO [11]. Af de tre medlemmer af Sestrin familien, det tredje medlem,

Sestrin3

, er blevet rapporteret i litteraturen i mindre grad end de to andre.

Selvom irinotecan displays potent aktivitet mod en lang vifte af tumorer, herunder kolorektale tumorer, resistens fortsat en stor hindring for en effektiv kemoterapi. Derfor er der behov nye targets til at overvinde medikamentresistens for en vellykket cancerbehandling. er blevet foreslået flere hypoteser om de er involveret i modstanden mod CPT mekanismer, herunder reduceret cellulær ophobning af CPT grundet aktiv udstrømning af ATP bindende kassette (ABC) transportører, enzymatiske systemer er relevante for metabolisk omdannelse, ændring i strukturen eller placeringen af ​​topoisomerase I , og ændringer i den cellulære respons på CPT-TOPI-DNA ternære kompleksdannelse [7]. Selvom flere eksperimentelle metoder har været forsøgt klinisk at overvinde individuelle resistensmekanismer [7], bemærkelsesværdige succes har endnu ikke opnået.

I denne undersøgelse, vi etableret en cellelinie, der erhvervede kroniske modstand mod irinotecan. Vores mål var at sammenligne transkriptionelle profil i irinotecan-resistente kolorektal cancer cellelinje som i forældrenes irinotecan-sensitive celler, for at søge efter nye markører for at øge følsomheden over for irinotecan. Vi undersøgte også, om Sestrin3 kunne øge anticancer effekt af irinotecan

in vitro

, i irinotecan-resistente kolorektal cancer cellelinje.

Materialer og Metoder

cellelinjer og kultur betingelser

den menneskelige kolorektal cancer cellelinjer HCT116, HCT15, HCT29, KM12SM, SW620, DLD1, Colo205, og LoVo blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat og 2,05 mM L-glutamin ved 37 ° C. Cellelinier blev regelmæssigt testet for identitet og mycoplasma-infektion, ved hjælp af MycoAlert mycoplasma detektion kit (Lonza).

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i RIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl , 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat og 0,1% natriumdodecylsulfat) suppleret med proteaseinhibitorer og phosphataseinhibitorer. Antistoffer anvendt til immunoblotting var kanin monoklonalt anti-ATM (D2E2, cellesignalering), kanin polyklonalt anti-phospho-Chk1 (Ser317, cellesignalering), kanin polyklonalt anti-ATR, TopBP1, CTIP (Bethyl Laboratories), og monoklonalt muse-anti- NBS1 (1D7, Novus Biologicals). Polyklonale antistoffer mod Sestrin3 blev indkøbt fra Abcam. Muse monoklonalt anti-Chk1 (G-4) og anti α-tubulin blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer mod AMPKα (23A3), phospho-AMPKα (Thr72, 40H9), p70S6K og fosfor-p70S6K (Thr389, 108D2), mTOR (7C10), og phospho-mTOR (Ser2448) blev købt fra Cell Signaling.

Udvikling af irinotecan-resistente cellelinje

for at skabe en stabil kolorektal cancer cellelinje kronisk modstandsdygtig over for irinotecan blev LoVo celler udsat for irinotecan med en initial koncentration på 0,1 pmol /l i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Når dyrkede celler nåede en konfluens på 80%, blev 20% af cellerne genudpladet for næste passage. Celler blev passeret 3 gange i den samme koncentration af irinotecan for at sikre deres tilpasning og derefter behandlet med 2 gange højere koncentration af irinotecan. Koncentrationen af ​​irinotecan blev successivt forøges, indtil den nåede en slutkoncentration på 8 pmol /l. Irinotecan blev købt fra Sigma-Aldrich.

Cell Levedygtighed og cytotoksicitetsassays

kolorektal cancer cellelinjer blev podet i 96-brønds celle kultur plader i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Efter 24 timers inkubation blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende irinotecan. Forskellige koncentrationer af irinotecan blev anvendt til at behandle celler i 72 timer. Den cellelevedygtighed eller cytotoksicitet blev vurderet ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet blev 10 pi CCK-8-opløsning tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Absorbansværdierne blev målt ved 450 nm.

