PLoS ONE: Autophagy Pathway kræves til IL-6 induceret Neuroendokrine Differentiering og kemoresistens af prostatakræft LNCaP celler

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) celler undergår neuroendokrine differentiering (NED) er klinisk relevant for udviklingen af ​​recidiverende kastrationsresistent PCa. Stigende beviser viser, at autofagi involverer i udviklingen af ​​neuroendokrine (NE) tumorer, herunder PSA. For at tydeliggøre effekten af ​​autophagy på NED, blev androgen-følsomme PCa LNCaP celler undersøgt. Behandling af LNCaP-celler med IL-6 resulterede i en induktion af autofagi. I fravær af androgen, IL-6 forårsagede en endnu stærkere aktivering af autofagi. Lignende resultat blev identificeret i NED induktion. Inhibering af autophagy med chloroquin (CQ) markant nedsat NED. Denne observation blev bekræftet af beclin1 og Atg5 dæmpende eksperimenter. Yderligere støtte rolle autophagy i NED, fandt vi, at LC3 var opreguleret i PCa væv, der havde fået tilbagefald efter androgen-deprivation terapi sammenlignet med deres primære tumor modstykke. LC3 farvning i recidiverende PCa væv viste punktformet mønster svarende til farvningen af ​​chromogranin A (CgA), en markør for NED-celler. Endvidere autophagy hæmning inducerede apoptose af IL-6-induceret NE differentierede PCA-celler. Konsekvent, hæmning af autophagy ved knockdown af beclin1 eller Atg5 sensibiliserede NE differentierede LNCaP celler til etoposid, en kemoterapi stof. For at identificere de mekanismer, blev phosphorylering af IL-6 downstream mål analyseret. En stigning i phospho-AMPK og et fald i phospho-mTOR blev fundet, hvilket indebærer, at IL-6 regulerer autofagi gennem AMPK /mTOR pathway. Vigtigst for denne undersøgelse er opdagelsen af ​​REST, en neuronal genspecifik transskriptionsrepressor der er involveret i autophagy aktivering. REST blev nedreguleret i IL-6 behandling. Knockdown eksperimenter antyder, at resten er kritisk for NED og autophagy aktivering ved IL-6. Sammen vore undersøgelser indebærer, at autofagi er involveret i PCa progression og spiller en cytobeskyttende rolle, når NED induceres i PCA-celler med IL-6 behandling. Disse resultater viser potentialet for målretning autofagi som del af en kombineret terapeutisk regime for NE tumorer

Henvisning:. Chang P-C, Wang T-Y, Chang Y-T, Chu C-Y, Lee C-L, Hsu H-W, et al. (2014) Autophagy Pathway kræves til IL-6 induceret Neuroendokrine Differentiering og kemoresistens af prostatakræft LNCaP Cells. PLoS ONE 9 (2): e88556. doi: 10,1371 /journal.pone.0088556

