PLoS ONE: Afgørende rolle TSC-22 i Forhindre proteasomalaktivitet Nedbrydning af p53 i Livmoderhalskræft Cancer

Abstrakt

p53 tumorsuppressorfunktion kan kompromitteres i mange tumorer ved den cellulære antagonist HDM2 og human papillomavirus onkogen E6 at inducere p53 nedbrydning. Restaurering af p53 aktivitet har en stærk terapeutisk potentiale. Her identificerede vi TSC-22 som et nyt p53-interagerende protein og vise sin roman funktion som en positiv regulator af p53. Vi fandt, at TSC-22-niveau blev signifikant nedreguleret i livmoderhalskræft væv. Desuden overekspression af TSC-22 var tilstrækkelig til at inhibere celleproliferation, fremme cellulær apoptose i cervicale cancerceller og undertrykke væksten af ​​xenograft-tumorer i mus. Ekspression af også TSC-22 forstærkede proteinniveauet af p53 ved at beskytte den mod poly-ubiquitinering. Når de er bundet til motivet mellem aminosyrerne 100 og 200 af p53, TSC-22 inhiberede HDM2- og E6-medieret p53 poly-ubiquitinering og nedbrydning. Følgelig ektopisk overekspression af TSC-22 aktiveret p53, efterfulgt af forøget ekspression af p21

WAF1 /Cip1 og PUMA i humane cervikale cancercellelinier. Interessant, har TSC-22 ikke påvirke interaktionen mellem p53 og HDM2. Knock-down af TSC-22 ved små interfererende RNA klart forbedret poly-ubiquitinering af p53, hvilket fører til nedbrydning af p53. Disse resultater antyder, at TSC-22 virker som en tumorsuppressor ved at sikre p53 fra poly-ubiquitinering medieret-nedbrydning

Henvisning:. Yoon CH, Rho SB, Kim ST, Kho S, Park J, Jang IS, et al. (2012) afgørende rolle, TSC-22 i Forhindre proteasomalaktivitet Nedbrydning af p53 i livmoderhalskræft. PLoS ONE 7 (8): e42006. doi: 10,1371 /journal.pone.0042006

Redaktør: Qian Tao, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Juni 29, 2011; Accepteret: 2 jul 2012; Udgivet: August 1, 2012 |

Copyright: © Yoon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev primært støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (20110026217) og delvist bistået af Korea Basic Science Institute NAP tilskud (T3278B) og den interne bevilling fra Sydkorea National Institute of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, dicision at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

TGF

β

stimuleret klon 22 (TSC-22) blev først identificeret som en TGF

β

-inducerbare gen i mus osteoblastiske celler. TSC-22-ekspression induceres i en række forskellige cellelinjer af TGF

β

, phorbolester, serum og progestin og positivt regulerer TGF

β

signalering [1], [2 ]. TSC-22 indeholder en leucin-zipper-lignende motiv, men det behøver ikke en DNA-bindende motiv i den N-terminale region. TSC-22 kan homodimerize og heterodimerisere med TSC-22 homologt gen-1 (THG-1), og har transskriptionsrepressor aktivitet [3].

Nogle forskere har identificeret de fysiologiske roller TSC-22 i den udviklingsmæssige behandle. TSC-22 er nødvendig for gastrulation under tidlig embryogenese i

Xenopus laevis

[4] og for oogenese i

Drosophila

[5]. Det er også blevet foreslået, at TSC-22 inducerer erythroidcelle og Cardiac myofibroblastdifferentiering via aktivering af transkriptionsaktivitet Smad3 og Smad4, og antagonisering af Smad7 som reaktion på TGF

β

-afhængig signalering [6], [ ,,,0],7].

Desuden har flere undersøgelser fokuseret på tumorsuppression funktioner TSC22. TSC22 menes at være en potent tumorsuppressor i spyt cancerceller [8], [9] humane gastriske carcinomaceller [10], hepatisk carcinom [11], humane astrocytiske tumorer [12], og store granulære lymfocytter leukæmi [13]. De detaljerede mekanismer i tumor suppressor funktionen TSC22 er blevet rapporteret sammen med den hypotese, at TSC-22 undertrykker udtryk for de anti-apoptotiske gener

Gadd45b

Lzts2

[11], negativt regulerer Ras /Raf signalering [14] og inddrages i TGF-b-medieret gastrisk carcinom celledød i en caspase3-afhængig måde [10]. På den anden side er TSC22-medieret apoptotisk aktivitet inhiberes af interaktionen mellem TSC-22 og fortillin, efterfulgt ved at føre til TSC-22 destabilisering [15].

