PLoS ONE: Chemotherapeutic Sensibilisering af Leptomycin B Resistant Lung Cancer Cells ved forbehandling med doxorubicin

Abstrakt

Udviklingen af ​​nye målrettede behandlinger er blevet en vigtig forskning fokus for lungekræft behandling. Vores tidligere undersøgelse har vist leptomycin B (LMB) signifikant hæmmede spredning af lungekræft celler; dog p53 vildtype lungecancerceller var resistente overfor LMB. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at udvikle og evaluere en roman terapeutisk strategi at bevidstgøre LMB-resistente lunge kræftceller ved at kombinere LMB og doxorubicin (DOX). Blandt de forskellige behandlingsregimer, forbehandling med DOX (præ-DOX) og efterfølgende behandling med LMB til A549-celler faldt betydeligt 50% inhiberende koncentration (IC50) sammenlignet med den for LMB alene (4,4 nM

vs.

10.6 nM,

P

0,05). Analyse af cellecyklus og apoptose ved flow bekræftede de cytotoksiske data cytometri yderligere. At undersøge molekylære mekanismer for dette stof kombinationseffekter blev p53 pathways analyseret ved Western blot, og nuklear proteom blev evalueret ved todimensional-forskel gelelektroforese (2D-DIGE) og massespektrometri. I sammenligning med kontrolgrupper, niveauet af p53, phospho-p53 (ser15), og p21 proteiner blev væsentligt forøget, mens phospho-p53 (Thr55) og survivin blev faldt betydeligt efter behandlinger af præ-DOX og LMB (

P

0,05). 2D-DIGE /MS-analyse identificeret, sequestosome 1 (SQSTM1 /P62) havde en signifikant stigning i pre-DOX og LMB-behandlede celler (

P

0,05). Som konklusion tyder vore resultater, at lægemiddelresistente lungecancerceller med p53 vildtype kunne sensibiliseret til celledød ved planlagt kombinationsbehandling af DOX og LMB gennem aktivering og genoprette p53 samt potentielt andre signalvejen (e) involverer sequestosome 1.

Henvisning: Lu C, Shao C, Cobos E, Singh KP, Gao W (2012) Chemotherapeutic Sensibilisering af Leptomycin B Resistant Lung Cancer Cells ved forbehandling med doxorubicin. PLoS ONE 7 (3): e32895. doi: 10,1371 /journal.pone.0032895

Redaktør: Ashraf B. Abdel-Naim, Det Farmaceutiske Fakultet, Ain Shams University, Egypten

Modtaget: December 13, 2011; Accepteret: 7 feb 2012; Udgivet: 7 marts 2012

Copyright: © 2012 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft fortsætter med at være den førende årsag til kræft. død på verdensplan, og i USA [1]. Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) stadig den fremherskende form for lungekræft (ca. 85% af alle lungekræfttilfælde), blandt hvilke lungeadenocarcinom (AC) er den hyppigste histologiske subtype for alle køn og racer kombineres [2]. Prognosen for lungekræft er meget fattige, med en 5-års overlevelse på mindre end 15% i USA. Kemoterapi er fortsat den hyppigste behandling for at forlænge overlevelsen og forbedre livskvaliteten [3], [4], [5], [6].

Kræft kemoterapi har været anvendt med succes i en række forskellige omstændigheder, der involverer maligniteter imidlertid dens effektivitet er ofte blevet begrænset af lægemiddelresistens og bivirkninger [7]. Terapier fokuserer på specifik molekyle (r) /pathway (s) har potentialet til at overvinde disse [7] begrænsninger. Leptomycin B (LMB) og /eller dets derivater, som effektivt kan hæmme nukleare eksport ved specifikt at hæmme kromosom region vedligeholdelse 1 (CRM1), er blevet anerkendt som en ny klasse af kræftmedicin [8], [9], [10], [11], [12]. CRM1, den bedst karakteriserede nuklear eksport receptor, spiller en væsentlig rolle i kanonisk nuklear eksport signal (NES) -afhængig nuklear eksport, herunder større tumor suppressor proteiner (tsps), såsom p53, FOXO, pRB, p21, p27, etc., som samt inhibitor af NF-KB, nemlig i-KB [9], [13]. Nylige undersøgelser har rapporteret, at CRM1 udtrykkes på et væsentligt højere niveau i livmoderhalskræft i forhold til normalt væv [14], og kunne tjene som en prognostisk faktor for ovariecancer [15] og osteosarkom [16]. Vores nyligt offentliggjorte

in vitro

undersøgelser med anvendelse af normal lunge epitelceller [17] og en bitransgenic musemodel [18] har foreslået, at CRM1 spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​lungekræft. Desuden CRM1 var over-udtrykt i en tobak carcinogen-induceret lunge AC musemodel, og human lunge AC (upublicerede data). Disse resultater tyder CRM1 kunne tjene som et molekylært mål for kræftbehandling, herunder lungekræft.

