PLoS ONE: Cell Cycle-Dependent Rho GTPase Aktivitet dynamisk Regulerer Cancer Cell motilitet og invasion i Vivo

Abstrakt

Mekanismen bag Spatiotemporal styring af kræft celle dynamik og dens mulige forbindelse med celledeling har ikke været godt etableret. Ved at udnytte den intravital imaging teknik, fandt vi, at kræftcellen motilitet og invasive egenskaber blev tæt forbundet med cellecyklus.

In vivo

podning af menneskelige kolon cancerceller, der bærer fluorescens ubiquitinering-baserede cellecyklus indikator (Fucci) viste en uventet fænomen: S /G2 /M-celler var mere motile og invasiv end G1 celler. Microarray analyser viste, at

Arhgap11a

, en karakteriseret Rho GTPase-aktiverende protein (RhoGAP), blev udtrykt i en celle-cyklus-afhængig måde. Ekspression af ARHGAP11A i cancerceller undertrykte RhoA-afhængige mekanismer, såsom stress fiber dannelse og fokal vedhæftning, hvilket gjorde cellerne mere tilbøjelige til at migrere. Vi viste også, at RhoA undertrykkelse af ARHGAP11A induceret forøgelse af relativ Rac1 aktivitet, hvilket fører til en stigning i de invasive egenskaber. RNAi-baserede hæmning af Arhgap11a reducerede invasionen og

in vivo

udvidelse af kræft. Derudover analyse af humane prøver viste signifikant opregulering af

Arhgap11a

i tyktarmskræft, som var korreleret med klinisk invasion status. Den foreliggende undersøgelse tyder på, at ARHGAP11A, en cellecyklus-afhængige RhoGAP, er en kritisk regulator af kræft celle mobilitet og er således en lovende terapeutisk mål i invasive kræftformer

Henvisning:. Kagawa Y, Matsumoto S, Kamioka Y, Mimori K, Naito Y, Ishii T, et al. (2013) Cell Cycle-Dependent Rho GTPase Aktivitet dynamisk Regulerer Cancer Cell motilitet og Invasion

In Vivo

. PLoS ONE 8 (12): e83629. doi: 10,1371 /journal.pone.0083629

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: August 29, 2013; Accepteret: 5. november 2013; Udgivet: December 30, 2013 |

Copyright: © 2013 Kagawa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning om innovative områder (22113007), ved det første program fra Undervisningsministeriet, videnskab, sport og kultur i Japan, med tilskud fra den internationale human Frontier Science Program (RGY0077 /2011) ; og ved tilskud fra Takeda Science Foundation, Cell Science Research Foundation, Kanae Fonden til fremme af Medical Science, og Nakajima Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ubegrænset ekspansion på grund af ukontrolleret cellecyklus progression og øget penetration ind i den normale nabolandet miljø er en formidabel og livstruende aspekt af kræftceller. Faktisk har cellecyklusregulering været et stort forskningsemne inden for kræft cellebiologi.

Desuden kræft har meget dynamiske egenskaber, herunder invasion af omgivende væv, infiltration af den systemiske cirkulation, og banebrydende af en ny niche for kolonisering langt fra dens oprindelse [1], [2]. Selvom faktorer, der bestemmer kræftcelle mobilisering, såsom Rho familie små G-proteiner, er blevet grundigt undersøgt [3], sammenhængen mellem cellecyklus regulering og cellulære mobilitet af kræftceller fortsat uklart. For at belyse dette dynamiske samspil ville det være værdifuldt at overholde spatiotemporale egenskaber af cellecyklus regulering og celle mobilitet samtidig

in vivo

.

For nylig blev intravital multifoton mikroskopi ansat til dissekere intakte cellulære fænomener i forskellige biologiske systemer, såsom immunresponset [4], [5], inflammatoriske reaktioner [6], og knogle remodellering [7]. Denne avancerede billedbehandling teknik har gjort det muligt for os at forstå de dynamiske adfærd af levende celler i væv og organer. Kræftceller er også meget mobile og deres vandrende adfærd er blevet evalueret ved hjælp af denne imaging teknik [8] -. [10], selv om dens sammenhæng med den proliferative karakter af celler forbliver undvigende

Her lykkedes det at visualisere dynamisk hændelser under cancercelleinvasion og metastase ved hjælp intravital multifoton mikroskopi. Ved hjælp af fluorescerende ubiquitinering-baserede cellecyklus indikator (Fucci), en særlig fluorescerende protein sonde anvendes til overvågning cellecyklus i levende celler, vi identificeret en tæt forbindelse mellem cellecyklus og mobilisering egenskaber kræftceller.