(A) Samlet RNA blev fremstillet fra patienter ‘ kræft prøver og

TSC-22

mRNA niveau blev derefter evalueret med real-time RT-PCR. Cx; serienummer vævsprøver fra patienter. (B)

HeLa

Caski

celler blev udpladet på plader med 6 brønde. Efter 24 timer blev cellerne inficeret med Ad-

TSC-22

eller Ad-

LacZ

. Ved de angivne tidspunkter blev celleantal bestemt ved MTT-assay til analyse af celleproliferation satser. (C)

HeLa

celler inficeret med Ad-

TSC22

eller Ad-

LacZ

blev dyrket i de angivne tidsrum, og cellerne blev derefter farvet med propidiumiodid (PI ). Sub-G1 cellepopulation (døde celler) og cellecyklus profil af PI-farvede celler blev analyseret ved flowcytometri efter PI-farvning. (D) DNA-fragmentering blev udført ved at isolere kromosomal DNA fra 1 × 10

6 antal

HeLa

Caski

celler inficeret med Ad-

TSC22

eller ad-

lacZ

i 72 timer (til venstre). Efter 3 dage infektion af Ad-

TSC-22,

p53, Puma, p21, E6 og TSC22 udtryk blev analyseret ved Western hybridisering (til højre).

p53 er en vel- kendt tumorsuppressorgen, der fungerer ved at aktivere transkription af dets målrettede gener, såsom p21, PUMA, PKR og BAX [16] – [18]. p53-funktioner reguleres af post-translationelle modifikationer såsom phosphorylering, acetylering, og ubiquitinering. Det er godt forstået, at p53-niveauer er stramt reguleret af MDM2-medieret ubiquitinering via en auto-regulerende feedback-sløjfe [19], [20]. Lejlighedsvis, er reguleringen af ​​p53-ekspression korrelerede med tumorigenese gennem infektion med human papilloma virus, der udtrykker E6, hvilket fører til ubiquitinmedieret p53 nedbrydning [21], [22]. Selv om reguleringen af ​​p53 er blevet undersøgt via flere ruter relateret til tumorigenese, mange spørgsmål forbliver om tumor hæmning mekanisme i p53 pathway.

Da den mekanisme bag netværket af tumorsuppressorgener endnu ikke har været eksplicit belyst, gennemførte vi et cDNA microarray analyse af genekspressionsprofilen i cancervæv for at finde hidtil ukendte tumorrelaterede gener. Vi fandt, at TSC-22 ekspression blev signifikant reduceret i livmoderhalskræft væv sammenlignet med normalt væv. Efterfølgende vi undersøgt romanen funktion TSC-22 under tumorigenese. Vi har derfor foretaget en gær to-hybrid assay til screening for nye TSC-22-bindende proteiner. Fra denne blev p53 identificeret som en TSC-22-bindende protein. Vi fandt også, at TSC-22 kunne øge aktiviteterne i p53 gennem hæmning af HDM2 og E6-medieret ubiquitinering ved direkte binding til p53. På den anden side, TSC-22 overekspression stabiliseret p53-protein-niveau, hvilket fører til øget celledød og inhibering af celleproliferation. Endelig blev tumorvæksthastighed stærkt reduceret ved ekspression af TSC-22 i en xenograft tumor model. Taget sammen indikerer disse resultater, at TSC-22 spiller en afgørende rolle i inhibering af tumorvækst gennem regulering af p53 ubiquitinering.

(A) TSC-22 og p53 cDNA-konstruktioner blev cotransformeret ind i EGY48 gærceller til test for protein-protein-interaktion i gær to-hybrid-system. Transformanter blev analyseret for deres evne til at vokse på medium, der mangler leucin (venstre) og for β-galactosid-ekspression (højre). (B)

HeLa

celler og

Caski

celler blev inficeret med Ad-

TSC-22

for de angivne tider. Proteinniveauer blev analyseret ved Western blot med DO-1 antistof mod p53, anti-TSC-22 antistof og anti-β-actin antistof som en loading kontrol. (C)