LMB er en yderst specifik og potent inhibitor af CRM1 funktion ved irreversibelt binding med sulfhydrylgruppen af ​​en Cys-rest nær eller inden for fragt bindende domæne af CRM1 (alkylering Cys 528) [19], [20]. Således kunne LMB forhindre cytoplasmatisk lokalisering og modulerer cancerspecifikke veje, såsom inaktivering af vigtige tumorsuppressorer som p53 [10]. Vores nylig undersøgelse viste, at lunge AC-cellelinie A549 (p53 vildtype) var mere resistent over for LMB end andre cellelinier med p53 mutant eller null [12]. Det er velkendt, at p53 spiller en vigtig rolle i at fremme genomisk stabilitet, cellecyklusstop, apoptose, DNA-reparation, og begyndende alderdom. Undersøgelser har antydet, at de funktioner, vildtype p53 på cellevækst anholdelse og DNA-reparation kan øge modstanden mod radio-eller kemo- terapeutiske midler; det er også tilbøjelige til at potensere apoptose som respons til svær DNA-beskadigelse [21], [22], [23]. Derfor, for at sensibilisere lungecancer celle til den kemoterapeutiske effekt af LMB, vi heri foreslå en terapeutisk strategi, der kombinerer LMB med andre lægemidler ved at inducere alvorlige DNA-skader og p53-aktivering som i sidste ende kunne føre til øget p53 i apoptose snarere end i DNA-reparation. Doxorubicin (DOX) er et meget anvendt kemoterapeutisk middel, som inducerer apoptose i forskellige cancerceller ved aktivering af p53. Det har været anvendt i behandlingen af ​​en række forskellige faste tumorer. Men resistens i DOX indeholdende regimer er et stort problem, som forhindrer bedre svarprocenter og kur og kardiotoksiske bivirkninger er blevet rapporteret hos kræftpatienter i behandling med DOX [24], [25], [26]. Individuelle behandlinger af DOX resulterede i en stærk modstand i mange cancercellelinier, herunder A549, skyldes flere mekanismer, herunder lægemiddelbiotilgængelighed [27], [28] eller NF-KB-aktivering [29]. Hvis DOX kombineres med andre kemoterapeutiske lægemidler, kan lavere doser anvendes til ikke kun at reducere bivirkninger, men også øge effektiviteten [30].

I denne undersøgelse har vi forsøgt at vende tilbage lægemiddelresistens til DOX og /eller LMB i A549-celler via forskellige terapeutiske regimer af en co-behandling af DOX og LMB, samt vurdere deres eventuelle molekylære mekanismer. Vi fandt, at forbehandling af DOX med efterfølgende behandling af LMB sensibiliseret de lægemiddelresistente A549-celler til den kemoterapeutiske effekt af LMB. Disse ændringer kunne følge af indledende aktivering af p53 ved DOX behandling og dermed CRM1 funktion blokering af LMB behandling at akkumulere aktiveret p53 i den nukleare rum. Desuden kan signalveje, der omfatter andre end p53 molekyler også spille en vigtig rolle i at fremme terapeutiske virkninger af den kombinerede behandling af DOX og LMB.

Materialer og metoder

Reagenser

Doxorubicin (DOX) og dimethylsulfoxid (DMSO) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO. LMB (1 mM) blev købt fra LC Labs, Woburn, MA. Lagrene af DOX (10 mg /ml) og LMB blev fortyndet til den krævede koncentration umiddelbart før brug med vækstmedie. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev indkøbt fra USB Corporation. RPMI-1640 medium, penicillin /streptomycin og føtalt bovint serum (FBS) blev indkøbt fra Thermo Scientific, Logan, UT. Primære antistoffer, herunder p53, phospho-p53 (Ser15), phospho-p53 (Thr55), p21, sequestosome 1 (SQSTM1 /P62), og survivin, blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. Primære kanin polyklonalt anti-α-tubulin blev indkøbt fra Abcam, Cambridge, MA. Peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret æsel-anti-kanin-IgG og et forøget kemiluminescens (ECL) kit blev indkøbt fra GE Healthcare, Piscataway, NJ. Radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) lysepuffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology.