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: November 18, 2013; Accepteret: 7 jan 2014; Udgivet: Februar 14, 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af NSC tilskud (NSC 101-2320-B-010-047-My3) og MMH tilskud (MMH10194). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er en førende årsag til kræft dødelighed i de vestlige lande, og dens forekomst er hastigt stigende i Asien [1]. Androgen-deprivationsbehandling (ADT) anvendes til primær og metastatisk androgen-afhængige PCa [2]. Men 80% til 90% af PCA patienter udvikler kastrationsresistent tumorer inden 3 år efter korrekt ADT. Terapeutisk behandling af PCa hæmmes af en sådan udvikling af et hormon ildfast tilstand, hvorved hormonbehandling mislykkes, hvilket resulterer i sygdom indgår en mere aggressiv og i sidste ende dødelig fase [3]. En fascinerende, men dublerede træk ved hormon refraktær PCa er dens forening med neuroendokrine differentiering (NED) [4]. NED er en proces, der er observeret under ADT [5], [6]. Normalt er cellerne i en tumor undergår NED viser funktioner, der ligner NE celler og disse celler kaldet neuroendokrine-lignende (NE-lignende) celler. NE-lignende celler er ikke-proliferative, terminalt differentierede, og androgenreceptor (AR) -negativ. De er meget svære at dræbe, fordi de er resistente over for hormonbehandling grundet mangler AR; de er desuden resistente over for konventionel kemoterapi, fordi de ikke deler [7]. Desuden frigiver de en lang række neurokines, kemokiner, cytokiner og vækstfaktorer; dette resulterer i en stigning i proliferation af eventuelle tilgrænsende ikke-NE PCA celler; dette sker i en parakrin måde under ADT. NE-lignende celler vil sandsynligvis være de grundlæggende årsager til hormon- og kemoterapi modstand kastrationsresistent PCa og tilstedeværelsen af ​​NE-lignende celler er korreleret med en dårlig prognose [7] – [9]. Evnen til at identificere de nye mekanismer bag den NED i PCA celler og af den terapeutiske modstand NE-lignende celler vil give nye strategier, der kan anvendes på forebyggelse af recidiverende kastrationsresistent PCa eller alternativt til udvikling af kombineret terapeutisk ordninger for recidiverende kastrationsresistent PCa.

NE-lignende celler kan identificeres på grundlag af morfologiske ændringer og udtryk for neuronale markører. Flere veje er blevet vist at inducere NED i PCA-celler under anvendelse af

in vitro Salg dyrkningssystemer; disse indbefatter androgen deprivation [10] og interlerukin-6 (IL-6) behandling [11]. Sidstnævnte er særligt vigtigt, da IL-6-niveauer øges signifikant hos patienter ADT og kliniske undersøgelser har vist, at serumniveauerne af IL-6 er ofte højere hos patienter med kastrationsresistent og metastatisk PCa [12] – [14]. IL-6 er et pleiotropisk cytokin vigtige for forskellige immunresponser, celleoverlevelse, proliferation og tumorigenese [15], [16]. Kanoniske IL-6 signaleringsveje omfatter (i) JAK-STAT3, (ii) PIK3-Akt og (iii) MEK-ERK. Undersøgelser har vist, at IL-6 medierer vækst anholdelse og inducerer NED i PCA celler via aktivering af karakteristiske signalveje; disse omfatter STAT3 [17] og PIK3-ETK /Bmx [18]. For nylig Delk

et al

viste, at IL-6 secerneret af stromale knoglemarvsceller induceret NED og autofagi i knogler metastatiske PCA celler gennem en STAT3-uafhængige vej [19]. Således har IL-6 blevet foreslået at inducere NED og lettes PCA celler bliver ildfast. Dette gør IL-6 et attraktivt mål for terapi. Men på grund af sin pleiotropism, rettet mod IL-6 er sandsynligvis vil resultere i uforudsigelige reaktioner,. En forbedret forståelse af de cellulære begivenheder i forbindelse med IL-6 eksponering kan hjælpe med at identificere potentielle effektive mål (r) til forebyggelse og /eller behandling af PSA.

Autophagy, også kaldet macroautophagy, er en stor reguleret lysosomal nedbrydning pathway at eukaryote celler anvender til at nedbryde langlivede proteiner og organeller som reaktion på ernæring sult eller metabolisk stress. Denne selv-fordøjelse vej er afgørende for normal udvikling og for at opretholde den intracellulære metaboliske homeostase af terminalt differentierede celler, såsom neuroner. Det er også en central biologisk vej, der fungerer for at beskytte organismer mod forskellige patogener og mod kræft; det således er i stand til at fremme sundhed og levetid. Men når autofagi er kapret af cancerceller, det viser sig som en måde at beskytte tumorceller fra at dø, og dermed er i stand til at bibringe lægemiddelresistens på cancercellerne. Forståelse for de molekylære mekanismer, der er forbundet med autofagi begyndte i 1993, da autofagi gener (ATGs) først blev identificeret i