HeLa

celler blev transficeret med 1 ug Flag-TSC-22 ekspressionsvektor. 24 timer efter transfektion, p53, Puma, p21, og TSC22 ekspression blev analyseret ved Western blotting og semikvantitativ RT-PCR med protein og totalt RNA fremstillet fra hver cellelinje. (D)

HeLa

celler, der stabilt udtrykker shRNA specifikt for TSC-22 og ikke-targeting kontrol shRNA blev analyseret for at bestemme protein- og mRNA ekspressionsniveauer af p53 og Puma. (E) Luciferase aktiviteten af ​​p53RE (ansvarlig element) -driven promotor blev vurderet med transfektion af den angivne mængde Flag-TSC-22-plasmidet i

HeLa

celler (øverste panel). Aktivitet af p53RE-promotoren blev vurderet i

sh-con

sh-TSC-22

udtrykke

HeLa

celler (nederste panel) ved luciferaseassays. (F) En ug Flag-TSC-22 eller Flag-mock vektor blev transficeret i

p53

+ /+ eller

p53

– /-

HCT116 Salg celler. Ved 48 timer efter transfektion blev cellelysaterne analyseret ved Western blotting med de angivne antistoffer. (G) Stabilitet af p53 protein blev vurderet i

HeLa

celler inficeret med Ad-

TSC-22

eller Ad-

LacZ

. 24 timer efter infektion blev celler behandlet med cycloheximid (50 ug /ml) i de angivne tidsperioder. Cellelysater blev analyseret ved Western blotting med anti-p53 antistof (DO-1) med β-actin som en belastning kontrol.

Resultater

TSC22 inhiberer tumorvækst

for at analysere den specifikke genekspression profil livmoderhalskræft, vi gennemførte cDNA microarray analyse med cDNA fremstillet af patienternes livmoderhalskræft væv. Interessant nok viste vores microarray data,

TSC-22

genekspression blev mærkbart reduceret i alle cancer prøver (data ikke vist). Vi derefter udført realtids-PCR (RT-PCR) analyse for at bekræfte microarray resultater. Som vist i figur 1A,

TSC-22

mRNA ekspressionsniveauer i patienternes cancer væv blev signifikant reduceret sammenlignet med dem i normalt væv.

Disse resultater førte til yderligere spørgsmål. Det første spørgsmål var, om TSC-22 kunne undertrykke tumorcelleproliferation eller ej. Derfor har vi smittet

HeLa

(HPV-18) og

Caski

(HPV-16) celler med adenovirus udtrykker

TSC-22

eller

LacZ

(infektionskontrol). Som vist i figur 1B, blev spredning forholdene mellem begge celler signifikant reduceret med infektion med Ad

TSC-22

. Vi næste undersøgt, om TSC-22 kunne fremkalde cellecyklusstop og apoptose i

HeLa

celler. Vi fandt, at G0 /G1 befolkning dramatisk blev øget blandt Ad-

TSC-22-

inficerede celler sammenlignet med i Ad-

lacZ

inficerede celler indenfor 48 timer efter infektion. Endvidere er de fleste Ad-

TSC-22-

inficerede celler undergik apoptose i det sene stadie (figur 1C). Vi næste vurderet kromosomal-DNA-fragmentering at observere TSC-22-induceret apoptose i

HeLa

og

Caski

celler. Som vist i figur 1D, kromosomale DNA fra Ad-

TSC-22

inficerede

HeLa

Caski

celler viste meget høj grad af fragmentering. Desuden blev p21 (cellecyklus inhibitor) og PUMA (apoptose inducer) ekspressionsniveauerne markant forbedret i Ad-

TSC-22

inficeret

HeLa

Caski

celle (figur 1D højre panel). Disse virkninger var mere markant i kronisk HPV18-inficerede

HeLa

celle. p53 og TSC22 niveau i HeLa-celler blev knap nok detekteret sammenligne (d) at CaSki celler (figur 1D højre panel). Vi spekulere, at deres forskellige udtryk er forårsaget af forskellige serotype af HPV. Disse resultater viser, at overekspression af TSC-22 inducerede høje niveauer af celledød. Vores resultater tyder på, at TSC-22 spiller en central rolle i cervikal vækst af tumorceller og død.

ektopisk udtrykte TSC-22 interagerer med ektopisk udtrykt p53 i

H1299

celler. To ug Flag-TSC-22 ekspressionsvektor blev cotransficeret med Flag-p53-ekspressionsvektor (A) eller en ikke-mærket p53 ekspressionsvektor (B) ind i