Resultater

Dynamisk visualisering registrerer cellecyklus-associeret cancer celle mobilisering og invasion

in vivo

Vi udnyttet intravital multifoton mikroskopi og Fucci teknologi [11] for at studere cellen cyklus og migration i et levende system. I denne Fucci system Geminin (GMNN), et nukleart protein beriget i S /G2 /M-faser, og Cdt1, beriget i G1-fasen, blev henholdsvis markeret med driv- og rød-fluorescerende proteiner (figur 1A,

øverste

panel). Fucci-udtrykkende HCT116 human invasive colon cancerceller (figur 1A,

lavere

panel) blev inokuleret i coecum eller subkutane væv af en immunkompromitteret NOD /SCID mus [12] – [14]. Fire uger efter implantation blev tumorer observeret intravitally. Vi fortrinsvis opdaget S /G2 /M-fase Fucci-grønne celler langs de marginale områder af kræft invasion hoveder efter podet ind i coecum væg (figur 1B). Lignende fordelingsmæssige ændringer i Fucci-grøn og -Red celler blev detekteret, når kræftcellerne blev inokuleret i mesenterium eller colon væg (fig S1). Den foretrukne fordeling af cancerceller i S /G2 /M-faser blev også observeret i kirurgisk resektion humane coloncancer prøver (figur S2). Kræftceller på invasion hoveder blev fortrinsvis farvet med antistoffer mod GMNN [15], [16], sammenlignet med dem i ikke-tumor regioner eller tumor centre.

(A) Etablering og analyser af HCT116 tyktarmskræft celler stabilt udtrykker Fucci. (

Øvre

) The Fucci system muliggør overvågning af cellecyklussen i levende celler i realtid. Kernerne i celler i G1 /G0, tidlig S og S /G2 /M-faser er mærket rød, gul og grøn, hhv. (

Lavere

) Snapshots of Fucci-udtrykkende HCT116 celler. Scale søjler repræsenterer 20 um. (B) Intravital multifoton billeddannelse af Fucci-positive HCT116 celler podet i NOD /SCID-mus. (

Venstre

) Et repræsentativt billede af Fucci-udtrykkende HCT116 celler implanteret i coecum (grøn: Fucci-grøn (MAG), S /G2 /M, rød: Fucci-rød (mKO2), G1, blå : kollagenfibre (anden harmoniske generation (SHG) billeddannelse)). Scale søjler repræsenterer 75 um. (

Right

) Kvantificering af antallet af Fucci-grønne og -Red HCT116 celler i forskellige områder af podede tumorer. Centrale og marginale zoner blev fastlagt som områder længere eller tættere end 75 um fra grænsen mellem tumor og normalt væv, hhv. (C) repræsentativt billede på kanten af ​​en Fucci-udtrykkende HCT116 tumormasse. Hele området (

venstre

) og en tidsserie (

højre

) af forstørrede billeder (en pr 400 s) af kræftceller invaderer interstitium (grøn: Fucci-grøn (MAG), S /G2 /M, rød: Fucci-rød (mKO2), G1, blå:. kollagen fibre (SHG imaging) (se også Movie S1) faktiske billeder (

øvre

paneler) og celle baner (

lavere

paneler) er vist. Scale søjler repræsenterer 100 um (

venstre

) og 10 um (

rigtige

). (D) repræsentant billede af ekstravaseret Fucci-udtrykkende HeLa-celler. hele området (

venstre

) og en tidsserie (

højre

) af forstørrede billeder af kræftceller ekstravaseret fra blodkar (en pr 12 min) (grøn: Fucci-grøn (MAG) , S /G2 /M, rød: Fucci-rød (mKO2), G1, blå: kollagen fibre (SHG imaging) (se også Movie S2) faktiske billeder (

øvre

paneler) og celle baner (

sænke

paneler) er vist Scale søjler repræsenterer 100 um (

venstre

) og 10 um (

højre

) (E) Cellular motilitet i Fucci-grøn- og. – rød-positive celler blev målt i 4 timer (se også Movie S3). (

Venstre

) Grønne og røde kugler repræsenterer Fucci-drivhuse og -Red-positive celler, henholdsvis og gule linjer viser de tilknyttede baner. Scale søjler repræsenterer 100 um. (

Right

) Mean sporing hastigheder af Fucci-drivhuse og -Red-positive celler. Data (n = 379 for Fucci grøn og n = 259 for Fucci rød) blev opnået fra individuelle celler i tre uafhængige forsøg. Hastighederne af de to grupper blev sammenlignet ved Mann-Whitney

U

-test (p = 0,0191). Median og interkvartile intervaller for hver gruppe er lagt oven på dot plots.