Celler og cellekultur

human lunge-adenocarcinom epitelcellelinier A549 og NCI-H358 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC ). Cellerne blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 50 U /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 95% luft og 5% CO

2 efter volumen. Celler blev subdyrket eller belagt henblik på efterfølgende behandling, indtil de nærmede ca. 80% konfluens.

Cell Levedygtighed Assay

Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af MTT-assayet som beskrevet tidligere [17]. Kort beskrevet blev celler udpladet ved 5 x 10

3 celler per brønd i 96-brønds plader. Baseret på cytotoksicitet DOX eller LMB observeret i dette studie og tidligere rapporter [9], [12], [26], [31], [32], [33], 0,5 nM LMB eller 0,5 uM DOX blev udvalgt til co -Behandling eller forbehandling. Cellerne blev behandlet med følgende: 1) DOX alene (0-5 uM) i 24 og 48 timer; 2) LMB alene (0-10 nM) i 24 og 48 timer; 3) co-behandling af 0,5 nM LMB og DOX (0-5 uM) samtidigt (DOX + LMB (0,5 nM)) i 24 og 48 timer; 4) co-behandling af 0,5 uM DOX og LMB (0-10 nM) samtidigt (LMB + DOX (0,5 uM)) i 24 og 48 timer; 5) forbehandling af 0,5 nM LMB i 24 timer (præ-LMB) og efterfølgende DOX (0-5 uM) i 48 timer (præ-LMB + DOX); og 6) forbehandling af 0,5 uM DOX i 24 timer (præ-DOX) og efterfølgende LMB (0-5 nM) i 48 timer (præ-DOX + LMB). Ethanol (EtOH, 0,1%) blev anvendt som kontrol køretøj til LMB. Tre timer før afslutningen af ​​hvert tidspunkt blev 15 pi MTT (10 mg /ml) tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C. På hvert tidspunkt, hvor lilla bundfald var tydeligt synlige under mikroskop, blev 100 pi 100% DMSO tilsat til alle brønde og cellelevedygtigheden blev bestemt ved måling af absorbans ved 570 nm (referencebølgelængde = 630 nm) under anvendelse af en SpectraMax Plus spektrofo- fotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Seks gentagelser ved hver koncentration og tidspunkt blev analyseret. Eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt. Vehikelbehandlede kontroller og emner blev inkuberet i den samme plade under de samme betingelser. Fractional absorbans blev beregnet ved hjælp af følgende formel:.% Cellelevedygtighed = betyder absorbans i test brønde /betyde absorbans i kontrolbrønde × 100

Analyse af Cell Cycle og apoptose ved flowcytometri

Celler fik først forbehandling af 0,5 uM DOX i 24 timer og derefter blev behandlet med LMB for yderligere 48 timer. Derfor blev cellerne høstet efter i alt 72 timer af behandlingen. Baseret på celleviabilitetstest, i alt 6 grupper af A549-celler med forskellige behandlinger blev analyseret, herunder kontrol, 0,5 uM DOX (præ-DOX), 1 nM LMB (LMB1), præ-DOX og 1 nM LMB (præ- DOX + LMB1), 5 nM LMB (LMB5), og præ-DOX og 5 nM LMB (pre-DOX + LMB5). For cellecyklusanalyse, i alt 2 × 10

5 celler fra hver behandlingsgruppe blev opsamlet og fikseret i 70% ethanol i mere end 24 timer ved 4 ° C. Celler blev farvet med Guava Cell Cycle Reagent (Millipore) og kørt på en Guava EasyCyte ™ flowcytometer (Millipore). I alt 5 × 10

3 hændelser blev talt, og procentdelen af ​​celler i den præ-G1, G0 /G1, S og G2 /M-faser af cellecyklus blev bestemt under anvendelse GuavaSoft software (Millipore). For apoptose analyse blev ViaCount assay udført for at bestemme levedygtige og døde celler. Kort fortalt cellesuspensionen (5 x 10

5 celler /ml) blev blandet med Guava ViaCount reagens (Millipore), og blandingen blev inkuberet ved stuetemperatur i 5 minut at plette celler. De farvede celleprøver blev kørt på en Guava EasyCyte ™ flowcytometer (Millipore). I alt 5 × 10

3 hændelser blev talt og data blev erhvervet ved hjælp af Guava ViaCount software (Millipore). Hver prøve blev kørt tredobbelt, og hvert eksperiment blev gentaget tre gange.