Klonogen overlevelse assay Salg

Celler blev dyrket i et medium indeholdende irinotecan i koncentrationer på 0,05, 0,1, 0,4, 0,8, 1,5 og 3 uM . Efter 24 timer blev cellerne løsrevet og podes på 60 mm dyrkningsskåle. Efter 14 dage blev de resterende kolonier vasket med PBS, farvet med krystalviolet, og derefter talt efter definerede koloni størrelser. Alle eksperimenter blev uafhængigt gentagne gange mindst 3 gange. Den statistiske signifikans af forskellen i kolonier numre blev bestemt ved anvendelse af en to-halet t-test.

Cellecyklusanalyse

I cellecyklus analyser, flowcytometri blev udført under anvendelse LoVo celler behandlet med eller uden irinotecan. Kort fortalt blev cellerne løsrevet med trypsin, vasket med PBS og resuspenderet i 0,5 ml PBS. Efter fiksering med 4,5 ml 70% ethanol, blev celler inkuberet på is i 2 timer. Fikserede celler blev vasket, resuspenderet i 1 ml af en propidiumiodidfarvning opløsning indeholdende 0,1% (volumen /volumen) Triton X-100, 0,2 mg /ml RNase A, og 20 ug /ml PI, inkuberet ved stuetemperatur i 30 min, og derefter holdt på is indtil flowcytometri analyse blev udført.

RNA Interference (RNAi)

i forbigående RNA silencing blev celler transficeret med siRNA-targeting Sestrin3 (siSESN3) eller med ikke-targeting siRNA (siControl), ved hjælp af Lipofectamine RNAiMAX transfektion reagens (Life Technologies).

Måling af cellulære ROS

generation af intracellulære ROS blev evalueret ved brug af CellRox grønne oxidativt stress reagens ( Invitrogen). Kort beskrevet blev celler transficeret med siRNA’er i 48 timer og efterfølgende inkuberet med 5 uM af CellRox reagens ved 37 ° C i 30 minutter. Efter vask to gange med PBS, blev fluorescensintensiteten målt ved anvendelse af fluorescensmikroskopi.

RNA-isolering og genekspressionsprofilering

I den foreliggende undersøgelse, udførte vi global genekspression analyser under anvendelse Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST oligonukleotidarrays vha LoVo-celler og irinotecan resistente LoVo-R8-celler dyrket med eller uden irinotecan (8 uM). Prøverne blev fremstillet i overensstemmelse med de anvisninger og anbefalinger, som fabrikanten. Den totale RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy Mini Kit-søjler (Qiagen). RNA kvalitet blev vurderet ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer med et RNA 6000 Nano Chip (Agilent Technologies). RNA mængde blev bestemt ved anvendelse af ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Inc.). RNA-prøver (300 ng hver) blev anvendt som input til Affymetrix procedure som beskrevet i protokollen. Kort fortalt blev 300 ng af totalt RNA fra hver prøve omdannet til dobbeltstrenget cDNA under anvendelse af en tilfældig hexamer inkorporerer en T7-promotor. Amplificerede RNA blev frembragt fra den dobbeltstrengede cDNA template selvom