S. cerevisiae

[20]. Autophagy er en multi-trins proces og kan således opdeles i flere faser; (I) induktion, (ii) vesikel kimdannelse, (iii) vesikel forlængelse og færdiggørelse for at danne autophagosome, (iv) docking og fusion med lysosomer til dannelse autolysosome, (v) nedbrydning, og (vi) hentning [21]. Blandt de vigtigste opstrøms regulatorer af autophagic pathway, klasse I PI3K (PI3KI) -Akt [22] og MEK1 /Erk [23], [24] molekyler linker receptortyrosinkinaser til mTOR; Disse fungerer som centrale negative regulatorer af autofagi og derved undertrykke autofagi i nærvær af insulin-lignende og andre vækstfaktor-signaler. Interessant, funktionen af ​​klasse III-PI3K (PI3KIII) er fuldstændig modsat af PI3KI ved regulering autofagi. Ved at interagere med kernen komponent beclin1, PI3KIII accelererer autophagy ved at fremme vesikel kernedannelse [25]. En mindre mekanismer involverer LKB1-AMPK molekyler, som forbinder den intracellulære energi status af celler til den negative regulering af mTOR; denne vej virker til at aktivere autofagi i tilstedeværelse af spændinger, der øger AMP /ATP-forholdet [26]. Andre mindre mekanismer omfatter p53, ER stress-Ca

2+ signalering, og cytoplasmatisk STAT3. Rollen af ​​p53 i autofagi er paradoksalt og afhænger af dets subcellulære lokalisering [27] – [29]. ER stress ledsager Ca

2+ signalering er også involveret i reguleringen af ​​autophagy og dette sker ved at aktivere CaMKKβ-afhængige AMPK vej [30], [31]. Endelig cytoplasmatisk STAT3 undertrykker autophagy ved binding til protein kinase R (PKR) og hæmmende phosphorylering af eIF2α [32].

NE-lignende celle udvikling forudsætter et netværk af transkriptionelle repressorer og aktivatorer, der styrer køb og vedligeholdelse af neuronale funktioner. Repressorelement-1 silencing transskriptionsfaktoren /neuron restriktiv silencing faktor (REST /NRSF) blev først opdaget som en master transskriptionsrepressor der er ansvarlig for at begrænse neuronal genekspression i ikke-neuronale celler [33] – [36]. Den repressor binder sig til en 21-bp repressor element 1 /neuron-restriktiv lyddæmpning element (RE1 /NRSE) og derefter rekrutterer en undertrykkende kromatin remodeling kompleks, mSin3 og Co-REST. Dette sker via dens to repression domæne (en i den aminoterminale ende og den anden på den carboxylterminale), og resultatet er den epigenetisk inaktivering af transkriptionen af ​​målgenet [37]. REST udtrykkes kraftigt i embryoniske stamceller (EKSF), neurale progenitorceller (NPCs) og ikke-neuronale celler, hvor proteinet undertrykker ekspression af neurale specifikke gener opretholder således pluripotens af ESC og NPC’ere ved at hæmme neuronal differentiering i ikke-neuronale celler [33]. Interessant nok har REST blevet påvist at inhibere gentranskription af synaptophysin (SYN) [38], [39], en af ​​de almindelige markører for NED i PCA-celler. En meget nylig rapport fra Svensson

et al

viste også, at REST medierer AR handlinger og modulerer androgen-berøvelse fremkaldt NED i PCa [40].