Western Blot

De samme 6 behandlingsgrupper på A549 celler som beskrevet i flowcytometri blev analyseret for Western blot. Celler i hver gruppe blev lyseret i RIPA lysebuffer på is. Lysaterne blev sonikeret og derefter centrifugeret ved 13.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C for at opsamle supernatanten. Proteinkoncentrationer blev målt under anvendelse af Bio-Rad Bradford protein assay. I alt 30 ug protein per prøve blev separeret ved 12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter overført til polyvinyliden (PVDF) membraner. De immobiliserede proteiner blev derefter inkuberet natten over ved 4 ° C i blokeringspuffer indeholdende 3% fedtfri tørmælk i 1 × phosphatbufret saltvand (PBS) og 0,1% Tween 20 (1 × PBST). Efter blokering blev membranerne probet med det primære antistof i 1 time. Antistofbinding blev påvist med æsel anti-kanin IgG-HRP i en fortynding på 1:1,000 i 1 time ved stuetemperatur. Efter en kort inkubation med ECL blev signalerne på membranerne eksponeret for røntgenfilm (Fujifilm Corporation, Tokyo). Relativ densitometrisk digital analyse af proteinbånd blev bestemt ved anvendelse Mængde One software (Bio-Rad) og normaliseret ved intensiteten af ​​housekeeping-genet (α-tubulin, 1:10,000 fortynding) for hver prøve.

Virkninger af DOX og LMB om nuklear Protein Profile

for at vurdere virkningerne af DOX og LMB på proteiner foruden dem i p53 vej, en gel-baseret proteomisk tilgang, todimensionalt-forskel gelelektroforese (2D-DIGE), var først udført for at undersøge nukleare proteinprofiler efter LMB behandling. Proteinpletter viser større ændringer blev identificeret ved væskekromatografi-massespektrometri (LC /MS /MS) og bekræftet ved Western blot. Ændringer i protein (er), blev yderligere bedømt i celler med kombineret behandling af DOX og LMB ved Western blot.

kerneprotein Extraction.

I proteomanalyse, nukleare proteiner blev ekstraheret efter protokoller som beskrevet af Lu

et al

[34]. Kort fortalt, baseret på vores tidligere undersøgelse [12], A549 eller NCI-H358-celler, behandlet med vehikelkontrol (0,1% EtOH) eller 20 nM LMB i 24 timer (i to eksemplarer), blev skyllet med iskold PBS, høstet, og suspenderet i iskold puffer A indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH: 7,4, Bio-Rad), 8 M urinstof (Bio-Rad), 4% (w /v) 3 – [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS, Bio-Rad), 0,5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, Bio-Rad), 2,5 mM MgCl

2 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), 0,5 mM PMSF (Santa Cruz Biotechnology), 1 × proteaseinhibitorcocktail (Roche, Basel, Schweiz) og 1% (v /v) NP-40 (USB Corporation, Cleveland, OH). Blandingen blev homogeniseret med en 21-gauge kanyle, efterfulgt af centrifugering af homogenatet ved 700 x g i 10 minutter ved 4 ° C til udfældning af cellekerner. De cytoplasmatiske ekstrakter i supernatanter blev opsamlet og pellets blev resuspenderet i 1 ml iskold puffer B (20 mM Tris-HCI, pH 8,5 og 1 × proteaseinhibitorcocktail), sonikeret på is og blandet med 0,737 g urinstof, 0,267 g thiourinstof, og 0,07 g (vægt /volumen) CHAPS. Efter inkubation på is i 1 time, blev supernatanter indeholdende nukleare ekstrakter opsamlet ved centrifugering ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Proteinkoncentrationer blev målt ved Bradford-assay (Bio-Rad). Kvaliteten af ​​nuklear ekstraktion blev bestemt, og det identificerede protein blev bekræftet ved Western blots. α-tubulin (stede i cytoplasmaet) og histon 3 (til stede i nucleus) blev anvendt til at validere og bekræfte renheden af ​​proteinfraktioner. Salg

