PLoS ONE: Karakterisering af MUC1-C cytoplasmatisk domæne som en kræft Target

Abstrakte

Mucin 1 (MUC1) er en heterodimer protein, der udtrykkes afvigende i menneskets forskellige carcinomer og visse hæmatologiske maligniteter. Den onkogene MUC1 transmembrane C-terminale subunit (MUC1-C) funktioner i en del ved at transducere vækst og overlevelse signaler fra celleoverfladereceptorer. Imidlertid vides der kun lidt om strukturen af ​​MUC1-C cytoplasmatisk domæne som potentielt mål lægemiddel. Anvendelse af fremgangsmåder til strukturelle forudsigelser, vores resultater viser, at et højt konserveret CQCRRK sekvens, som støder op til cellemembranen, danner en lille lomme, der udsætter de to cysteinrester til dannelse disulfidbindinger. Derimod resten af ​​MUC1-C cytoplasmatiske domæne har nogen tilsyneladende struktur, i overensstemmelse med et i sig selv uordnet protein. Vores undersøgelser således fokuseret på at målrette MUC1 CQCRRK regionen. Resultaterne viser, at L- og D-aminosyre-CQCRRK-holdige peptider binder direkte til CQC motiv. Vi viser desuden, at D-aminosyre peptid, betegnet GO-203, blokerer homodimerisering af MUC1-C cytoplasmatiske domæne in vitro og i transficerede celler. Desuden GO-203 binder direkte til endogen MUC1-C i bryst og lunge kræftceller. Colokalisering undersøgelser viser yderligere, at GO-203 overvejende binder til MUC1-C ved cellemembranen. Disse resultater understøtter den videre udvikling af midler, der er målrettet MUC1-C cytoplasmatisk domæne CQC motiv og dermed MUC1-C funktion i kræftceller

Henvisning:. Raina D, Agarwal P, Lee J, Bharti A, McKnight CJ , Sharma P, et al. (2015) Karakterisering af MUC1-C cytoplasmatisk domæne som Cancer Target. PLoS ONE 10 (8): e0135156. doi: 10,1371 /journal.pone.0135156

Redaktør: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, INDIEN

Modtaget: April 8, 2015; Accepteret: 17 Juli 2015; Udgivet: 12. august 2015

Copyright: © 2015 Raina et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under uddeler CA097098 og CA166480, http: //www.cancer. gov (DK). Genus Oncology ydet støtte i form af løn til forfattere D.R. og S.K. LeadInvent ydet støtte i form af løn til forfattere P. A. og P.S. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i “forfattere bidrag afsnittet”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Jeg har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser : DK har egenkapital i Genus Onkologi og er konsulent for selskabet. Tilknytningen af ​​Genus Onkologi og LeadInvent med dette arbejde ændrer ikke vores tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

epitel er lag af sideværts forbundne celler med apikal-basal polaritet der er beskyttet mod det eksterne miljø med en mukøse barriere [1]. Mucin familie af secernerede og transmembrane glycoproteiner udviklet sig i metazoans at yde beskyttelse af epithel, at linje (i) den respiratoriske og gastrointestinale skrifter, og for eksempel (ii) kanaler i specialiserede organer [1]. Mucin 1 (MUC1) er en transmembrane medlem af denne familie, der blev identificeret ved dets overekspression i humane brystcancer [2]. MUC1 består af to underenheder, der stammer fra autospaltning af et enkelt polypeptid og til gengæld danner et heterodimert kompleks ved den apikale membran af normale epitelceller [1]. Den MUC1 N-terminale underenhed (MUC1-N) indeholder tandem 20-aminosyre (aa) gentagelser, som ændres af

O

-glycans. Den MUC1 C-terminale underenhed (MUC1-C) er transmembrane komponent af heterodimeren og forankrer MUC1-N til celleoverfladen. MUC1 overudtrykkes i forskellige carcinomer, understøtter den antagelse, at opregulering af MUC1-N /MUC1-C-kompleks udgør sår tvivl om sin normale funktion til at fremme overlevelsen af ​​cancerceller [1]. I denne forbindelse og i over at deltage i slimhinderne barriere, glycosyleret MUC1-N kan forstærke celleoverfladereceptor funktion at understøtte vækst og overlevelse [3]. Desuden og i forbindelse med tab af polaritet, MUC1-C vekselvirker med celleoverflademolekyler, såsom receptortyrosinkinaser, og fremmer deres aktivering og nedstrøms signalering [4]. Betydeligt, overekspression af MUC1-C er tilstrækkelig til at give forankringsuafhængig vækst og tumorigenicitet, understøtter den onkogene funktion af denne underenhed [5].