Dernæst undersøgte vi den dynamiske karakter af kræft celler

in vivo

. Fucci-udtrykkende HCT116 cancerceller var meget mobile ved podning i subkutane væv, og nogle kræftceller var aktivt invaderende, synes at ‘dykke’ i det omgivende interstitium under billedbehandling time-kurser (figur 1C, Movie S1). Især næsten alle dykning cellerne var grønne (figur 1C,

pilespidser

), måske antyder, at cancer cellemotilitet og invasion være afhængig af cellecyklussen. Desuden kunne vi afsløre deres migrationsstrømme under ekstravasation for metastaser (figur 1D, Movie S2). Nogle celler viste sig at migrere ud fra kræft celleaggregater fast i blodkarrene, og disse var også alle grønne. En vis observationsperiode (i op til 2 h), i tumor centrale regioner resulterede i fangst af basale træge adfærd, samt streaming bevægelse med blodgennemstrømning, af forskellige cancer celletyper, hvilket tillod os at afbilde et tilstrækkeligt antal celler til kvantificering (Figur 1D, Movie S3). Detaljerede statistiske analyser af celle sporing hastighed viste klart, at grønne kræftceller (i S /G2 /M fase) har betydeligt højere motilitet end røde G1 celler (betyde sporing hastighed 1,39 ± 0,08 um /min for Fucci-grøn vs. 1,09 ± 0,06 um /min for Fucci-rød; p = 0.00191) (figur 1E). Vi bekræftede, at en vis periode intravital imaging (op til 3 h) ikke påvirkede mobilitet kræftceller (Figur S3). Ved at spore individuelle celler over en periode, udelukkede vi muligheden for, at en sådan mobilitet ændring i S /G2 /M-faser afspejlede bevægelse om cytokinese. Disse resultater viser, at visse molekyler fortrinsvis udtrykkes i S /G2 /M Fucci-grøn faser lette migrationen og invasion af cancerceller.

Identifikation af ARHGAP11A som en cellecyklus-afhængig mobilitet-kontrollerende molekyle

for at belyse den molekylære basis for kontrol af cellecyklus-afhængig motilitet, udførte vi cDNA microarray-baserede komparative analyser blandt Fucci-grønne og -Red celler dyrket

in vivo

(figur 2A). I microarray analyse, 2.032 prober (1.656 gener) viste to fold ændringer i udtryk (figur 2B; Tabel S1). Som forventet er de fleste af disse gener koder for proteiner associeret med celledeling og mitose. Baseret på gen-ontologi kategorier, vi udvundet gener relateret til cellulær bevægelse fra 1.656 kandidater og fandt, at en karakteriseret Rho GTPase-aktiverende protein (RhoGAP),

Arhgap11a

, blev fortrinsvis udtrykt i grøn S /G2 /M fase cancerceller (figur 2B, tabel S1). Alle de tre prober til

Arhgap11a

gen blev højt rangeret (5., 12., og 41.) blandt de 2.023 sonder. Det er blevet påvist, at Rho familie små G-proteiner, såsom Rho, Rac, og Cdc42, og deres regulerende molekyler, såsom RhoGAP, kooperativt styre cellulære motilitet i både normale og cancerceller [17] – [21]. Den præferentielle udtryk for

Arhgap11a

i Fucci-grønne celler blev bekræftet på både mRNA (Figur 2C) og protein niveauer (Figur 2D). Derudover demonstrerede vi en tidsafhængig gradvis stigning i

Arhgap11a

udtryk under progression gennem cellecyklussen fra G1 til S /G2 /M (Figur 2E, figur S4), styrke begrebet at

Arhgap11a

ekspression styres på en cellecyklusprogression-afhængig måde. Cellecyklus-afhængig ekspression af Arhgap11a blev også påvist i andre coloncancer cellelinier foruden HCT116, såsom DLD1, HT29 og KM125M (figur 2F) og HeLa (fig S5) samt i ikke-cancer-cellelinier, såsom HEK293-celler ( Figur S6), hvilket tyder på tilstedeværelsen af ​​en generel ordning for denne karakteristiske udtryk regulering af