2D-Dige. Salg

kerneprotein ekstraktioner for 2D- DIGE blev kørt som beskrevet tidligere [35]. I korte, nukleare protein ekstraktioner fra A549 eller NCI-H358 celler med eller uden LMB behandling (i to eksemplarer) blev omvendt mærket med Cy3 og Cy5 henholdsvis (GE Healthcare). Rør indeholdende 50 ug af hver prøve blev kombineret med 1 pi fortyndet Cy3 eller Cy5 (400 pmol /pl i N, N-dimethylformamid, Sigma). Efter centrifugering blev blandingen efterladt på is i 30 minutter uden lyseksponering. Derefter blev reaktionen standset ved tilsætning af 1 pi 10 mM lysin (Sigma) og placering af prøverne på is i 10 minutter i mørke. Prøver (indeholdende 100 ug proteiner) mærket med Cy3 og Cy5, blev fortyndet til 300 pi ved tilsætning 2D rehydrering buffer (BioRad) bestående af 8 M urinstof, 0,5% CHAPS, 10 mM dithiothreitol (DTT, Bio-Rad), 0,2% biolytes amfolyt, og spore bromphenolblåt. Prøver blev derefter sat på 17-cm immobiliseret lineær pH ​​3-10 gradient (IPG) strimler (BioRad) for overnight rehydrering. Isoelektrisk fokusering blev udført ved 250 V i 20 minutter, gradvist øges til 10.000 inden for 2,5 timer og holdt ved 10.000 V for i alt 50.000 Spænding timer (VH). IPG strimler blev efterfølgende bragt i ligevægt med puffer I (6 M urinstof, 2% SDS, 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20% glycerol, 130 mM DTT og spore bromphenolblåt) og bufferbetingelser II (6 M urinstof, 2% SDS, 375 mM Tris-HCI, 20% glycerol, 135 mM iodacetamid, og spore bromphenolblåt). Proteiner blev derefter separeret med 12% SDS-PAGE geler og visualiseret ved anvendelse af en Typhoon Trio Imager (GE Healthcare) ved excitationsbølgelængder på 532 og 633 nm for Cy3 og Cy5 hhv. Billeder blev manipuleret og analyseret af DeCyder og ImageQuant software (GE Healthcare); protein intensitet forskelle blev beregnet for hver plet på hver gel.

I-gel Digestion.

De 2D geler blev farvet med SYPRO-RUBY (Bio-Rad). Pletter af interesse blev isoleret ved anvendelse af en plet picker, og anbragt i et 0,5 ml Eppendorf-rør til trypsin fordøjelse på en PROGEST (Genomiske opløsninger) arbejdsstation [35]. Kort fortalt blev gel propper vasket med DIH

2O, og behandles med acetonitril (ACN) i 15 min. Gelstykkerne blev hydreret med 10 mM DTT og 0,1 M ammoniumbicarbonat (NH

4HCO

3) i 30 min ved 60 ° C i vandbad. Efter krympning igen med ACN, en opløsning indeholdende 55 mM iodacetamid (Bio-Rad) og 0,1 M NH

4HCO

3 blev tilsat i 20 minutter uden lyseksponering, derefter erstattet med 0,1 M NH

4HCO

3 i 15 minutter. Gelen stikpropper blev efterfølgende vasket i 0,1 M NH

4HCO

3 i 5 min, medens tilsætning af et lige volumen af ​​ACN i 5 minutter. Efter gentagelse af vasketrinet to gange, gelstykkerne blev dehydreret ved ACN og derefter tørret i 30 min. Individuelle gelstykker blev rehydreret i fordøjelsen buffer indeholdende 12,5 ng /pl trypsin (Promega), 40 mM NH

4HCO

3, og 10% ACN ved 37 ° C i 4 timer. Myresyre blev tilsat for at standse reaktionen, og supernatanten blev analyseret direkte.

LC /MS /MS Identifikation.

trypsineret peptider blev analyseret ved nano LC /MS /MS på en ThermoFisher LTQ Orbitrap XL. Kort fortalt blev 30 pi hydrolysat påsat en 5 mm x 75 um ID C12 (Jupiter Proteo, Phenomenex) udluftet kolonnen med en strømningshastighed på 10 pl /min. Gradienteluering blev udført på et 15 x 75 um ID C12 søjle ved 300 nL /min. En 30 minutters gradient blev anvendt. Massespektrometeret blev drevet i en data-afhængig tilstand, og de seks mest rigelige ioner blev udvalgt til MS /MS. Massespektrometri resultater blev søgt hjælp Mascot (www.matrixscience.com). Prøverne blev behandlet i Stillads algoritme, der anvender DAT filer genereret af Mascot. Parametre for LTQ Orbitrap XL-data kræver et minimum af 2 peptid matcher pr protein med minimum sandsynligheder for 90% på proteinniveau.