MUC1-C består af et 58-aa ekstracellulært domæne, en 28- aa transmembran region og en 72-aa cytoplasmisk domæne. Den MUC1-C ekstracellulære domæne indbefatter et NPG motiv med asparaginresten underlagt

N

-glycosylation [6]. Binding af galectin-3 til at glycosyleret NPG stedet fremmer dannelsen af ​​ekstracellulære broer mellem MUC1-C og andre celleoverflademolekyler, såsom den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) [6]. Den MUC1-C cytoplasmatisk domæne (MUC1-CD) indeholder en CQC motiv støder op til det transmembrane område, som er nødvendig og tilstrækkelig til dannelsen af ​​MUC1-C homodimerer [7,8]. Vigtigt er, mutation af CQC motiv til AQA blokke import af MUC1-C til kernen og mitokondriske ydre membran [7,9,10]. Desuden CQC → AQA mutation modvirker MUC1-C onkogen funktion, understøtter betydningen af ​​MUC1-C homodimerisering i kørsel intracellulære signaler, der bibringer vækst og overlevelse [7,11]. Derfor har MUC1-C CQC motiv dukket op som et attraktivt mål for udviklingen af ​​peptid og småmolekylære inhibitorer, der blokerer MUC1-C homodimerisering og funktion [12,13].

De foreliggende studier har undersøgt strukturen af MUC1-C cytoplasmatisk domæne baseret på dens potentielle betydning som en cancer target. Vi viser, at MUC1-C cytoplasmatisk CQC motiv består i en druggable konfiguration, og at den resterende del af det cytoplasmiske domæne er ustruktureret, i overensstemmelse med andre onkogene molekyler, som styrer aktiveringen af ​​multiple signalveje [14]. Vi viser også, at MUC1-C cytoplasmatiske domæne selektivt kan målrettes med peptider, der direkte binder til CQC motiv og blokerer MUC1-C homodimerisering in vitro og i celler.

Materialer og metoder Salg

Molecular Dynamics

MUC1-CD (aminosyrer 1-15) struktur blev bygget

ab-inito

med de foretrukne phi /psi vinkler af de respektive aminosyrer. Den resulterende atomare struktur med eksplicitte vandmolekyler og ioner blev undersøgt uden en membran bi-lag ved hjælp Assisted Model Building med Energy Refinement (GUL) [15]. Efter stabilisering trin minimering, varme og ligevægt, korte 15 ns simuleringer blev udført for at generere 1500 konformationer adskilt af 10 picosekunder, hvilket yderligere blev analyseret for Root Mean Square Afvigelse (RMSD). I yderligere undersøgelser blev MUC1-C membran region, som har en overvejende helix konformation som forudsagt af THMHMM og TMPred, indsat i en præ-equalibrated 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) bi -laget og solvatiseret med eksplicit vand og ioner. De resterende cytoplasmatisk domæne aminosyrer blev bygget med deres foretrukne phi /psi vinkler. Nanoscale molekylær dynamik (NAMD) [16] blev anvendt til at udføre molekylær-dynamik undersøgelse.

NMR Analyse af MUC1-CD

Hans-MUC1-CD blev udtrykt fra pET-MUC1- CD plasmid (Novagen, Billerica, MA) og den

15N-mærket protein blev fremstillet som beskrevet [17]. NMR-prøve bestod af 1,7 mg /ml His-MUC1-CD, 1% D

2O, referenceforbindelsen TMSP (250 uM) og 10 mM d

10-DTT. PH blev justeret til 5,0 ved tilsætning af 1 M HCI. Én og to dimensionelle

15N heteronukleare enkelt kvante kohærens (HSQC) dataindsamlinger blev udført ved 20 ° C og 10 ° C på en 500 MHz Bruker Advance III NMR-system ved Boston University Core facilitet for strukturel NMR. Dataanalyse blev dannet ved anvendelse Bruker s topspin software.