H1299

celler dyrket i 100 mm plader. 48 timer efter transfektion blev cellelysater immunopræcipiteret med et anti-p53 (DO-1) (A) eller anti-Flag (B) monoklonalt antistof. Immunopræcipitater blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af et HRP-konjugeret anti-Flag (A) eller anti-p53 (FL393) (B) monoklonalt antistof. (C-D) TSC-22 samvirker med endogent p53. Ektopisk udtrykte TSC-22 interagerer med endogene p53 i celler. HEK293 celler blev transficeret med 2 ug Flag-TSC-22-plasmidet i 48 timer. Cellelysater blev immunpræcipiteret med anti-p53 (DO-1) monoklonalt antistof, mus-immunoglobulin G (IgG) (C), eller et anti-Flag (D) monoklonalt antistof. Immunopræcipitater blev analyseret med Western blotting under anvendelse af et HRP-konjugeret anti-Flag (C) eller anti-p53 (FL393) antistof.

TSC-22 binder til

s

53 i en gær to-hybrid assay

som det fremgår af vores data, TSC-22 bidrager til inhibering af cancercellevækst og celledød. Dette var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der påviser, at TSC-22 er en potentiel tumorsuppressor [8] – [11], [13], [23] – [25]. For at belyse de mekanismer, der ligger til grund denne funktion, vi screenet for TSC-22-bindende proteiner under anvendelse af en gær to-hybrid assay. Gennem dette, blev p53 identificeret som en TSC-22-bindende protein (figur 2A, venstre panel). Samspillet mellem TSC-22 og p53 blev således demonstreret

in vitro

af både cellevækst og en β-galactosidase assay (figur 2A, højre panel).

Bestemmelse af virkningerne af TSC- 22 på

s

53

for bedre at forstå virkningerne af TSC-22 på p53,

HeLa

Caski

celler blev inficeret med Ad-

TSC-22

eller

LacZ

for at øge perioder. Interessant, blev endogene p53 niveauet steget betydeligt ved transfektion af Ad-

TSC-22

i en tidsafhængig måde (Figur 2B). Styrkelsen af ​​p53-ekspression var mere markant i

HeLa

celler end i

Caski

celler. For at observere en forbedring af p53 target gen aktivitet ved ekspression af TSC22, Flag-mærket TSC-22 blev indført i

HeLa

celler. p53 protein og dets målgener, herunder p21 og puma, var klart fremkaldt af flag-

TSC-22

udtryk (figur 2C). Omvendt banke-down TSC-22 i

HeLa

celler reducerede protein niveauer af p53 og PUMA (figur 2D). Imidlertid blev niveauet af p53 mRNA ikke påvirket af knock-down og overekspression af TSC-22 (figur 2C og 2D, nederste panel).

For at afgøre om p53-aktivitet er reguleret af TSC-22-ekspression i

HeLa

celler, vurderede vi

p53RE

(ansvarlig element) -driven promotor-aktivitet med TSC-22-ekspression og knock-down af TSC-22 i

HeLa

celler . En promotor, der huser et

p53RE

blev aktiveret ved TSC-22 ekspression i en dosis-afhængig måde. På den anden side blev promotoraktiviteten faldt med TSC-22 knock-down. Disse data antyder, at p53-medieret transkriptionel aktivitet reguleres af TSC-22 (Figur 2E). For at vurdere, om fald i PUMA og p21 er forårsaget af direkte regulering af p53 af TSC-22, Flag-tagget

TSC-22

plasmid blev indført i

HCT116 p53

+ /+

og

p53

– /-

celler. Øget ekspression af PUMA blev observeret i

p53

+ /+

men ikke

p53

– /-

celler (Figur 2F). Dette resultat tyder på, at reguleringen af ​​PUMA og p21 ved TSC22 er afhængig af p53. For yderligere at undersøge forbedringen af ​​p53 af TSC-22, vurderede vi p53 stabilitet i Ad-

TSC-22

eller Ad-

LacZ

inficeret

HeLa

celler efter cycloheximid behandling . Som vist i figur 2 G, Ad-

TSC-22

stærkt forbedret og stabiliseret endogene p53 niveauer. Disse resultater antyder, at TSC-22 fremmer tumor suppressor p53 ved at øge stabiliteten af ​​p53-protein.