Statistiske Analyser

Fakultet ANOVA blev udført for at teste effekten af ​​DOX og /eller LMB koncentrationer og inkubationstider på celle levedygtighed. Probit analyse blev anvendt til at beregne de 50% inhibitoriske koncentrationer (IC50). For dataene opnået fra flowcytometri blev de gennemsnitlige celle procenter beregnes og statistisk signifikans blev bestemt via envejs ANOVA og post hoc test. For protein ekspressionsniveauerne blandt kontrol, præ-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5, en-vejs ANOVA og Tukey post hoc tests blev anvendt til at sammenligne densitometrisk intensitet af individuelle prøver mellem grupper. For 2D-DIGE blev billedanalyse udført med DeCyder software (GE Healthcare) og Image Master software. For DeCyder software blev Differential In-gelanalyse (DIA) modul anvendes til at behandle et par billeder fra en enkelt gel, og udfør spot detektion og kvantificering. Den biologisk variation Analysis (BVA) blev anvendt til at beregne forholdet mellem prøver og kontroller ved at udføre en gel-til-gel matchning af parret af spot kort fra hver gel. Pletterne med mere end en to-gange ændring i omvendte-mærket duplikerede eksperimenter sammenlignet med kontroller blev betragtet som målproteiner. Alle analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) og forskelle med

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

cytotoksicitet af DOX eller LMB

MTT assay blev udført for at bestemme cellernes levedygtighed på hvert tidspunkt. Som vist i figur 1A og 1B, både DOX og LMB signifikant inhiberede celleproliferation af A549 på en dosis- og tidsafhængig måde (

P

0,001). De IC50-værdier af DOX og LMB ved 48 timer var 2,2 uM og 10,6 nM (tabel 1). Tilsvarende både DOX og LMB signifikant hæmmede celle spredning af NCI-H358 i en dosis- og tidsafhængig måde (

P

0,001, figur S1A og S1B)

A, cytotoksisk. virkninger af DOX alene og DOX + LMB på cellelevedygtighed af A549-celler som bestemt ved MTT-assayet. Data er udtrykt som procentdelen ved sammenligning til kontrol køretøj til DOX og LMB (0,5 nM) til DOX + LMB. Værdier er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse, n = 6. B, cytotoksiske virkninger af LMB alene og LMB + DOX på celleviabilitet af A549-celler som bestemt ved MTT-assayet. Data er udtrykt som procentdelen ved sammenligning til køretøjets kontrol for LMB og DOX (0,5 uM) for LMB + DOX. Værdier er middel ± SD, n = 6. C, cytotoksiske virkninger af DOX alene og pre-LMB + DOX på celle levedygtighed A549 celler ved 48 h som fastsat af MTT-analysen. Data er udtrykt som procentdelen ved sammenligning til køretøjets kontrol for DOX og pre-LMB for pre-LMB + DOX. Værdier er middel ± SD, n = 6. D, cytotoksiske virkninger af LMB alene og pre-DOX + LMB på celle levedygtighed A549 celler ved 48 h som fastsat af MTT-analysen. Data er udtrykt som procentdelen ved sammenligning til køretøjets kontrol for LMB og pre-DOX for pre-DOX + LMB. Værdier er middel ± SD, n = 6. Forsøg udført i tre eksemplarer gav lignende resultater.

cytotoksicitet Co-behandling af DOX og LMB

Svarende til DOX eller LMB grupper, DOX + LMB (0,5 nM) eller LMB + DOX (0,5 uM) inhiberede A549 proliferation på en dosis- og tidsafhængig måde (

P

0,001, figur 1A og 1B). Men de samtidige behandlinger af DOX + LMB (0,5 nM) eller LMB + DOX (0,5 uM) ikke ændre de cytotoksiske virkninger på A549-celler sammenlignet med DOX alene eller LMB alene ved både 24 og 48 timer (

P

0,05, figur 1A og 1B). De IC50-værdier af DOX + LMB (0,5 nM) og LMB + DOX (0,5 uM) ved 48 timer var 2,1 uM og 10,4 nM (tabel 1). Ligeledes har de samtidige behandlinger af DOX + LMB (0,5 nM) eller LMB + DOX (0,5 uM) ikke ændre de cytotoksiske virkninger på NCI-H358-celler i sammenligning med DOX alene eller LMB alene ved både 24 og 48 timer (

P

. 0,05, figur S1A og S1B)

Cytotoksicitet af præ-LMB + DOX eller præ-DOX + LMB

Som vist i figur 1C, forbehandling af 0,5 nM LMB ikke øge de cytotoksiske virkninger af DOX for A549-celler efter 48 timer sammenlignet med DOX alene (

P

0,05). De IC50-værdier på 48 timer af præ-LMB + DOX og DOX alene var 2,8 og 2,2 uM (tabel 1). Imidlertid forbehandlingen af ​​0,5 uM DOX signifikant forøgede cytotoksiske virkning af LMB på A549-celler efter 48 timer (

P

0,05, figur 1D). IC50 ved 48 timer af præ-DOX + LMB var 4,4 nM, hvilket var signifikant lavere end den for LMB alene (10,6 nM,

P

= 0,037, tabel 1). Desuden har enten pre-LMB eller pre-DOX ikke forbedre de cytotoksiske virkninger af DOX eller LMB på NCI-H358-celler (

P Salg 0,05, figur S1c og S1D).