Måling af bindingsaffiniteter

bindingsaffiniteter FITC-GO-202 og FITC-GO-203 blev bestemt ved mætningsbinding metoden [18]. I korte, 96-brønds glutathion eller nikkel-belagte plader (Thermo Fisher, Waltham, MA) blev inkuberet med 150 pi PBS-buffer indeholdende 21.45 ug /ml GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) eller His-MUC1-CD natten over ved 4 ° C efterfulgt af vask med 50 mM Tris og 150 mM NaCl indeholdende 0,1% Tween-20 (TBST) og blokering med 0,5% BSA i TBS. Pladerne blev derefter vasket 3 gange med TBST. FITC-GO-202 eller FITC-GO-203 blev tilsat til brøndene på 0,19 uM til 25 uM. Ikke-specifik binding blev bestemt i nærværelse af GST alene. Pladerne blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C på et rysteapparat efterfulgt af vask 3 gange med bindingsbuffer. Fluorescensintensitet blev bestemt på en Infinite M1000 PRO Tecan Microplate Reader (Tecan, NC) med excitation ved 490 nm og emission ved 525 nm. GraphPad Prism 4.0 Software (San Diego, CA) blev anvendt til at beregne ligevægtsdissociationskonstanten (Kd) af en ikke-lineær regressionsmetode.

Complex Karakterisering ved MALDI-TOF-MS

Binding blev udført eksperimenter med MUC1-CD og GO-203 som beskrevet [19]. Komplekser blev elueret fra glutathion-perler, dialyseret og opkoncentreret ved anvendelse af Amicon ultra centrifugal filtre (Millipore, Billerica, MA). Komplekserne blev derefter underkastet ikke-reducerende elektroforese og farvet med Coomassie Blue. Proteinbånd blev udskåret og analyseret ved MALDI-TOF-MS som beskrevet [20]. Kort fortalt blev geler skåret i små, ensartede stykker; gelstykkerne blev dehydreret med acetonitril og derefter rehydreret i 100 mM ammoniumbicarbonat efterfulgt af 2 vask og tørring cyklusser med ammoniumbicarbonat og acetonitril, hhv. Efter fuldstændig dehydrering blev gelstykker suspenderet i 12,5 ng /pl trypsin i 50 mM ammoniumbicarbonat (50 pi). In-gel digestion blev udført ved 37 ° C i 10-12 timer, og prøverne blev forsuret med 50 pi 0,5% TFA. Tredive pi af denne blanding blev afsaltet ved C-18, som indeholder Zip-Tip (Millipore, Billerica, MA). Trypsinlignende fordøjede peptider blev analyseret ved MALDI-TOF-MS (ABI-4800). MALDI-TOF-MS analyser blev udført ved anvendelse af en reflektor metode, der blev optimeret til erhvervelse for massen intervallet 700-3500 amu. Der blev indsamlet og analyseret ved hjælp af Data Explorer softwarepakke (AB-Sciex, Framingham, MA) og MASCOT (ver.2.0.04, Matrix Science, Boston, MA). MS-bro-analyse blev udført ved hjælp af Protein Prospector (ver.4.27.2 grundlæggende og ver.5.0, UCSF). Databasesøgningen parametre var: (i) tryptisk fordøjelse, (ii) oxideret Met, (iii) 2 ubesvarede spaltninger, og (iv) disulfidbro med maksimal link molekyler sat til 2 og en masse tolerance på 50 ppm. Searching blev gennemført mod GST-MUC1-CD og GO-203.

Plasmid Construction

Vektorer, der udtrykker GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) og Hans-MUC1-CD , GFP-MUC1-CD og FLAG-MUC1-CD er blevet beskrevet [7]. His-mærket MUC1-CD (rotter og hunde) blev klonet i pET28a vektor (Clontech, Mountain View, CA) og udtrykt i

E

.

coli

BL21 (DE3).

In Vitro

Dimerisering

Renset His-MUC1-CD blev inkuberet i PBS eller stigende mængder af GO-203 i 1 time ved stuetemperatur, som beskrevet [19]. Proteiner blev derefter adskilt i ikke-reducerende polyacrylamidgeler og analyseret ved immunoblotting.

Cell Culture

Humant ZR-75-1 brystkræft (ATTC) og H1975 lungekræft (ATTC) cellelinjer var dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (HI-FBS), 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin. 293T-celler blev dyrket i DMEM med 10% HI-FBS, antibiotika, og 2 mmol /l L-glutamin. Celler blev behandlet med FITC-konjugeret-GO-202 (FITC-GO-202), FITC-GO-203 eller ukonjugeret GO-203 syntetiseret ved MIT Biopolymer Laboratory (Cambridge, MA) og AnaSpec, Inc. (San Jose, CA). Den p3XFLAG-CMV-10 (Sigma, St. Louis, MO), pEGFP-C1 og pDsRed-monomer-N1 (Clontech, Mountain View, CA) vektorer blev anvendt til transfektion af rotter og hunde MUC1-CD og fuld længde human MUC1 i 293T-celler i nærvær af Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY).