in vitro

transkription og oprenset med Affymetrix prøve oprydning modul. cDNA’er blev regenereret ved revers transkription under anvendelse tilfældige primere og en dNTP-blanding indeholdende dUTP. cDNA blev derefter fragmenteret af UDG og APE 1 restriktionsendonukleaser og ende-mærket med en terminal transferase reaktion, der indarbejdet en biotinyleret dideoxynukleotid. Fragmenterede og endemærkede cDNA’er blev hybridiseret under anvendelse af de GeneChip Human Gene 1.0 ST arrays til 16 timer ved 45 ° C og 60 rpm, som beskrevet i Gene Chip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix). Efter hybridisering blev chips farves og vasket i GeneChip Fluidik Station 450 (Affymetrix), og scannet under anvendelse af en GeneChip Array scanner 3000 7G (Affymetrix). Til statistisk analyse blev en afsløring opkald (Present /Fraværende) genereret af Affymetrix microarray suite 5 (MAS5) algoritme. De scannede rå filer blev importeret til statistiske programmeringsmiljø R (Version2.3), til yderligere analyse med værktøjer til rådighed fra BioConductor Project. Expression data blev normaliseret og log2-transformeret, ved hjælp af den robuste multichip gennemsnit (RMA) metode implementeret i BioConductor pakken RMA (M2, M3). For at reducere støj i betydningen analyse, probe sæt, der ikke udviste en opdagelse opkald på mindst 50% af prøverne blev filtreret fra. Højt udtrykte gener, som viste en 2-gange ændring i ekspression blev selekteret. Resultaterne blev klassificeret ved hjælp af hierarkiske clustering algoritmer implementeret i TMEV software 4.0. Array data blev deponeret på Gene Expression Omnibus med tiltrædelsen nummer GSE59501.

Statistisk analyse

In vitro

eksperimentelle data blev indhentet fra forsøgene gentages tre gange i tre eksemplarer. Middelværdier blev beregnet, og signifikans blev bestemt under anvendelse af Students to-halet test.

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Etablering af irinotecan-resistente cellelinier

Før generere en coloncancercellelinie med erhvervet resistens over for irinotecan, testede vi cytotoksicitet irinotecan på flere kolorektale cancer cellelinjer til at identificere den mest følsomme én. Otte cellelinjer, den LoVo cellelinjen var den mest følsomme over for irinotecan (Fig 1A). Cytotoksiciteten af ​​irinotecan til parentale og resistente LoVo (LoVo-R) celler blev bestemt under anvendelse af CCK-8 assay. De LoVo-R-celler var mere resistente over for irinotecan end de parentale LoVo celler. IC

50 værdier af LoVo-R og forældreorlov LoVo var 10 uM og 1,5 uM, hhv. Vi har etableret flere resistente cellelinier under anvendelse af forskellige slutkoncentrationer af irinotecan. Men tilsvarende niveauer af IC

50 blev fundet på tværs af de resistente cellelinier med forskellige endelige koncentrationer af irinotecan (figur 1B). Modstanden i LoVo-R8 cellelinje blev bekræftet under anvendelse af et klonogent assay (Fig 1C). Den LoVo-R8 cellelinie indrettet til irinotecan i en endelig koncentration på 8 uM. Det er velkendt, at irinotecan specifikt inhiberer DNA-replikation ved at fange topoisomerase I i DNA-strenge, inducerer en cellecyklusstandsning i G

2 fase. For at undersøge virkningen af ​​irinotecan på cellecyklusprogression af LoVo-R8-celler, vi yderligere analyseret cellecyklussen af ​​denne cellelinie (figur 1D). De LoVo parentale celler, der blev behandlet med 5 pM af irinotecan udviste alvorlig G

2 /M anholdelse. Efter 24 timers behandling med irinotecan (5 uM), cellecyklusstandsningen på G

2 /M-fase blev kun set i de parentale LoVo celler, men de LoVo-8R-celler behandlet med eller uden irinotecan viste ingen forskel i deres cellecyklusprogression.

(A) følsomhed otte kolon cancercellelinier til irinotecan blev målt under anvendelse af CCK-8 assay. For CCK-8-assayet blev cellerne eksponeret for irinotecan ved givne koncentrationer i 72 timer før måling. Cellelevedygtigheden blev præsenteret som procent i forhold til ubehandlede celler. (B) Modstanden af ​​etablerede LoVo celler til irinotecan blev målt under anvendelse af CCK-8 assay og (C) den klonogene overlevelse assay. Kolonier, der overlevede klonogene overlevelse assayet blev målt efter yderligere inkubering i yderligere 14 dage. (D) cellecyklusprogression af LoVo-R8. *

s

≤ 0,05.