(A) Skematisk diagram viser cDNA-konstruktioner for FLAG-mærket p53 deletionsmutanter og fuld længde p53 og angiver TSC22 bindende domæne. (B)

H1299

celler blev transficeret med de anførte plasmider, der koder FLAG-mærket p53 deletionsmutanter sammen med Flag-TSC-22-plasmidet. Cellelysater blev immunpræcipiteret med anti-p53 polyklonalt antistof FL393 (venstre) eller DO-1 monoklonalt antistof specifikt for den N-terminale område (til højre), efterfulgt af Western blotting under anvendelse af de angivne antistoffer. Lysater (5%) blev også fyldt på en SDS-gel til Western blotting under anvendelse af et anti-Flag-antistof (nederst i hvert panel). (C) Skematisk diagram, der viser cDNA-konstruktioner af flag-mærket TSC-22 deletionsmutanter (venstre panel).

H1299

celler blev transficeret med de angivne plasmider, der koder for Flag-mærket TSC22 deletionsmutanter sammen med Flag-p53 plasmid. Cellelysater blev immunpræcipiteret med et anti-p53 antistof (FL393); co-immunpræcipiteret TSC22 blev detekteret ved Western blotting under anvendelse af HRP-konjugeret anti-Flag-antistof (højre, midterste panel). Lysat (5%) blev analyseret ved Western blotting hjælp af en anti-Flag-antistof (højre, nederste panel).

TSC-22 binder sig til

s

53

in vivo

for at bestemme om TSC-22 interagerer med p53 i pattedyrceller, vi transficeret

H1299

human lunge ikke-småcellet karcinom celler med Flag-TSC22 ekspressionsplasmid og ^ p53 udtryk plasmid, og derefter udført co-immunfældning og Western blot assays. Vi fandt, at TSC-22 specifikt co-immunpræcipiteret med p53 i celler, der udtrykker både Flag-TSC22 og p53, men ikke i celler, der udtrykker enten protein alene (figur 3A). Omvendt p53 specifikt co-immunpræcipiteret med TSC-22 med anti-Flag-antistof (figur 3B), hvilket tyder på en vekselvirkning mellem TSC-22 og p53. Dernæst forsøgte vi at bekræfte den endogene samspil mellem p53 og TSC-22. Da vi ikke kunne købe en passende TSC-22 antistof til anvendelse i en co-immunopræcipitering eksperiment blev denne interaktion bekræftet ved gensidig co-immunpræcipitering med endogent p53 og eksogent udtrykte Flag-tagget TSC-22 i HEK293-celler, der udtrykker høje niveauer af p53 (figurerne 3C og D). Resultaterne tyder på, at TSC-22 direkte interagerer med p53.

TSC-22 binder til p53 i regionen, herunder aminosyrer 100 til 200

For yderligere at definere regionen afgørende for binding TSC-22 til p53, genereret vi flere p53 deletionsmutanter (figur 4A). Ekspressionsplasmider af p53 og TSC-22 blev transficeret ind i

H1299

celler sammen eller alene. Som vist i figur 4A og B, TSC-22 var i stand til at binde til p53 adskillige delvise deletionsmutanter herunder p53

1-300, p53

101-393, og p53

1-200. Imidlertid er yderligere deletering af en del af det indre område af det DNA-bindende domæne, såsom p53

1-100, p53

201-393, p53

301-393 og p53

201-300, afskaffet p53-TSC22 binding (figur 4A og B). Disse resultater indikerer, at regionen, herunder aminosyrerne 100-200, som er en del af p53-DNA-bindende domæne, der kræves til binding TSC-22. Efterfølgende identificere p53 bindende region af TSC-22, Flag-tagget trunkerede TSC-22 mutanter, der hver indeholdt en α-helix blev udtrykt med p53 som vist i fig. 4C. I samarbejde immunopræcipitation eksperimenter ved hjælp af en anti-p53 antistof (DO-1), TSC-22

54-154 blev co-immunpræcipiteret med p53, men TSC-22

1-110 og TSC-22

54-110 var ikke. Disse data antyder, at p53 binder aminosyrer 110 til 154 ifølge TSC-22. Desværre kunne vi ikke yderligere bekræfte den detaljerede vekselvirkning af p53-TSC-22, fordi TSC-22

110-154 blev ikke til udtryk i vores forsøg (figur 4C). Tilsammen vores data viser, at TSC-22 og p53 interagerer på bestemte domæner i hvert protein.