Immunopræcipitation og immunoblotanalyse

Cellelysater blev fremstillet som beskrevet [19]. Opløselige proteiner blev immunopræcipiteret med anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO), anti-MUC1-C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) eller en kontrol-IgG. Bundfaldene og lysater ikke underkastet immunpræcipitering blev immunoblottet med anti-MUC1-C, anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA), anti-FLAG og anti-FITC (Life Technologies, Grand Island, NY). Reaktivitet blev påvist med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og kemiluminescens.

Analyse af GO-203 Localization

293T-celler blev transficeret med MUC1-pDsRed-Monomer-N1 i nærvær af Lipofectamine 2000 48 timer. Cellerne blev derefter inkuberet med FITC-GO-203 i 3 timer og undersøgt under anvendelse af et Nikon-udfoldning wide-field epifluorescens system med en 100x olieimmersionslinse mål. Billeder blev taget med NIS-element software (Nikon) og analyseret af ImageJ software.

Resultater

Analyse af MUC1-C cytoplasmatiske domæne Struktur

For at definere strukturen i 72-aminosyre MUC1 cytoplasmatisk domæne (MUC1-CD), vi først anvendes flere betingelser til at generere krystaller med oprenset MUC1-CD-protein. Disse forsøg på krystallisering viste sig forgæves, hvilket fik os til at udforske molekylære simulering studier. Vi først henvendte sig til homologi modellering som en metode til at kortlægge de strukturelle aspekter af MUC1-CD. Især dog MUC1-CD udviste ringe eller slet ingen sekvenshomologi med kendte proteiner. Derfor vi studerede sekundære struktur forudsigelser for MUC1-CD ved hjælp af forskellige metoder, herunder ROBETTA [21] og IGB-SSPro [22]. Resultaterne af disse undersøgelser samlet angivet, at MUC1-CD ikke er i overensstemmelse med en typisk sekundær struktur.

Vi fokuserede derfor vores indsats på de første 15 aminosyrer af MUC1-CD (CQCRRKNYGQLDFIP) ved at studere dens atomistiske molekylær dynamik . Den MUC1-CD (1-15) model blev bygget

ab-inito

med de foretrukne phi /psi vinkler af aminosyrer. Den resulterende struktur blev derefter undersøgt med eksplicit vand og ioner. Brug af kort 15 nanosekund simuleringer (1500 konformationer adskilt af 10 picosekunder) med AMBER og som det fremgår af RMSD, vi fandt, at MUC1-CD (1-15) sekvens også er iboende ustruktureret uden foretrukne konformationer (Fig 1A). Desuden NMR-analyse af MUC1-CD bekræftede fraværet af et påviseligt sekundær struktur (figur 1B-1D) som vist ved tilstedeværelsen af ​​toppene mellem 7,5 og 8,5 ppm, i overensstemmelse med MUC1-CD er en ustruktureret protein.

(A) RMSD af snapshots opnået for den indledende

ab-initio

struktur MUC1-CD (1-15). Y-aksen er den RMSD og X-aksen er den snapshot sekvens (picosekunder). (B) Proton-NMR-spektre (1D) og

15N-HSQC-spektre af MUC1-CD (1-15) er erhvervet ved 500 MHz ved (C) 20 ° C og (D) 10 ° C ved pH 5,0.

MUC1-CD (1-15) indeholder en CQC motiv efterfulgt af tre positivt ladede rester (RRK). Det cytoplasmatiske CQCRRK region er placeret ved siden cellemembranen (forudsagt af TMPred Phobius) og derved kunne spille en rolle i MUC1-CD struktur som følge oplade-ladningsinteraktioner med de negativt ladede lipidlag. Vi studerede derfor den potentielle virkning af cellemembranen lipid lag på CQCRRK rester. En 45 aminosyre MUC1 sekvens (SAQSGAG-VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV-CQCRRKNYGQ) blev bygget