For at målrette bidrag NED til progression af PCa i hormonresistent tilstand, den foreliggende undersøgelse har til formål at afgøre, om IL-6 er i stand til at opregulere autofagi i PCA-celler, som igen inducerer celle NED. Dette vil forhindre celleapoptose under IL-6 inducerede NED og som følge heraf vil tillade NE-lignende overlevelse celle i recidiverende PSA. For at imødegå vores hypotese undersøgte vi evnen af ​​IL-6 til at inducere autofagi og NED i androgen-sensitive LNCaP-celler. Vi fandt, at autofagi induceres af IL-6 og spiller en vigtig rolle i IL-6 inducerede NED. I overensstemmelse med aktiveringen af ​​autophagy under NED, kan der observeres en øget grad af LC3 i recidiverende PCa væv og sådant væv har en lignende foci farvning mønster for CgA, en markør for NE-lignende celler. Vi undersøgte autophagy som en potentiel signal, som er i stand til at beskytte PCA-celler fra apoptose og kemoterapi lægemidler såsom etoposid. I overensstemmelse med den øgede niveau af autophagy, AMPK aktivering og mTOR hæmning blev påvist at være til stede under IL-6 behandling i fravær af androgen. Vigtigst er det, vores undersøgelse identificeret nedregulering af REST, en neuron-restriktiv lyddæmper; dette viste sig at være kritisk for NED induktion og autophagy aktivering ved IL-6.

Materialer og metoder Salg

Celledyrkning og plasmider

LNCaP PCA-celler blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco /Invitrogen, 31.800-014) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone, SH30071.03), 1% penicillin /streptomycin (Sigma-Aldrich, P4458) og L-glutamin (Sigma-Aldrich, G7513). LNCaP-celler, der stabilt udtrykker eGFP-LC3, LNCaP-eGFP-LC3, var blevet genereret tidligere [41] og blev opretholdt som beskrevet for LNCaP, men suppleret med 400 ug /ml G418 (Amresco, E859). Den inducerbare shRNA kassette, H1 /TO-shRNA-linker indeholdende et BsmBI skæringssted blev indført i pLenti4 vektoren for at generere en inducerbar shRNA lentiviral vektor, nemlig plenti4-H1 /TO-shRNA. Den inducerbare promotor til shRNA udtryk er en hybrid af H1-promotoren og tet-operator (Invitrogen, H1 /TO). Den shRNA kassette af beclin1 (5′-CACCGGTCTAAGACGTCCAACAACACGAA TGTTGTTGGACGTCTTAGACC-3 ‘), Atg5 (5′-CACCAAGCAACTCTGGATGGG ATTGCGAACAATCCCATCCAGAGTTGCTT-3′) og REST (5’-CACCGTGTAA TCTACAGTATCACCGAAGTGATACTGTAGATTACAC-3 ‘) blev individuelt indsat i plenti4-H1 /TO- shRNA og disse blev derefter indført i LNCaP-TR-celler ved lentiviral transduktion. Cellerne blev selekteret i 14 dage under anvendelse af 50 ug /ml zeocin (InvivoGen, ant-zn-1). Knockdown effektivitet for beclin1 blev Atg5 og REST af shRNAs testet ved at blive behandlet med doxycyclin (Dox) i 48 timer. LNCaP-TR-shBeclin1, LNCaP-TR-shAtg5, LNCaP-TR-shREST blev opretholdt som beskrevet for LNCaP, men suppleret med 5 pg /ml af blasticidin S (InvivoGen, ant-BL-1) og 50 ug /ml zeocin .

Fluorescensmikroskopi

LNCaP celler blev udpladet på poly-L-lysin-coatede dækglas (Marienfeld, 0111530) og efter at være blevet behandlet som angivet, blev de fikseret med 4% paraformaldehyd i 1 × PBS i 15 minutter. Næste dækglassene blev monteret i monteringsløsning [20 mM n-propylgallat, 80% glycerol, 20% 1 × PBS], og visualiseret ved fasekontrastmikroskopi (Lecia, DMI4000B). Længden af ​​neuritter på dækglassene blev analyseret ved MetaMorph (Molecular Devices, neuritvækst). LNCaP-celler viser lavt basisniveau af NED ved normal dyrkningsbetingelser (RPMI 1640 suppleret med 10% FBS). Den gennemsnitlige neurit længde kontrolceller dyrket i RPMI 1640 indeholdende 10% FBS i hver eksperimenter blev anvendt som 1 og en sammenligning blev derefter foretaget for neurit længde opnået efter IL-6 behandlinger. LNCaP-eGFP-LC3 celler blev fremstillet som beskrevet ovenfor for LNCaP-celler med undtagelse af farvning med Hochest 33258 (Invitrogen, H3569) før montering. EGFP-LC3 billeder blev visualiseret ved hjælp af et Lecia DMI4000B fluorescens mikroskop med en 63 × linse og blev analyseret ved MetaMorph (Molecular Devices, Transflour). LNCaP celler viser lave grundlæggende niveau af autophagy under normal kultur tilstand. For at skelne den autophagy induktion blev celler, som viser mere end 50 intense eGFP-LC3 aggregater af 5-7,5 um og 15 intense eGFP-LC3 aggregater på 7,5 til 20 pm tælles som autofagi-positive celler efter induktion.