Gen-ekspression array analyse af irinotecan-resistente LoVo-R8 celler

Efter fastsættelse af irinotecan-resistente LoVo-8R-cellelinjer, undersøgte vi deres genekspressionsprofiler hjælp mikromatrice. Ved hjælp af et filter kriterium mindst 2-gange ændring med

s

0,05, antallet af gener med ændringer i ekspression i LoVo-8R-celler, i forhold til deres parentale LoVo celler, blev bestemt. I alt 599 og 566 gener var opreguleret og nedreguleret henholdsvis tegner sig for 3,5% af de samlede gener probet (Fig 2A og 2B). En funktionel annotation af disse gener blev udført under anvendelse af et gen ontologi-baseret analyse af biologiske egenskaber. Generne blev kategoriseret i 15 funktionelle grupper (fig 2a og 2b). De fleste af disse gener blev forbundet med det inflammatoriske respons, angiogenese, celleproliferation, eller cellevandring.

Gener blev selekteret under anvendelse af et filter kriterium på mindst en 2-fold ændring i forhold til kontrolgruppen med

p

0,05. Gener med ændret ekspression i irinotecan-resistente LoVo cellelinie, sammenlignet med den oprindelige LoVo cellelinien, er kategoriseret i 15 funktionelle grupper baseret på gen ontologi. De gen-tal vises i grafer (A) og undersøgt gen numre i denne array analyse og procentvise værdier af de markant ændrede gener præsenteres i en tabel (B). (C) Hierarkisk klyngeanalyse af de irinotecan-resistent LoVo celleekspressionsvektorer microarrays. En klynge-baserede repræsentation af ændrede gener i irinotecan-resistente celler med intensitet, normaliseret til den parentale LoVo cellelinje. Gener, der blev opreguleret i forhold til parentale LoVo celler er vist med rødt, og dem, der blev nedreguleret er vist med grønt. Ekspressionsniveauerne af disse gener blev ændret ≥1.5 gange eller ≤0.6 gange i irinotecan-resistente LoVo cellelinier, sammenlignet med den oprindelige LoVo cellelinie. Gene symboler er vist i den rigtige række.

En hierarkisk clustering zonekort (Fig 2C) viser de mønstre af ændringer i genekspression niveauet i de irinotecan-resistente LoVo celler. I alt 24 gener blev vist at være involveret i irinotecan pathway eller være cellecyklusstandsning-relaterede gener, baseret på en analyse af biologiske egenskaber udføres under anvendelse af gen ontologi. Der blev fundet i alt 53 veje, baseret på Kegg pathway analyse. Hele klyngedannelse zonekort præsenteres som supplerende data i S1 Fig. Vi analyserede også funktionerne af kendte gener involveret i irinotecan pathway af kolorektale cancerceller. CYP3A4 og CYP3A5 er involveret i dannelsen af ​​carbonyloxycamptothecin, en inaktiv metabolit af irinotecan. RNA niveauer af to ATP-bindende kassette transmembrane proteiner (ABC), ABCG2 (kendt som brystkræft modstand protein) og ABCB1 blev dramatisk opreguleret i irinotecan-resistente celler (Fig 2C og S1 tabel). Dette er ikke overraskende i betragtning af, at udstrømning af irinotecan i tumorceller er afsløret som en potentiel strategi for at overvinde resistens.

Angivelse af gener involveret i vejen af ​​DNA skader checkpoint

Til finde nye markører relateret til irinotecan modstand, undersøgte vi ekspressionen af ​​flere gener involveret i DNA beskadigelse checkpoint signalering. Irinotecan-sensitive LoVo-celler viste en samme niveauer i CTIP (CtBP interagerende protein) og TopBP1 (topoisomerase (DNA) II-bindende protein 1) ekspression, på en dosis-afhængig måde. I irinotecan-resistente LoVo celler, CTIP udtryk var mere eller mindre forøget. Imidlertid blev ekspressionen af ​​TopBP1 ikke ændret. CHK1 (CHEK1, checkpoint kinase 1) blev aktiveret ved 5 uM af irinotecan i de parentale LoVo celler. Imidlertid blev CHK1 ikke aktiveret i LoVo-8R celler behandlet med den samme koncentration af irinotecan (figur 3A). Derfor viste kun phosphoryleret CHK1 et differentielt ekspressionsmønster i irinotecan-følsomme versus-resistente celler (S2 Fig). Aktiveringen af ​​CHK1 ved udsættelse for ioniserende stråling (IR) eller UV-stråling var normal i irinotecan-følsomme og resistente celler (Fig 3B). , Phosphoryleringsniveauet af CHK1 som respons på IR og UV var dog højere i irinotecan-sensitive LoVo celler. Disse resultater gjorde os yderligere at undersøge cellecyklusstandsning-relaterede gener, at finde nye markører til irinotecan modstand.