(A) TSC22 hæmmer HDM2-medieret p53 ubiquitinering.

H1299

celler blev transficeret med de anførte plasmider. De transficerede celler blev behandlet med MG132 (20 uM) i 5 timer før høst. Cellelysater blev immunpræcipiteret med et anti-HA-antistof. Ubiquitineret p53 blev påvist ved Western blotting med et anti-p53 antistof (DO-1). Ubiquitineret p53 er angivet som Ub (n) p53 (øverste panel). Udtrykket af den samlede p53, er HDM2, Flag-TSC-22 og HA-Ub proteiner vist i de nederste paneler. (B) TSC-22 afbryder ikke interaktion mellem p53 og HDM2.

H1299

celler blev transficeret med Flag-p53 sammen med Flag-TSC-22 eller et Flag-mock vektor i nærvær af en HDM2 ekspressionsvektor. Cellelysater blev immunpræcipiteret med anti-p53 (DO-1) antistof efterfulgt af Western blotting under anvendelse af de angivne antistoffer. Lysat (5%) blev analyseret ved Western blotting under anvendelse viste antistoffer (nederste panel). (C) TSC-22 inhiberer E6-medieret p53 ubiquitinering.

H1299

celler blev transficeret med de anførte plasmider i nærvær af en HA-Ub ekspressionsvektor. 48 timer efter transfektion blev de transficerede celler behandlet med MG132 (20 uM) i 5 timer, før de blev høstet. Cellelysater blev immunpræcipiteret med et anti-HA-antistof. Ubiquitineret p53 blev påvist ved Western-blotting med anti-p53 antistof (DO-1). Ubiquitineret p53 er angivet som Ub (n) p53 (øverste panel). Udtrykket af den samlede p53, er Myc-E6, Flag-TSC-22, og HA-Ub proteiner vist i de nederste paneler. (D) TSC-22 forstyrrer ubiquitinering af p53 i

HeLa

celler.

HeLa

celler blev cotransficeret med Flag-TSC-22 eller et Flag-mock vektor og HA-Ub ekspressionsvektoren. 48 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 20 pM MG132 i 5 timer før høst. Cellelysater blev immunpræcipiteret med et anti-HA-antistof. Ubiquitineret p53 blev påvist ved Western blotting med et anti-p53 antistof (DO-1). (E) Stabil TSC-22 knock-down eller kontrol

HeLa

celler blev behandlet med 20 pM MG132 i 5 timer før høst. Ubiquitinering af p53 blev analyseret som beskrevet ovenfor.

TSC22 Forhindrer HDM2 og E6-medieret p53 Poly-ubiquitinering

For at bestemme om forøgelse af p53 stabilitet ved TSC-22 skyldes hæmning p53 ubiquitinering,

H1299

celler blev transficeret med HDM2, p53, og TSC-22 ekspressionsplasmider, og behandlet med proteasomalaktivitet inhibitor MG132 i 6 timer for at gennemføre

in vivo

Ubiquitineringsassays . Som vist i figur 5A, blev p53 stærkt ubiquitinerede med ekspressionen af ​​HDM2. Imidlertid blev yderligere HDM2-medieret p53 ubiquitinering signifikant inhiberet af ekspressionen af ​​TSC-22 (figur 5A). Dernæst ønskede at bestemme, hvorvidt inhiberingen af ​​HDM2-medieret p53 ubiquitinering af TSC-22 skyldes afbrydelse af vekselvirkningen mellem HDM2 og p53. Derfor indførte vi p53, HDM2, og TSC22 ekspressionsplasmider i

H1299

celler som vist i figur 5B. p53 blev derefter immunpræcipiteret fra celleekstrakterne med DO-1-antistof. Interessant, viste dette eksperiment, at p53 samtidig var bundet til HDM2 og TSC-22. Desuden blev p53-HDM2 interaktion ikke afbrudt af ekspression af TSC-22. Disse data antyder, at TSC-22 kan beskytte p53 fra HDM2-medieret ubiquitinering ved direkte binding til p53 i en region adskilt fra HDM2 bindingssted.