Western blot og antistoffer Salg

Samlede cellelysater (TCLs) blev fremstillet ud fra celler ved anvendelse af NP-40 lysispuffer [0,5% NP-40 (Amresco, E109), 1 × PBS, 1 × proteasehæmmere (Roche, 04693132001) ]. Proteinkoncentrationen af ​​hver prøve blev derefter målt under anvendelse af Bio-Rad proteinassay farvereagens og producentens protokol (Bio-Rad, 500-0006). For immunoblotting blev lige proteinmængder lastes på og separeret på en 6%, 8% eller 15% SDS-polyacrylamidgel efter behov. De separerede proteiner blev derefter overført fra gelen til 0,45 um porestørrelse PVDF-membraner (GE Healthcare, RPN303F). Næste membranerne blev blokeret med blokeringsbuffer [5% BSA i 1 × TBST]. Primære antistoffer for p-Akt (Ser473) (cellesignalering, # 9271), Akt (cellesignalering, # 9272), p-mTOR (Ser2248) (cellesignalering, # 2976), mTOR (cellesignalering, # 2983), s -STAT3 (Tyr705) (cellesignalering, # 9145), STAT3 (cellesignalering, # 9139), p-Erk (Thr202 /Tyr204) (cellesignalering, # 9101), Erk (Santa Cruz Biotechnology, sc154), p-AMPK (Thr172) (Cell signalering, # 2535), AMPK (Cell signalering, # 2793), LC3B (Cell signalering, # 2775), beclin1 (Cell signalering, # 3738), Atg5 (Cell signalering, # 2630), tubulin III ( cellesignalering, # 5666), androgen receptor (Millipore, 06-680), REST (Millipore, 09-019), og GAPDH (GeneTex, GTX100118) blev fortyndet i 5% BSA i 1 × TBST. Membranerne blev derefter probet med de forskellige primære antistoffer, derefter behandlet med det passende sekundære antistof. Endelig blev membranerne visualiseret ved hjælp af et Pierce ECL Western Blotting Substrat (Thermo Scientific, 34080) og afbildet via en Luminescens /Fluorescence Imaging System (FUJIFILM, LAS-4000).

Immunhistokemi Farvning (IHC-farvning)

paraffinindstøbte prøver fra patienter med primær og recidiverende kastrationsresistent PCa, der var blevet indsamlet mellem 1990 og 2010 på Mackay Memorial Hospital blev inkluderet i denne undersøgelse. Etik blev godkendt af Mackay Memorial Hospital Board Institute anmeldelse. Informeret samtykke blev skrevet. Vævssnit blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret gennem gradueret ethanol (100, 90, 80, 70, 50%), underkastes antigen-genvinding ved mikrobølgeopvarmning i 10 mM citratpuffer (pH 6,0) i 10 minutter, blokerede for endogen peroxidaseaktivitet med 3 % H

2O

2 i 10 minutter ved stuetemperatur, og derefter blokeret med antistoffortyndingsmiddel indeholdende background-reducerende komponenter (DAKO, S302281). Endelig blev slides farvet natten over ved 4 ° C med beclin1 (GeneTex, GTX61619), LC3 (Novus Biologicals, NB110-57179), REST (BETHYL, IHC-00141), eller CGA (Abcam, ab15160) specifikke antistoffer og visualiseret efter standardprotokol anvendelse af 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) som kromogen (DAKO, K346430) i nærvær af hematoxylin modfarvning. Den histologi og farvning blev evalueret af en patolog i en blind måde under anvendelse af en fire-lags skala repræsenterer negative (0), svagt (1), mellemprodukt (2), stærk (3) signaler.