ab-initio

med en del af MUC1-C /ekstracellulære domæne (MUC1-C /ECD, SAQSGAG), den 28-aminosyre MUC1 -C /transmembrandomæne (MUC1-C /TMD; VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV) og de første 10 rester af MUC1-CD (CQCRRKNYGQ). Som bestemt af molekylære dynamik undersøgelser, at TMD har en overvejende helix kropsbygning (Fig 2A). De resterende aminosyrer blev bygget med deres foretrukne phi /psi vinkler. Den resulterende struktur blev indsat i et repræsentativt membran patch (POPC dobbeltlag) og atomistiske molekylære dynamik blev udført i 55 ns hjælp NAMD software. Vi observerede en ækvilibreret struktur med stabil RMSD og en foretrukken konformation (dreje) på CQC region (Fig 2A). Vi fandt også, at de to Arg-rester fortrinsvis orientere hen imod membranen på grund af charge-charge interaktioner med de negativt ladede phosphater lipiddobbeltlaget, hvorved der skabes en lille lomme til CQC motiv (fig 2B). Denne foretrukne lille lomme orientering, kombineret med sin nærhed til lipiddobbeltlaget, støttede den tanke, at de CQC motiv Cys rester har reduceret konformationel frihed, disponerer dem til at danne disulfid bindinger mere effektivt med begrænset entropisk straf.

(A ) Sekundær struktur fordeling af snapshots blev opnået med hensyn til simuleret tid og vurderes med DSSP algoritmen. Y-aksen er resten sekvens: (1 til 7-SAQSGAG), (8. 35 -VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV), (36 til 45 -CQCRRKNYGQ). X-aksen er tiden i picosekunder (ps). (B) Figuren viser en region af lipiddobbeltlaget fremhævet som lyserøde, røde og orange pinde repræsenterer phospholipid monomerer med den spiralformede MUC1-C TMD. De cytoplasmatiske rester af MUC1-C, der består af CQCRRK er fremhævet som en bold og stok model. De positivt ladede argininer er trukket op og låst mod de negativt ladede phosphatgrupper.

Binding Undersøgelser med MUC1 CQC Motif

MUC1-C CQC motiv giver dannelsen af ​​MUC1- C homodimerer nødvendige for MUC1-C funktionen [7,8]. Derfor genereres peptider indeholdende CQCRRKN ​​sekvens som potentielle midler, som kunne binde til CQC lommen og blokerer MUC1-C homodimerisering. Et sådant peptid, betegnet GO-202, indeholder en poly-Arg-sekvensen for celle-indtrængning knyttet til CQCRRKN ​​(L-aminosyrer, Fig 3A). GO-202 blev syntetiseret med en N-terminal FITC etiket til at evaluere direkte binding af dette peptid til GST-MUC1-CD bundet til glutathion-overtrukne ELISA-plader. Som bestemt ved mætningsbinding metode, dissociationskonstanten (Kd) var 0,88 pM (Fig 3A). Vi også vurderet binding af et peptid, betegnet GO-203, i hvilken poly-Arg cellepenetrerende domæne er bundet til CQCRRKN ​​(D-aminosyrer, fig 3B). Inkubation af FITC-mærket GO-203 til GST-MUC1-CD udviste Kd på 0,63 pM (Fig 3B). For at bekræfte specificiteten af ​​binding, blev FITC-GO-203 inkuberet med His-MUC1-CD bundet til nikkel-belagte ELISA-plader (fig 3C). I disse undersøgelser Kd var 0,86 uM, hvilket indikerer, at interaktionen mellem GO-203 og MUC1-CD’en ikke er tillagt ved GST eller His-tag. For at bekræfte specificiteten af ​​interaktionen, blev FITC-GO-203 også inkuberet med GST-MUC1-CD, hvor CQC motivet blev muteret til AQA. Her, ingen interaktion var tydelig mellem FITC-GO-203 og GST-MUC1-CD (AQA) som understøttes af påvisning af kun baggrundsfluorescens (data ikke vist). Disse resultater viser, at både L- og D-former af CQCRRKN ​​peptidet direkte binde til MUC1-CD og at binding er specifik for CQC motiv.

(A) Vist er det L-aa-sekvensen af ​​GO -202 og (B) D-aa-sekvensen af ​​GO-203. Den tilsyneladende Kd for binding af (A) FITC-GO-202 til GST-MUC1-CD, (B) FITC-GO-203 til GST-MUC1-CD og (C) FITC-GO-203 til His-MUC1-CD proteiner blev bestemt ved mætning bindende eksperimenter.