Arhgap11a

i mange celletyper. For at belyse den mekanisme der ligger til grund cellecyklussen-afhængige ekspression af Arhgap11a, vi undersøgte yderligere transkriptionel kontrol af dette gen. E2F-familien transkriptionsfaktorer er blevet dokumenteret til at fungere i en cellecyklus-afhængig måde [1]. Vi bemærkede, at en formodet E2F-bindende sekvens (TTTCGCGC) [23] var placeret på -27 til -20 basepar fra transkriptionsinitieringsstedet af Arhgap11a. Chromatin immunoprecipitation (chip) eksperimenter viste den direkte associering E2F1 med denne region (fig 2G), som kan være involveret i cellecyklus-afhængig transskriptionel aktivering af dette locus. En luciferase reporter assay viste E2F1-afhængig transskriptionel aktivering af Arhgap11a promotoren, der blev blokeret af en forbindelse med det Rb-proteinet (fig 2H), hvilket antyder den mulige rolle af E2F /Rb veje i den transkriptionelle regulering af Arhgap11a. Vi indser fuldt inddragelse af andre transkriptionelle faktorer siden Arhgap11a væsentligt blev udtrykt også i G1 fasen (figur 2D), selv om vi kan antage Rb /E2F vej ville være mindst ansvarlig for stigningen i Arhgap11a udtryk i S-fasen.

(A) Fucci signal-baserede microarray analyser. Fucci-positive HCT116-celler blev separeret i Fucci-grøn (MAG) – og Fucci-rød (mKO2) – positive celler ved FACS. mRNA blev ekstraheret fra disse celler og sammenlignes af microarray analyse (to dye-swap eksperimenter, hvilket giver fire uafhængige microarray analyser). (B) I alt 2.023 prober (1.656 gener) viste dobbelte ændringer i udtryk (tabel S1) (P 0,05). Af dem,

Arhgap11a

blev højt rangeret, og alle tre prober til

Arhgap11a

var blandt de top-rangerede prober til RhoGAPs. De tre sonder var specifikke for de angivne potions i

Arhgap11a

mRNA (

venstre

). De tre afmærkede prikker (# 1, # 2, # 3) i scatter plots repræsenterer fold ændringer (

rigtige

). (C) Cell cycle-afhængig ekspression af

Arhgap11a

mRNA blev bekræftet ved qPCR. Udtrykket data blev normaliseret til

GAPDH

(n = 3). (D) Cell cyklus-afhængig udtryk for

Arhgap11a

proteiner. (

Right

) Flowcytometrisk analyser af Fucci-udtrykkende HCT116 celler. Cellecyklus profiler var farvekodet: G1, rød; tidlig S, gul; og S /G2 /M, grøn (

øverste højre

). DNA indhold blev målt ved Hoechst33342 fluorescens af (

nederste højre

), hvilket bekræfter, at Fucci signaler nøjagtigt repræsenterer cellecyklus niveauer (n = 3). (

Venstre

) Celle cyklus-afhængig udtryk for ARHGAP11A og cellecyklus markører, som bestemt ved Western blotting (n = 3). (E) Time-afhængig ekspression af

Arhgap11a

under progression af cellecyklussen fra G1 til S /G2 /M. Fucci-rød (mKO2) -positive HCT116-celler blev sorteret ved anvendelse af et FACSAria cellesorteringsapparat og blev dyrket i de indikerede tidsperioder. Flowcytometri analyser (

øvre

) og forhold mellem Fucci farver (

venstre

) er vist for hvert tidspunkt. (

Right

) Relativ udtryk for

Arhgap11a

blev undersøgt af qPCR (n = 6). Data blev analyseret ved envejs ANOVA (

s

= 0,0001) og Bonferroni multiple sammenligning test (***

s

0,01). (F) Cell cyklus-afhængig

Arhgap11a

udtryk i forskellige menneskelige kolon cancer cellelinjer. Fucci blev indført i forskellige menneskelige kolon cancer cellelinier (HCT116, DLD1, HT29, og KM12SM). I alle de cellelinjer,

Arhgap11a

udtryk var signifikant højere i S /G2 /M (

grøn

) end i G1 celler (

rød

). (G) En chromatin immunoprecipitation (chip) assay med et anti-E2F1-antistof viste, at E2F1 bundet til det formodede E2F-bindingssted i

Arhgap11a

promotoren (n = 3). (H) Luciferase reporter assay af

Arhgap11a

promotorregionen (-500 bp), herunder E2F-bindingssted (GTTTCGCGC) ved -20 bp fra transskription udgangspunkt. Co-transfektion med E2F1 forbedret transkriptionel aktivitet, mens samtidig udtryk for Rb blokeret. Værdier for luciferaseaktivitet blev normaliseret tværs hvert eksperiment og, for at kontrollere for forskelle i transfektionseffektivitet, at p-galactosidase.