(A) Ekspression af adskillige gener involveret i DNA beskadigelse respons i irinotecan-resistente celler. CHK1 blev aktiveret ved 5 uM i forældrenes LoVo celler, men resistente LoVo celler viste ikke aktivering af CHK1. (B) DNA-skader, såsom IR og UV-induceret aktivering af CHK1 i LoVo og LoVo-8R celler. Phosphorylering af CHK1 som respons på IR (10 Gy) og UV (50 J /m

2) var højere i LoVo celler end i LoVo-8R-celler. Graf viser phosphorylering niveau CHK1. Forskellene blev betragtet som signifikante ved

s

0,05 ved t-test. *, Sammenligning mellem LoVo celler vs LoVo-R8 celler.

Sestrin3 knockdown forbedret irinotecan celle cytotoksicitet i resistente LoVo celler

For at finde markører for irinotecan modstand, vi analyserede opreguleret gener fundet at være involveret i cellecyklusstop, baseret på microarray data. Sestrin3 blev dramatisk opreguleret i LoVo-R8-celler (tabel 1). Sestrin3 knockdown påvirkede ikke toksiciteten af ​​irinotecan til forældrenes LoVo celler. Den relative mængde Sestrin3 mRNA-niveauet blev forøget i LoVo-R8-celler, og western blot analyse viste Sestrin3 proteinniveauet blev også forøget i LoVo-R8-celler (Fig 4A og 4B). Ved hjælp af qPCR analyse blev Sestrin3 afskrift bekræftet at blive nedreguleret ved transfektion siSESN3, men levedygtigheden af ​​LoVo celler blev ikke påvirket af siSESN3 behandling (Fig 4C). Sestrin3 knockdown faldt modstanden af ​​LoVo-R8 celler irinotecan, reducere IC

50 værdi til 4 um (Fig 4D). Sestrins, en familie af stress-inducerbare proteiner, deler en høj grad af homologi med det bakterielle AhpD protein, der er ansvarlig for at katalysere reduktionen af ​​peroxiredoxins. Vi målte ROS akkumulering under kontrollerede Sestrin3 niveauer i hver cellelinje (figur 4E). LoVo-R8-celler viste en lavere ROS akkumulering end deres parentale LoVo celler. Sestrin3 knockdown forøget ROS-produktion i begge celletyper.

(A) Den relative mængde Sestrin3 mRNA-niveauet blev forøget i LoVo-R8 celle ved realtime PCR. (B) I henhold til opreguleret Sestrin3 udskrift viste western blot analyse Sestrin3 proteinniveauet blev også øget i LoVo-R8. Behandling af Sestrin3 siRNA (siSESN3) effektivt nedreguleret protein niveau af øget Sestrin3 i LoVo-R8. (C) Sestrin3 udskrift blev nedreguleret ved transfektion siSESN3 i qPCR-analyse (til venstre). LoVo celler var modtagelige for irinotecan med dosisafhængig, og levedygtighed LoVo blev ikke påvirket selv under siSESN3 behandling (til højre). Cellerne blev behandlet med siSESN3 i 48 timer. Dyrkningsmedier blev ændret med mediet indeholdende den angivne koncentration af irinotecan og yderligere inkuberet i 72 timer. Cellelevedygtigheden præsenteres som procentdelen i forhold til den for ubehandlede celler. (D) Sestrin3 transskript blev også nedreguleret i LoVo-R8 ved transfektion siSESN3 i qPCR analyse (til venstre). LoVo-R8-celler var resistente over for irinotecan, men blev ændret til være modtagelige for irinotecan ved siSESN3 behandling (til højre). (E) Fluorescens billeder af intracellulære ROS farvet med den CellRox grønne reagens. Celler blev transficeret med kontrol siRNA eller siSESN3. ROS blev målt efter 48 timer. (F) Western blot, der viser proteinniveauer af AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, p70S6K, og p-p70S6K i LoVo og LoVo-R8 med eller uden irinotecan. (G) Graf, der viser niveauerne af proteiner. Forskellene blev betragtet som signifikante ved