GO-203 Forms disulfidbindinger med MUC1-CD på CQC Motif

for yderligere at vurdere sammenslutning af GO-203 med MUC1-CD , GO-203 blev inkuberet med oprenset GST-MUC1-CD. Komplekserne blev separeret ved SDS-PAGE og tryptiske fordøjelser blev analyseret ved MALDI-TOF-MS (fig 4A). identifikationspeptid var baseret på MS-bro analyse af de tryptiske fordøjelse MALDI-TOF data mod sekvenserne af de 2 kendte komponenter i reaktionen, dvs. GST-MUC1-CD (S1 Fig) og GO-203. Peptiddimeren med en enkelt disulfidbro ved CQC motiv var repræsenteret ved toppen af ​​m /z 1483.6084 Da (Fig 4B) og egenskaberne i tabel 1. Denne top blev ikke observeret i de tryptiske fordøjelser af GST + GO-203 og GST-MUC1-CD prøver, hvilket indikerer, at GO-203 danner disulfid broer specifikt med MUC1-CD, og ​​ikke med GST.

(A) trypsinnedbrydningsprodukt af 35 kDa GST-MUC1-CD og go- 203-kompleks blev analyseret ved MALDI-TOF mass fingerprinting. (B) Det fremhævede område i (A) blev udvidet til at vise et specifikt peptid top ved en m /z 1483 Da skyldes dannelsen af ​​en disulfidbro mellem GO-203 og MUC1-CD.

GO-203 Blocks MUC1-CD homodimeriseringen

In vitro

MUC1-CD sekvens er begrænset til pattedyrarter have dukkede sent i evolutionen [6]. Den CQCRRK sekvens er konserveret i rotte, hund og humane proteiner (Fig 5A). Et protein sekvenshomologi analyse ved hjælp Clustal Omega yderligere vist, at menneskets MUC1-CD (AAA60019.1) aktier signifikant sekvenshomologi på 83% med MUC1-CD proteiner af rotte (AAI66505) og hund (NP_001181906.1) (Fig 5A). For at vurdere den funktionelle betydning af CQCRRK, skabte vi oprenset His-mærket rotte-MUC1-CD-protein (~ 10 kDa) (fig 5B). Inkubation af rotte His-MUC1-CD ved pH 7,4 var forbundet med dannelsen af ​​~ 20 kDa homodimerer (Fig 5B). Endvidere tilsætning af GO-203 ved stigende mængder i forhold til His-MUC1-CD faldt homodimerisering (Fig 5B). Hund og menneskelige His-mærket MUC1-CD proteiner også dannet homodimerer, der blev effektivt hæmmet af GO-203 (Fig 5C og 5D). Derimod CP-2 peptid, som omfatter AQARRKN, havde ingen virkning på menneskers MUC1-CD homodimerisering (Fig 5D).

(A) Menneske, rotter og hunde MUC1-CD-proteiner deler høj sekvenshomologi som opstillet under anvendelse Clustal Omega. De konserverede regioner er vist i kasserne, med det røde felt, der angiver CQCRRK region. (B) rotte og (C) hund oprenset His-MUC1-CD-proteiner blev inkuberet med PBS (kontrol) eller stigende mængder af GO-203 (50, 150 og 450 uM) i 1 time ved stuetemperatur. Proteinerne blev separeret på en ikke-reducerende polyacrylamidgel og analyseret ved immunoblotting med anti-MUC1-C. (D) Oprenset human His-MUC1-CD-protein blev inkuberet med PBS (kontrol), CP-2 (150 uM) eller GO-203 (150 uM) i 1 time ved stuetemperatur. Proteinerne blev adskilt i et ikke-reducerende polyacrylamid gel og analyseret ved immunoblotting med anti-MUC1-C.

GO-203 Blocks MUC1-CD homodimeriseringen i Celler

For yderligere at vurdere virkningerne af at målrette MUC1-CD CQCRRK motiv i celler, vi transficeret 293T-celler til at udtrykke rotte GFP-mærket eller FLAG-mærket MUC1-CD (fig 6A, til venstre). Co-immunpræcipitationseksperimenter studier viste, at FLAG-MUC1-CD danner dimerer med GFP-MUC1-CD (Fig 6A, højre). Især blev behandlingen af ​​de transficerede 293T-celler med GO-203 er forbundet med hæmning af FLAG-MUC1-CD /GFP-MUC1-CD komplekser (Fig 6A, højre). Derimod behandling med CP-2 havde ingen synlig effekt (figur 6A, højre). Transfektion af 293T-celler til at udtrykke tagged hund MUC1-CD (fig 6B, venstre og højre) eller humant MUC1-CD (fig 6C, venstre og højre) bekræftede dannelsen af ​​MUC1-CD homodimerer. Desuden GO-203 behandling resulterede i inhibering af MUC1-CD homodimerisering (Fig 6B, højre og 6C, højre). Desuden påvisningen af, at CP-2 behandling har ingen effekt på MUC1-CD homodimerdannelse støttede specificiteten af ​​målretning CQC motiv (fig 6B, højre og 6C, højre).