Effekter af DOX og LMB på cellecyklus og apoptose

Cell spredning hæmning kunne være resultatet af enten cellecyklusstop eller apoptose, hvilket disse to aspekter blev yderligere undersøgt ved flowcytometri analyse af A549 celler efter LMB og DOX behandling. Cellecyklus-analyse viste, at procentdelen af ​​celler i G2 /M var 15,1 ± 0,4, 26,9 ± 2,8, 22,7 ± 1,0, 22,9 ± 4,2, 22,5 ± 2,8, og 18,6 ± 1,3 i kontrolgruppen, præ-DOX, LMB1, præ -DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5 henholdsvis (tabel 2). Pre-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5 alle resulterede i en akkumulering i G2 /M-fasen versus kontrol (

P

0,05, figur 2 og tabel 2 ). Desuden cellecyklus-analyse afslørede, at procentdelen af ​​celler i pre-G1 var 5,4 ± 2,2, 9,0 ± 2,1, 8,2 ± 2,0, 18,6 ± 7,1, 10,2 ± 4,7, og 27,5 ± 2,8 i kontrolgruppen, præ-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5 henholdsvis (tabel 2). Pre-DOX + LMB1 og præ-DOX + LMB5 resulterede i en endelig ophobning i før-G1 fasen versus ikke kun kontrol, men også LMB alene (

P

0,01, figur 2 og tabel 2). Analyse af apoptose afslørede, at LMB behandling signifikant induceret celle apoptose (

P

0,01, tabel 2). Apoptose blev yderligere forøget efter cellerne blev co-behandlet med præ-DOX og LMB sammenlignet med LMB alene (

P

0,01, tabel 2). Procentdelen af ​​apoptotiske celler var 13,2 ± 1,6, 15,8 ± 2,6, 19,2 ± 2,4, 27,1 ± 0,6, 22,4 ± 4,0, og 29,6 ± 2,1 i kontrolgruppen, præ-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ -DOX + LMB5 (tabel 2).

Repræsentative histogrammer af cellecyklus analyser i DOX og LMB-behandlede A549-celler. Kontrol, pre-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5 blev høstet og mærket med Guava Cell Cycle Reagent (Millipore) og analyseret ved flowcytometri (præ-G1, G0 /G1, S, og G2 /M). Y-aksen viser antallet af talte celler og x-aksen viser en stigende mængde Guava Cell Cycle Reagens inkorporering /celle (venstre til højre). Eksperimenter udført i triplikat viste lignende resultater. LMB1: 1 nM LMB, LMB5:. 5 nM LMB

Western blot Analyser af p53, Phospho-p53 (Ser15), Phospho-p53 (Thr55), p21, og Survivin Protein Expression efter DOX og LMB Behandling

Expression niveauer af p53, phospho-p53 (Ser15), og p21 (en nedstrøms mål af p53) blev signifikant forøget i celler behandlet med præ-DOX + LMB end kontroller og viste en signifikant dosis-respons-virkning (figur 3A). De relative protein ekspressionsniveauer af p53 (arbitrære enheder) var 0,02 ± 0,00, 0,03 ± 0,00, 0,07 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,45 ± 0,01, og 0,44 ± 0,00 i kontrolgruppen, præ-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5 henholdsvis (figur 3B,

P

. 0,05, LMB1

vs

kontrol

P

0,01, præ -DOX + LMB1, LMB5, eller pre-DOX + LMB5

vs.

kontrol). De relative protein ekspressionsniveauer af phospho-p53 (Ser15) (arbitrære enheder) var 0,06 ± 0,00, 0,06 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,15 ± 0,01, 0,21 ± 0,01, og 0,77 ± 0,04 i kontrolgruppen, præ-DOX, LMB1 , præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5 henholdsvis (figur 3B,

P

0,05, LMB5

vs

kontrol.