ARHGAP11A er et GTPase-accelererende protein for Rho, men ikke for Rac eller Cdc42, og hæmmer Rho-afhængige cellulære fænomener

ARHGAP11A var allerede blevet klonet og opført i en NCBI database, men dens molekylære funktion endnu ikke var blevet karakteriseret. Især var det uklart, om sit formodede GAP domæne faktisk udøver en GTPase-accelererende virkning. At bestemme dens funktion, isolerede vi Halo-mærkede ARHGAP11A (eller Halo-Tag kun som en kontrol) udtrykt i HEK293-celler (figur 3A) og inkuberet it

in vitro

med flere Rho familie proteiner, såsom RhoA , Rac1, og Cdc42 (figur 3B). I dette assay målte vi GAP aktivitet ved detektion uorganisk phosphat frigives på grund af GTP hydrolyse af Rho-proteiner [24]. Dette cellefrie in vitro assay viste, at ARHGAP11A accelereres GTP hydrolyse af RhoA, men ikke fra Rac1 eller Cdc42 (figur 3B). Mængden af ​​aktive former af Rho familie proteiner blev også vurderet ved pull-down assay med GST-Rhotekin (for Rho) eller GST-krybbe (for Rac og Cdc42) i HEK293 celler [25]. Transfektion af ARHGAP11A reducerede mængderne af aktiv RhoA, RhoB, og RhoC, men ikke af Rac1 eller Cdc42 (figur 3C). Vi bekræftede også, at dette RhoGAP aktivitet hovedsageligt blev afskaffet, når dens formodede GAP-domæne blev slettet (figur 3D). Disse resultater klart bekræfte, at ARHGAP11A er en GAP specifik for Rho, men ikke for Rac eller Cdc42, hvis virkning medieres af prognoserne GAP domæne.

(A) Halo-Tagged ARHGAP11A og Halo-Tag proteiner udtrykt og oprenset fra HEK293-celler. (B) Påvisning af GTPase-aktivitet ved kvantificering uorganisk phosphat frigivet af GTP hydrolyse af Rho familie proteiner. ARHGAP11A forbedret GTPase aktivitet af RhoA, men ikke af Rac1 eller Cdc42. (C) Påvisning af aktive og totale former af forskellige Rho-familie proteiner (RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, og cdc42) i HEK293 celler transficeret med Halo-ARHGAP11A eller dens kontrol. Angivelse af ARHGAP11A reducerede mængder af de aktive former af RhoA, RhoB, og RhoC. (D) vurdering af mutant ARHGAP11A uden det formodede GAP-domæne (ΔGAP).

Aktiv RhoA har vist sig at stimulere fokal adhæsion og stress fiber dannelse ved aktivering af Rho-associeret protein kinase (ROCK) og /eller mDia (figur 4A) [26]. Samstemmende, exogen ekspression af konstitutivt aktive RhoA (RhoA-Q63L) [27] i HCT116-celler induceret afvigende stigninger i F-actin stress fiber og fokal adhæsionsdannelse, visualiseret ved hjælp af paxillin aggregater (figur 4B). I modsætning hertil undertrykkelse af Rho-aktivitet ved CT04 (1 ug /ml), en potent inhibitor Rho [28], reduceres dannelsen af ​​stress fibre og fokale adhæsioner (figur 4C). Under disse eksperimentelle betingelser, yderligere udtryk for ARHGAP11A hæmmede dannelsen af ​​både F-actin stress fibre signifikant (figur 4D,

midten

panel, og 4E) og fokale sammenvoksninger (figur 4D,

højre

panel, og 4F). Ekspression af ARHGAP11A også reduceret niveauet af phosphoryleret myosin let kæde (pMLC) (figur S7). Sammenfattende ARHGAP11A, som RhoGAP, undertrykt Rho-afhængige fænomener, såsom fokal adhæsion og stress fiber dannelse, i HCT116 cancerceller. Vi bekræftede også den funktion ARHGAP11A i HeLa-celler (figur 4G-I).