293T-celler blev transient transficeret til udtrykke en tom vektor og (A) rotte GFP-MUC1-CD og FLAG-MUC1-CD, (B) hund GFP-MUC1-CD og FLAG-MUC1-cd eller (C) humant GFP-MUC1-CD og FLAG-MUC1 -CD. Efter 48 timer blev cellerne efterladt ubehandlet (kontrol) eller behandlet med 5 pM GO-203 eller CP-2 hver dag i 3 dage. Cellerne blev derefter høstet til immunoblotting med anti-GFP og anti-FLAG (venstre paneler). Hele cellelysater blev også fældet med anti-FLAG, og præcipitaterne blev immunoblottedes med de angivne antistoffer (højre paneler).

Binding af GO-203 til Endogen MUC1-C i Celler

For at afgøre, om GO-203 medarbejdere med endogen MUC1-C, vi behandlede ZR-75-1 brystcancerceller med FITC-GO-203. Analyse af anti-MUC1-C udfældes ved immunoblotting med anti-FITC viste, at GO-203 danner komplekser med MUC1-C (Fig 7A). Lignende undersøgelser udført på FITC-GO-203-behandlede H1975 lunge kræftceller forudsat yderligere støtte til den opfattelse, at GO-203 medarbejdere med endogen MUC1-C (figur 7B). MUC1-C udtrykkes som en ~ 25-20 kDa N-glykosyleret form og som 17/15 kDa uglycosylerede arter [6,8]. Desuden MUC1-C er påviselig som homodimerer og højere orden oligomerer under ikke-reducerende betingelser som anvendt i disse eksperimenter [8]. I denne sammenhæng og som vist i hele immunblots opnået fra resultaterne præsenteret ovenfor (fig 7A og 7B), FITC-GO-203 interagerer med de forskellige MUC1-C monomere og oligomere former (S2A og S2B Fig). At definere lokalisering af GO-203 /MUC1-C-komplekser, blev immunfluorescens micoroscopy udført på 293T celler transficeret til at udtrykke DsRedMN1-mærket MUC1 og /eller behandlet med FITC-GO-203. Kontrol 293T celler inkuberet med Hoechst farvestof til farvning af kerner havde ingen påviselig dsRed eller FITC signaler (Fig 7C). Derimod i celler transficeret til at udtrykke DSRedMN1-MUC1, de dsRed signaler blev overvejende lokaliseret langs cellemembranen med et par prikker detekterbare i kernen (Fig 7D). I 293T celler behandlet med FITC-GO-203 alene blev FITC-signaler lokaliseret langs membranen og i cytosolen (Fig 7E). Desuden er der i 293T-celler, der udtrykker DSRedMN1-MUC1 og behandlet med FITC-GO-203, co-lokalisering af dsRed og FITC-signaler (Rød + Grøn → gul) blev observeret langs membranen (Fig 7F). Den lysere FITC-GO-203 farvning i 293T-celler, der udtrykker MUC1 sammenlignet med den i MUC1-null indstilling kunne forklares ved lagring af FITC-GO-203 i komplekser med MUC1-C ved cellemembranen.

(A) ZR-75-1 og (B) H1975 celler forblev ubehandlede (kontrol), og behandlet med 5 pM FITC-GO-203 natten over. Lysis blev udført i en ikke-reducerende buffer. Lysater blev præcipiteret med anti-MUC1-C eller kontrol IgG efterfulgt af tilsætning af ikke-reducerende prøvebuffer. Bundfaldene blev immunoblottet med anti-FITC og anti-MUC1-C. 293T-celler blev efterladt ubehandlet (C; kontrol), (D) transient transficeret med DsRedMN1-MUC1, (E) behandlet med 5 pM FITC-GO-203, eller (F) transficeret med DsRedMN1-MUC1 og behandlet med 5 pM FITC- GO-203. Fordeling af MUC1 (rød) eller FITC-GO-203 (grøn) og co-lokalisering (gul) blev vurderet ved immunfluorescensmikroskopi. Kerner blev modfarvet med Hoechst farvestof (blå).