s

0,05 ved t-test. *, Sammenligning mellem gruppe uden irinotecan vs gruppe med 10 pM irinotecan i LoVo og LoVo-R8; #, Sammenligning mellem LoVo vs LoVo-R8.

Dernæst undersøgte vi fosforylering af AMPK, mTOR, og p70S6K at undersøge, om Sestrin3 påvirker modstanden mod irinotecan gennem AMPK /TORC1 vej ( fig 4F og 4G). LoVo-R8-celler viste højere ekspressionsniveauer af AMP aktiveret protein kinase (AMPK) og af AMPK phosphorylering end parentale LoVo celler. Phosphorylering af mTOR og S6K (p70S6 kinase), blev en mTORC1 substrat steget i LoVo-8R celler. Desuden viste LoVo-8R celler konstitutiv aktivering af AMPK og mTOR med eller uden irinotecan sammenlignet med LoVo celler.

Diskussion

Irinotecan er blevet bredt vurderet som enkeltstof og i kombination regimer med andre kemoterapeutiske lægemidler. Efter godkendelse til behandling af metastatisk kolorektal cancer, er irinotecan blevet anvendt til at behandle en række andre cancere, herunder lungekræft, mavekræft, hjernetumorer og brystcancer. Imidlertid har lægemiddelresistens af tumor til irinotecan begrænset sin effektivitet i kliniske behandlinger. Vi har etableret en stabil cellelinie, der er resistent over for irinotecan. Den mest følsomme cellelinie blev valgt blandt otte kolorektale cellelinjer, baseret på cytotoksicitet assays. Vi inducerede kronisk modstand ved at udsætte celler i stigende dosis af irinotecan. For at bekræfte deres tilpasning blev celler, der har erhvervet resistens dyrkes i en stoffri medium for tre passager. Efter dyrkning i medikamentfrit medium, de LoVo-R8 celler, som var resistente over for irinotecan fastholdt til det samme niveau som de frisk etablerede celler. Mikroarrayet data blev analyseret for at identificere centrale gener, der spiller en vigtig rolle i resistens over for irinotecan. blev opnået i alt 1165 differentielt udtrykte gener (DEGS). En Gene Ontology berigelse analyse viste, at niveauet af Sestrin3 dramatisk blev forøget. Imidlertid ekspressionsniveauerne af de to andre medlemmer af Sestrin familien, Sestrin1 og Sestrin2, blev ændret lidt. Sestrins er en familie af højt konserverede, stress-reagerende proteiner. Sestrin1 og Sestrin2 er transkriptionelt reguleret af p53. Sestrin3, reguleret af forkhead transskription faktor, udviser oxidoreduktase aktivitet

in vitro

. Det er blevet rapporteret, at SESN3 kan beskytte celler mod oxidativt stress ved at modulere peroxiredoxin (Prx) regenerering [10]. Vi forventede, at Sestrin1 og Sestrin2 ekspression ville være opreguleret fordi forskellige DNA damage midler er kendt for at påvirke cellecyklusprogression via p53-aktivering. Fra vores array-data, S2 tabel viser ekspressionsniveauerne af Sestrins samt generne vedrørende p53 pathway. Af de 24 gener identificeret i denne undersøgelse som indblandet i den irinotecan vej for kolorektal cancer, ekspressionsniveauerne af

CES1

CES2

(involveret i omdannelsen af ​​den pro-drug til irinotecan ) blev formindsket med ca. 25%. Af de 24 gener, dem der koder ATP bindende kassette (ABC) proteiner involveret i udstrømning, såsom

ABCB1

ABCG2

, var de mest up-regulerede gener. Resistens over for irinotecan påvirkes af DNA reparationssystemer.