(A) Skematisk illustration af RhoA-medierede cellulære reaktioner. (B) Virkning af overekspression af vildtype (WT) eller konstitutivt aktiv (Q63L) RhoA på dannelsen af ​​F-actin stress fibre (visualiseret under anvendelse Alexa 568-phalloidin) og fokale adhæsioner (farvet med anti-paxillin). GFP blev cotransficeret til at identificere de transficerede celler. Scale søjler repræsenterer 15 um. (C) Effekt af CT04, en potent RhoA inhibitor, på dannelsen af ​​F-actin stress fibre (visualiseret under anvendelse rhodamin-phalloidin) og fokale adhæsioner (farvet med anti-paxillin). Kerner blev farvet med DAPI. Scale søjler repræsenterer 15 um. (D) Effekt af overekspression af Halo-Tagged ARHGAP11A eller dens kontrol på dannelsen af ​​F-actin stress fibre (visualiseret ved hjælp af Alexa 568-phalloidin) og fokale sammenvoksninger (farvet med anti-paxillin) i HCT116 celler. Pilespidser identificere Halo-Tag-udtrykkende celler (mærket med Oregon green-konjugeret Halo-Tag-ligand). Scale søjler repræsenterer 10 um. (E) Kvantificering af middelintensiteter af F-actin i Halo-kontrol (n = 80) og Halo-ARHGAP11A-udtrykkende (n = 80) HCT116 celler. Data blev indsamlet fra tre uafhængige forsøg. (F) Kvantificering af fokale sammenvoksninger i Halo-kontrol (n = 80) og Halo-ARHGAP11A-udtrykkende (n = 80) HCT116 celler. Data blev indsamlet fra tre uafhængige forsøg. (G) Effekt af overekspression af Halo-Tagged ARHGAP11A eller dens kontrol på dannelsen af ​​F-actin stress fibre (visualiseret ved hjælp af Alexa 568-phalloidin) og fokale sammenvoksninger (farvet med anti-paxillin) i HeLa-celler. Pilespidser identificere Halo-Tag-udtrykkende celler (mærket med Oregon green-konjugeret Halo-Tag-ligand). Scale søjler repræsenterer 10 um. (H) Kvantificering af middelintensiteter af F-actin i Halo-kontrol (n = 80) og Halo-ARHGAP11A-udtrykkende (n = 80) HeLa-celler. Data blev indsamlet fra tre uafhængige forsøg. (I) Kvantificering af antallet af fokale adhæsioner i Halo-kontrol (n = 40) og Halo-ARHGAP11A-udtrykkende (n = 46) HeLa-celler. Data blev indsamlet fra tre uafhængige forsøg.

ARHGAP11A stimulerer kræftcelle motilitet ved at øge Rac aktivitet

Cell motilitet er kendt for at være gensidigt reguleret af forskelligartede Rho familien små G-proteiner [29] . Henviser aktiv RhoA (eller Rho eller RhoC) stabiliserer cytoskelet ved at øge stress fiber og fokal adhæsionsdannelse, aktivering af Rac1 (eller Cdc42) gør cellerne fleksibel og mobil, hvilket fører til dannelsen af ​​lamellipodia eller filopodia [29]. Aktiviteterne i de modvirkende proteiner RhoA og Rac1 gensidigt kontrolleret [30], og hæmning af én resultater i den relative forøgelse af den anden (figur 5A). Her ved hjælp Raichu-Rac1, en FRET-baseret biosensor af Rac1 aktivitet på single-celle niveau [31], [32], vi undersøgte Rac1 aktivitet i HCT116 celler. Rac1 aktivitet var signifikant højere i ARHGAP11A-udtrykkende celler sammenlignet med mock-transficerede (transficeret med kun Halo-Tag) eller ikke-transficerede celler (figur 5 B og C), hvilket tyder på den mekanisme, hvormed undertrykkelse af Rho-aktivitet fører til modvirke aktivering af Rac1 på enkeltcelle-niveau. Tilsvarende ARHGAP11A-medieret aktivering af Rac1 blev også observeret i HeLa-celler (fig S8).