Discussion

MUC1-C transmembrane underenheden interagerer med RTK’er, såsom EGFR, ved celleoverfladen og bidrager til deres aktivering og nedstrøms intracellulære signalveje [6,19,23]. Følgelig har der været voksende interesse for funktionen af ​​MUC1-C cytoplasmatiske domæne som et oncoprotein. I denne sammenhæng overekspression af MUC1-C cytoplasmatiske domæne er tilstrækkelig til at give forankringsuafhængig vækst og tumorigenicitet [5]. Hvordan MUC1-C cytoplasmatisk domæne inducerer transformation har været genstand for betydelig undersøgelse; dog lidt om strukturen af ​​denne onkogene protein. De foreliggende undersøgelser således undersøgt de fysiske egenskaber af den 72-aminosyre cytoplastic domæne og viser, at, bortset fra CQCRRK sekvens bopæl støder op til cellemembranen, den resterende del af dette protein har nogen tilsyneladende struktur.

Fraværet af identificerbare alfa-helixer eller beta-sheets var af interesse ved, at MUC1-C cytoplasmatiske domænesekvenser nedstrøms for CQC motiv er underlagt phosphorylering af flere kinaser, der indbefatter blandt andet, EGFR, MET, SRC, ABL, GSK3 og PKC [ ,,,0],1,4]. Til gengæld er disse post-translationelle modifikationer regulere vekselvirkninger mellem MUC1-C cytoplasmatisk domæne med effektorer af forskellige signalveje, der er forbundet med transformation [1,4]. Som ét eksempel phosphorylering af MUC1-C cytoplasmatiske domæne giver binding til WNT pathway effektor, β-catenin, og dermed aktiveringen af ​​Wnt målgener [5,24]. Andet arbejde har kædet MUC1-C cytoplasmatisk domæne til aktivering af NF-KB-p65 [25,26] og STAT1 /3 [27,28] veje. På denne måde den iboende uordnet struktur af MUC1-C cytoplasmatiske domæne har tilsyneladende evnen til at undergå forskellige post-translationelle modifikationer og til at interagere med flere effektorer.

Proteiner med intrinsisk uordnede strukturer findes i hele genomet og omfatter oncoproteiner, såsom p53 [29], PTEN [30], androgenreceptoren [31] og andre [14]. Disse proteiner kan præsentere udfordringer for lægemiddeludvikling da der ikke findes lommer eller veldefinerede tredimensionale folder [14]. Derfor har vi fokuseret på design af agenter, der er målrettet CQC motiv, baseret på observationer, at endogene MUC1-C danner homodimerer og CQC cysteiner er nødvendige og tilstrækkelige for denne interaktion [7,8]. Endvidere fandt vi, at mutere CQC motiv til AQA ophævet evne MUC1-C for at fremme transformation [7]. De foreliggende resultater viser, at en L-aminosyre [R]

9-CQCRRKN-indeholdende peptid (GO-202) binder direkte til MUC1-C cytoplasmatisk domæne. Interessant nok blev der opnået lignende resultater med en D-aminosyre [R]

9-CQCRRKN ​​peptid (GO-203), i overensstemmelse med en retro-inverso effekt, hvor CQC motiv er flankeret på begge sider af basiske aminosyrer. Specificitet af disse cystein-medierede interaktioner blev bekræftet i undersøgelser, der viser, at mutere CQC til AQA i MUC1-C cytoplasmatisk domæne eller i CP-2 kontrol peptid ophævet bindende.

I koncert med direkte binding til MUC1- C cytoplasmatisk domæne CQC motiv, GO-203 var effektivt forstyrre MUC1-CD homodimerer in vitro. Desuden GO-203 behandling inhiberede dannelsen af ​​GFP-MUC1-CD /FLAG-MUC1-CD homodimerer i celler, konsistent med intracellulær binding af GO-203 til mærkede MUC1-CD monomerer og derved blokerer tilgængeligheden af ​​MUC1-C cytoplasmatisk domæne CQC motiv for homodimerdannelse. I denne forbindelse og vigtigere, co-immunpræcipitationseksperimenter undersøgelser vist endvidere, at FITC-GO-203 forbinder med endogen MUC1-C i bryst og lunge kræftceller. Desuden konfokale undersøgelser indikerede, at GO-203 binder overvejende til MUC1-C ved cellemembranen. Disse resultater tilsammen understøtter opfattelsen af, at GO-203 binder til MUC1-C cytoplasmatisk domæne CQC motiv i celler og derved blokerer MUC1-C homodimerisering og funktion.