P

0,01, præ-DOX + LMB5

vs

kontrol).. Desuden opregulering af phospho-p53 (Ser15) i pre-DOX + LMB5 var signifikant sammenlignet med LMB5 gruppe (

P

0,01). Relative protein Ekspressionsniveauer af p21 (arbitrære enheder) var 0,29 ± 0,08, 0,69 ± 0,01, 0,85 ± 0,09, 1,07 ± 0,03, 1,14 ± 0,08, og 1,57 ± 0,02 i kontrolgruppen, præ-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1 , LMB5 og præ-DOX + LMB5 henholdsvis (figur 3B,

P

0,01, pre-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5

vs.

kontrol). Desuden opregulering af p21 i præ-DOX + LMB5 var signifikant (

P

0,05). Sammenlignet med den LMB5 gruppen

A, Virkninger af præ-DOX + LMB behandling på proteinet ekspression af p53, phospho-p53 (Ser15), phospho-p53 (Thr55), p21, og survivin i A549. Celler blev behandlet med 0,5 uM DOX 24 timer før behandling med LMB (1 nM eller 5 nM). Efter 48 timer LMB behandling blev cellerne høstet til Western blot-analyse for at bestemme proteinniveauer. Blots blev også probet for α-tubulin at bekræfte lig protein loading. B, De relative protein intensiteter af p53, phospho-p53 (Ser15), phospho-p53 (Thr55), p21, og survivin sammenlignet med intensiteten af ​​α-tubulin. Intensiteten af ​​hvert bånd blev kvantificeret ved hjælp Mængde One-software. Data er middelværdier ± SD, n = 3. Eksperimenterne blev udført tredobbelt. LMB1: 1 nM LMB; LMB5: 5 nM LMB; *,

P

0,05 sammenlignet med kontrol; **,

P

0,01 sammenlignet med kontrol; #,

P

0,05, sammenlignet med LMB5; ##,

P

. 0,01, sammenlignet med LMB5

I modsætning til p53, phospho-p53 (Ser15), og p21 ekspressionsniveauerne, phospho-p53 (Thr55) og survivin (anden nedstrømsmål af p53) ekspressionsniveauer var signifikant og dosisafhængig faldt i celler behandlet med præ-DOX + LMB sammenlignet med de for kontrollen (figur 3A). De relative protein ekspressionsniveauer af phospho-p53 (Thr55) (arbitrære enheder) var 0,67 ± 0,06, 0,56 ± 0,01, 0,65 ± 0,01, 0,57 ± 0,00, 0,56 ± 0,01, og 0,42 ± 0,00 i kontrolgruppen, præ-DOX, LMB1 , præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5 henholdsvis (figur 3B,

P

. 0,01, præ-DOX + LMB5

vs

kontrol). De relative protein ekspressionsniveauer af survivin (arbitrære enheder) var 0,28 ± 0,02, 0,23 ± 0,03, 0,23 ± 0,05, 0,14 ± 0,01, 0,12 ± 0,05, og 0,08 ± 0,00 i kontrolgruppen, præ-DOX, LMB1, præ-DOX + LMB1, LMB5, og præ-DOX + LMB5 behandlede grupper, henholdsvis (figur 3B,

P

. 0,05, præ-DOX + LMB5

vs

kontrol).

Virkninger af DOX og LMB om nuklear Protein Profile

nuklear Protein Extraction.

Renhed af de nukleare og cytoplasmatiske proteiner blev testet ved hjælp af Western blot analyse med anti-histon 3 og anti-α-tubulin . Flertal af α-tubulin blev kun fundet i den cytoplasmatiske fraktion fra A549 og NCI-H358-celler; histon 3 blev kun fundet i den nukleare fraktion fra A549 og NCI-H358 celler, hvilket tyder på, at præparatet blev beriget for nukleare proteiner (figur 4A og S2A).

A, Western blot af nukleare og cytoplasmatiske protein ekstraktioner fra A549; α-tubulin tjente som en intern kontrol til cytoplasmatiske proteiner, og histon 3 fungerede som kontrol for nukleare proteiner. B, 2D-DIGE analyser af nukleare proteiner i A549 celler og 3D-visninger af SQSTM1 i A549 celle med køretøj kontrol eller LMB behandling. Kerneproteiner behandlet med LMB eller vehikelkontrol blev mærket med Cy3 (grøn kanal) og Cy5 (rød kanal), hhv. Kerneproteiner blev separeret baseret på isoelektrisk punkt (PI, vandret akse) og molekylvægt (MW, lodret akse).