(A) Schema repræsenterer balancen mellem RhoA og Rac1 for cellemigrering. (B) Analyser af Rac1 aktivitet på enkelt-celle niveau i HCT116 celler, der udtrykker Halo-ARHGAP11A eller dets Halo kontrol. Repræsentative billeder af Raichu-Rac1-udtrykkende HCT116 celler under Halo-kontrol (

venstre

) eller Halo-ARHGAP11A transfektion (

rigtige

) betingelser. Rac1 aktivitet blev overvåget af den fælles fiskeripolitik /YFP FRET nøgletal stammer fra Raichu-Rac1. Ekspression af Halo-Tag blev identificeret med TMR-konjugeret Halo-Tag ligand. Skalaen søjle repræsenterer 5 um. (C) Kvantificering af FRET nøgletal i Halo-kontrol (n = 30) og Halo-ARHGAP11A-udtrykkende (n = 30) HCT116 celler. (D) Tre-dimensionel kultur HCT116 transficeret med Halo-kontrol eller Halo-mærket ARHGAP11A, suppleret med Y27632 (for Halo-kontrol kun). Skalaen søjle repræsenterer 50 um. (E) Proportioner af runde-typen HCT116 i 3D kultur transficeret med Halo-ARHGAP11A eller Halo-kontrol. Round-type celler blev talt i tre synsfelter for hver af tre uafhængige forsøg. Kolonner repræsenterer middelværdien ± s.e.m. (F)

In vitro

invasion under anvendelse 3D Matrigel plade. Migrerede celler blev visualiseret ved farvning kultur membran med Diff Quik-farvning (Dade Behring). HCT116 transficeret med Halo-ARHGAP11A eller Halo-kontrol, og vildtype HCT116 behandlet med Y27632 blev anvendt i assayet. (G) Kvantificering af invasion indekser fra 3D Matrigel plade analyser. Invasion indekser blev beregnet efter ligningen vist i Metode afsnittet. Kolonner repræsenterer midler ± s.e.m.

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​Rho hæmning af ARHGAP11A om kontrol med kræftcellen morfologi og mobilitet. For at analysere de morfologiske egenskaber af kræftceller, vi en brugt tre-dimensionelle (3D) Matrigel kultur-system (Figur 5 D og E) [33]. I resultater, overekspression af ARHGAP11A førte til spindel-lignende figurer af HCT116 celler, der repræsenterer en invasion-tilbøjelige fænotype. Der kunne også konstateres lignende morfogene ændringer, når Rho-medieret signalering blev inhiberet af Y27632, en potent ROCK inhibitor [34]. Vi yderligere målt

in vitro

vandrende egenskaber af HCT116 celle i 3D Matrigel plader (figur 5 F og G) [35], og samstemmende, overekspression af ARHGAP11A eller Y27632 behandling forbedret migration af HCT116

in vitro

. På den anden side, stærke hæmning af Rho-aktivitet ved høj koncentration af Y72632 blokeret migration (data ikke vist). Disse resultater tyder klart, at passende niveau for RhoA hæmning såsom opnås ved overekspression af ARHGAP11A forbedret vandrende aktivitet HCT116 kræftceller.

Funktionel konsekvenser af ARHGAP11A om anvendelse af HCT116 menneskelige kolon kræftceller

in vivo

og mulighed for ARHGAP11A som terapeutisk mål i invasive kræftformer

for at analysere funktionen af ​​ARHGAP11A, genereret vi HCT116 cellelinjer, hvor ARHGAP11A ekspression blev stabilt reduceret med shRNA (SH). Reduceret ekspression af ARHGAP11A bekræftedes ved både mRNA (figur 6A) og protein (figur 6b) niveauer. En BrdU spredning assay viste ingen forskelle mellem kontrol- og SH celler, hvilket tyder på, at ARHGAP11A ikke påvirker celle-iboende spredning

in vitro

(figur 6C). På den anden side, en

in vitro

celleinvasion assay med en Matrigel plade viste, at invasion evne blev reduceret betydeligt i SH-celler (Figur 6d). Næste undersøgte vi rolle ARHGAP11A i

in vivo

motilitet af podede cancerceller. Ved at bruge intravital multifoton billeddiagnostiske teknikker, viste vi, at SH celler var mindre motile end kontrol celler i subkutant podet tumorer, klart viser, at ARHGAP11A regulerer motilitet HCT116 kræftceller in vivo (figur 6E, Film S4). Vi fandt også, at SH celler var mindre i stand til at migrere ud fra blodkar end var kontrol celler under ekstravasation af blod-hjemmehørende kræftceller (Figur 6F). Endelig undersøgte vi rolle ARHGAP11A i tumor ekspansion

in vivo

(figur 6G). ARHGAP11A-Knockdown SH-celler udviste mindre progression på dag 28 sammenlignet med vildtypeceller (SH # 1, 6,47 ± 0,33 mm; SH # 2, 6,66 ± 0,32 mm; vildtype, 9,76 ± 0,82 mm og SH kontrol, 9,38 ± 0,97 mm).