(A) HDM2 og Myc-E6 blev transficeret med angivne plasmider i

H1299

celler. De transficerede celler blev behandlet med MG132 (20 uM) i 5 timer før høst. Cellelysater blev immunpræcipiteret med et anti-HA-antistof. Ubiquitineret p53 blev påvist ved Western blotting med et anti-p53 antistof (DO-1). Ubiquitineret p53 er angivet som Ub (n) p53 (øverste panel). Udtrykket af den samlede p53, er HDM2, Flag-TSC-22 og HA-Ub proteiner vist i de nederste paneler. (B) Flag-tagget vildtype (WT) eller mutant TSC22

1-110 blev co-transficeret med de anførte plasmider i

H1299

celler. De transficerede celler blev behandlet med MG132 (20 uM) i 5 timer før høst. Cellelysater blev immunpræcipiteret med et anti-HA-antistof. Ubiquitineret p53 blev påvist ved Western blotting med et anti-p53 antistof (DO-1). Ubiquitineret p53 er angivet som Ub (n) p53 (øverste panel). Udtrykket af den samlede p53, er HDM2, Flag-TSC-22 og HA-Ub proteiner vist i de nederste paneler. (C) Nøgne mus blev inokuleret med 1 x 10

6

HeLa

celler ved subkutan injektion. Subkutane tumorer afledt af

HeLa

celler blev behandlet med adenovirusvektorer som angivet. Tumorvolumener er vist som middelværdien af ​​mindst fem mus pr gruppe (n = 10.-14 per gruppe). Bars = SD. (D) Effekt af TSC-22-behandling på ekspressionsniveauet af p53 i HeLa celle-afledte tumorer udskåret ved 27

th dag efter behandling, bestemt ved immunoblotanalyse. Repræsentant immunoblot af de tre prøver fra hver gruppe.

Vi næste forsøgt at vise, at TSC-22 kan beskytte p53 fra E6-medieret ubiquitinering fordi E6 og HDM2 bindende domæner af p53 overlap. p53 var stærkt ubiquitinerede med ekspressionen af ​​E6 i

H1299 Salg celler (figur 5C, bane 3); Imidlertid er yderligere ekspression af TSC-22 klart blokeret E6-medieret p53 ubiquitinering (Figur 5C, bane 4). Vi næste brugt

HeLa

celler, der konstitutivt udtrykte E6 at undersøge TSC-22-medieret p53 stabilitet under fysiologiske betingelser. Ubiquitinering af p53 blev stærkt forøget efter MG132 behandling i cellerne. I modsætning hertil denne ubiquitinering forsvandt klart ved overekspression af TSC-22 (figur 5 D). p53 ubiquitinering blev reddet ved ekspression af shRNA specifikt for TSC-22 i

HeLa

celler i fravær af MG132 (figur 5E, Lane 2). Men forskellen i niveauet af p53 ubiquitinering var ikke signifikant mellem

sh-con

sh-TSC-22

celler i nærvær af MG132. Vi nærmere effekten af ​​TSC-22 på p53 ubiquitinering ved ekspression af både HDM2 og E6. Som vist i figur 6A blev niveauet af p53 ubiquitinering dramatisk induceret af både HDM2 og E6. Men begge HDM2 og E6-medieret p53 ubiquitinering blev stramt afbrudt af TSC-22-ekspression (figur 6A). Desuden testede vi, om TSC-22-p53 interaktion er afgørende for at inhibere p53 ubiquitinering. Som vist i figur 6B, C-terminal deletionsmutant TSC-22

110, som ikke reagerer med p53 (figur 4C), hæmmede ikke HDM2 og E6-medieret-p53 ubiquitinering (Figur 6B). Dette resultat viser, at TSC-22 inhiberer p53 ubiquitinering via direkte interaktion. Disse data tyder på, at TSC-22 direkte interagerer med p53 og blokerer E6 og /eller HDM2-medidated p53 ubiquitinering, efterfulgt af stabilisering af protein p53.

TSC-22 blænder tumorvækst i nøgne mus

Vi næste afgøres, om TSC-22 hæmmer tumorvækst

in vivo

. Eksponentielt voksende

HeLa

cervicale cancerceller blev injiceret subkutant i immun-deficiente nøgne Balb /c-mus. Når tumorvolumen nåede ca. 100 mm

3, 1 x 10

9 pfu adenovirus, der udtrykker TSC-22 eller

LacZ

blev injiceret i tumorerne. Efter tre sekventielle intratumoral injektioner af adenovirus blev dyrene (5-7 pr gruppe) monitoreres for tumorvækst. Tumorvækst og morfologi blev analyseret i løbet af 30 dage. Figur 6C viser, at tumormassen i mus injiceret med Ad-TSC-22 bemærkelsesværdigt var reduceret sammenlignet med tumorer injiceret med Ad-

LacZ

eller som var ubehandlet. Derefter undersøgte vi effekten af ​​TSC-22 på p53 stabilisering i tumorvæv høstet fra kontrol og TSC-22-behandlede mus. TSC-22-transfektion blev observeret at øge ekspressionsniveauet af p53-protein (figur 6D). Kollektivt, disse resultater viser tydeligt, at TSC-22 kan være en potent tumorsuppressor i denne dyremodel.