ERCC1

ERCC2

, der deltager i nukleotid excision reparation, viste en vis stigning i deres udtryk. Men udtryk for

MLH1

MLH6 Hotel (involveret i misforhold reparationsprocessen) ændret sig meget lidt. Af de 24 gener, har de involverede i apoptosecyklus ikke nogen forskel i udtrykket mellem irinotecan-følsomme og irinotecan-resistente celler. I betragtning af disse variationer i genekspression, kan være erhvervet resistens over for irinotecan i LoVo-R8-celler på grund af nedsat cellulær ophobning af irinotecan eller til omdannelse af irinotecan til en aktiv metabolit, fordi SN-38 blev nedsat til en vis grad.

Irinotecan behandling er associeret med G2 cellecyklusstandsnings. Vi undersøgte den kategori af cellecyklus arrest i Gene ontologi, for at finde de centrale målsætninger for cellecyklus-medieret resistens. Sestrin3 blev vist at modulere Prx regenerering i cancerceller. Ekspressionsniveauet af Sestrin3 blev forøget gennem transkriptionel aktivering med FOXO1. Mens Sestrin familien er impliceret i redox kontrol [5, 8, 12], har nylige undersøgelser vist rolle Sestrins i mTORC1 signalering. mTORC1 inhiberes af medlemmer af Sestrin familie (SESN1 /2), gennem AMPK-medieret aktivering af TSC1 /2-komplekset [12]. Sestrin3 er blevet rapporteret at hindre mTORC1, baseret på den konstatering, at FOXO1 /3a transkriptionel opregulering af Sestrin3 provenuet til at aktivere AMPK /TSC1 /2, som i sidste ende hæmmer mTORC1 aktivitet [13]. Derudover mTORC1 aktivering fører til ophobning af ROS, hvilket resulterer i aktiveringen af ​​JNK /FOXO signalering, og en positiv feedback sløjfe af Sestrin ekspression [5, 14]. Men den rolle Sestrin3 i onkogenese og modstandsdygtighed over for kræftlægemidler forbliver tvetydig. Undersøgelse af AMPK /mTOR pathway i LoVo og LoVo-R8-celler viste, at AMPK signal blev aktiveret i irinotecan behandlede celler eller irinotecan-resistente celler (fig 4F). Generelt forventes det, at mTOR signalering under inhibering med aktiv AMPK ville inducere autofagi [15]. I vores undersøgelse dog AMPK aktivering ikke hæmmer mTOR. Selvom mTOR signalering er tæt forbundet med AMPK signal og er i virkeligheden nedstrøms til AMPK, TSC1 /2 og Rheb er hub molekyler af mTOR-signalvejen integrere forskellige indgange [16, 17]. Vores undersøgelse afslører en positiv snarere end en negativ regulering forhold mellem AMPK og mTOR.

Vores resultater og fortolkninger blev fokuseret på antioxidant effekt af Sestrin3 på resistens over for kræftmedicin. Generelt kræftceller undergår aerobe glycolysen at tilfredsstille den høje næringsstof efterspørgsel pålagt den cellulære og ekstracellulære miljø ved deres hurtige spredning. Krav om øget energiproduktion bringe cancerceller til ansigt alvorlig oxidativ stress, som aktiverer forskellige forsvarsmekanismer og reparationsmekanismer mod genotoksiske lægemidler, skønt ROS også kan fungere som specifikke sekundære budbringere ved signalering kaskader involveret i celleproliferation og differentiering. I kræftceller, kan ophobning af ROS stimulerer celleproliferation, mutagenese, og genomisk instabilitet [18, 19]. Følgelig er en ophobning af store mængder af ROS påvist i celler transformeret med den

RAS

onkogen [18, 20, 21].