(A) Etablering af ARHGAP11A-knockdown HCT116 cellelinjer (SH # 1, # 2). Nedsat ARHGAP11A mRNA-ekspression blev bekræftet ved qPCR. (B) ARHGAP11A proteinekspression i kontrol og SH-knockdown HCT116-celler blev vurderet ved Western blotting. (C) BrdU proliferationsassay af disse HCT116 cellelinier. Kolonner repræsenterer middelværdi ± S.E.M. (D)

In vitro

invasion under anvendelse 3D Matrigel dyrkningsplader. Kolonner repræsenterer middelværdi ± S.E.M. (E)

In vivo

funktionelle analyser af ARHGAP11A-knockdown HCT116 celler. Repræsentative billeder af kontrol (

grøn

) og ARHGAP-knockdown (

rød og) HCT116 celler inokuleret subkutant i NOD /SCID-mus (

øvre

). En rå ‘fusioneret’ image og billeder ekstraheret fra den grønne og røde kanaler er vist. Cellemotilitet blev målt i 7 timer. Grønne og røde cirkler repræsenterer kontrol- og ARHGAP11A-Knockdown SH # 1 HCT116 celler henholdsvis og gule linjer viser deres baner (se også Movie S4). Skalaen søjle repræsenterer 50 um. (

Lower

) Mean sporing hastigheder af kontrol- og SH celler. Data (n = 440 for kontrollen og n = 215 for SH # 1) blev opnået fra individuelle celler i to uafhængige forsøg. Hastighederne af de to grupper blev sammenlignet ved Mann-Whitney

U

-test (p = 0,0034). Median og interkvartile intervaller for hver gruppe er overlejret på dot plots. (F) Ekstravasation af kontrol (

grøn

) og SH # 1 (

rød og) HCT116 celler. (

Venstre

) Grønne celler blev fortrinsvis påvist i ekstravaskulære rum, hvilket tyder på en stor sandsynlighed for ekstravasation. (

Right

) Gennemsnitlige antal ekstravaseret celler pr synsfelt. Data blev ekstraheret fra 10 synsfelter. (G) In vivo tumor udvidelse af HCT116 celler. Wild-type kontrol HCT116 celler (

sort og cirkler) og HCT116 celler behandlet med scrambled kontrol shRNA (

sort og firkanter), SH # 1 (

røde

cirkler), og SH # 2 (

rød og firkanter) er vist. Kræftceller (1,0 x 10

6/100 pi PBS) blev primært indpodet i subkutane væv. Tumorstørrelser blev målt hver uge i 4 uger efter inokulering. Data repræsenterer middel ± S.E.M. af fem uafhængige forsøg. Data blev analyseret ved to-vejs ANOVA (

s

= 0,0037). (H) Nedsat udtryk for ARHGAP11A i HCT116 celler behandlet med siRNA’er rettet ARHGAP11A (vurderet af qPCR). (I)

In vivo

siRNA behandling af HCT116 tumorer. Kontrol HCT116 celler (5,0 × 10

6), blev implanteret i NOD /SCID-mus, og en uge senere blev behandlet med PBS (

black fyldt

cirkler), atelokollagen (

black fyldt

trekanter), krypteret kontrol siRNA plus atelokollagen (

sort fyldt

firkanter), eller to siRNAs (# 1 og # 2) mod ARHGAP11A plus atelokollagen (

red åbne

cirkler og firkanter, henholdsvis). Tumorstørrelser blev målt ugentligt. Data repræsenterer middel ± S.E.M. af fem uafhængige forsøg. Data blev analyseret ved to-vejs ANOVA (

s

= 0,0001). (J) Billeder af tumorer udtaget på dag 35 (

venstre

). Skalaen søjle repræsenterer 10 mm. (

Right

) En repræsentative billeder af SCID mus, der bærer HCT116 menneskelige kolon kræftceller, 35 dage efter behandling med et siRNA (siRNA # 1) eller med en kodet RNA duplex (kontrol), sammen med atelokollagen. Skalaen søjle repræsenterer 10 mm.

Næste, vi vurderet potentialet i ARHGAP11A som en ny terapeutisk mål for hæmning af kræft progression. Scale bar, 100 pm. Scale bar, 100 pm. Scale bar, 100 pm.