Diskussion

I vores søgen at identificere gener, der er forbundet med livmoderhalskræft udvikling af kræft, udtryk mønster analyser efter cDNA microarray eksperimenter og RT-PCR viste, at

TSC-22

genet blev konsekvent reduceret i tumorvæv (fig. 1A). Adskillige tidligere undersøgelser rapporteret, at TSC-22 er nedreguleret i humane spytkirtel tumorer [23], mus levertumorer [11], og humane hjernetumorer såsom astrocytomer [26]. Disse resultater antyder, at nedregulering af TSC-22 kan spille en rolle i udviklingen af ​​cancer i forskellige væv. Men disse tidligere rapporter ikke løse problemet med TSC-22 reduceres i kræftceller. En rimelig forklaring er, at TSC-22 kan inhibere cancercellevækst udvikling. Vores resultater viste, at TSC-22 dramatisk inhiberede celleproliferation og celledød ved ekspression med et adenovirus-ekspressionssystem (figur 1C og D). Tilsvarende er forøgelse af TSC-22-ekspression forbundet med forøget apoptose i humane gastriske carcinomceller [10].

Da TSC-22 er en transskription repressor [3], rolle TSC-22 i tumor suppression er blevet foreslået af Mari

et al

. [11]. Gennem forsøg med TSC-22 siRNA, denne gruppe viste, at DNA-skader-inducerbart gen 45 β (Gadd45ß) og formodede tumor suppressor 2 (Lzts2) er formodede mål for TSC-22. Imidlertid blev de relationer, hvorigennem disse mål spiller afgørende roller i tumor undertrykkelse af TSC-22 ikke direkte afsløret. I vores forsøg på at finde en hidtil ukendt funktion af TSC-22 i tumor suppression, der er konstateret vi et bindende protein i en gær to-hybrid eksperiment. Denne undersøgelse viste, at TSC-22 direkte binder til p53 (figur 2A). Vi bemærkede endvidere, at TSC-22 opreguleret de proteinniveauer af p53 uden at ændre niveauerne af p53-mRNA. TSC-22 overekspression og knock-down eksperimenter viste, at TSC-22 letter funktionen af ​​p53 som en transskriptionel aktivator af målgener, som kan hæmme tumorigenese (figur 2C-G). Disse resultater indikerede, at øget p53-proteinniveauer er forbundet med post-translationel regulering af TSC-22. TSC22-p53 interaktion blev vurderet ved

in vivo

analyser, hvor p53 blev co-immunpræcipiteret med TSC-22 (Figur 3-4).

Over-ekspressionen af ​​TSC-22 klart forhindret ubiquitinering p53 ved HDM2, som regulerer p53 omsætning gennem dets E3-aktivitet. Flere regulatorer, der påvirker p53 funktion via modulation af HDM2-p53 interaktion er blevet identificeret, herunder p14ARF [27], [28], YY1 [29], gankyrin [30], L11 [31], Daxx [32], Numb [ ,,,0],33], og Nucleostemin [34]. . Blandt disse regulatorer, Numb er mest ligner TSC-22, fordi Numb binder til p53 og HDM2, derved forhindre ubiquitinering og nedbrydning af p53 [33]

Ja, vi har registreret et ternært kompleks, der indeholder alle tre proteiner: TSC-22, HDM2 og p53. Således ikke TSC-22 ikke konkurrere med HDM2 om binding til p53. TSC-22 binder til DNA-bindende domæne af p53, hvilket er afgørende for p53-funktion. Derfor er det fortsat skal afgøres, om denne interaktion er nødvendig for at aktivere målgener af p53 i kernen.

Interessant, øget celledød og hæmning af spredning af TSC-22-ekspression blev observeret hyppigere i

420−1.75×A

550)]/(time×volume×A

600).

Co-immunoprecipitation

To