Det 3 – (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay

LNCaP, LNCaP-TR-shBeclin1, og LNCaP-TR-shAtg5 celler blev podet i 96-brønds plader, dyrket i to dage, og derefter behandlet som angivet. Dernæst blev cellelevedygtigheden undersøgt ved MTT-assayet (Sigma-Aldrich, M5655). MTT blev tilsat ved en slutkoncentration på 0,5 mg /ml og formazankrystallerne blev opløst ved 10% SDS. Den optiske densitet (OD) blev kvantificeret ved anvendelse af en mikroplade-spektrofotometer ved en bølgelængde på 570 og 660 nm.

Caspase-3/7 ELISA assay

LNCaP-celler blev udpladet i plader med 96 brønde . Den følgende dag blev cellerne behandlet som angivet. Caspase-3/7 aktivitetsniveauer blev derefter målt under anvendelse af en Apo-ONE Homogen caspase-3/7 (Promega, TB295) ifølge fabrikantens protokol. Cellerne blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med blandingen af ​​substrat og reaktionspuffer. Caspase-3/7 aktiviteter var derefter målt under anvendelse af en fluorescensmikropladelæser (Tecan Systems, Infinite 200).

Reverse Transcription (RT) og kvantitativ PCR (qPCR)

Totalt RNA blev isoleret fra ikke-inducerede og Dox-induceret LNCaP-TR-shREST celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, 15.596-018). Totalt RNA (2 ug) blev revers transkriberet under anvendelse af oligo-dT og SuperScript

III RT (Invitrogen, 18.080-085). MRNA niveauerne for forskellige gener blev derefter bestemt af qPCR og normaliseret mod GAPDH.

Resultater

IL-6 og androgendeprivation Synergistisk Fremkald Autophagy i LNCaP Celler

Stigende beviser har vist, at autophagy spiller en vigtig rolle ved at støtte neuronal differentiering [42] – [44]. En nyere undersøgelse viser desuden, at antophagy kan spille en væsentlig rolle i IL-6-induceret NED af ben metastatiske PCA celler [19]. Serumniveauerne af IL-6 har vist sig at stige i patienter, der gennemgår androgen-deprivation terapi (ADT) [12], [14]. Androgen-berøvelse [45] og IL-6 [18] er også fundet ansvarlig for NED udvikling og PCa refraktære over for ADT. For at undersøge, om autofagi aktiveres sammen med NED af PCa celle under ADT, blev androgen deprivation og IL-6 kombineret behandling anvendes i her. LNCaP-cellelinien, en androgen-sensitive humane prostata-adenocarcinom-cellelinje hurtigt erhverver NE kendetegn, herunder ophør af mitose, neurit-udstrækning og forøget ekspression af neuronale markører, såsom tubulin III, når de stimuleres, blev valgt til undersøgelsen. LNCaP-celler, der stabilt udtrykker eGFP-LC3, nemlig LNCaP-eGFP-LC3 celler, blev dyrket i regelmæssig medium indeholdende 10% FBS, 2,5%

trækul /dextran

-behandlede FBS (

CDT

) ( androgen-berøvelse tilstand), eller 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL-6. Autophagosomic celler (celler med GFP-LC3-II punctation) var optælling ved hjælp af faste LNCaP-celler efter 48 timers behandling. Androgen-berøvelse øget antallet af celler, som undergår autofagi til 41% (fig. 1). IL-6 alene øgede antallet af autophagic celler til 17% (fig. 1). Interessant nok blev antallet af celler, som undergår autofagi induceret af IL-6 under androgen-berøvelse signifikant forøget yderligere til 87% (fig. 1). Induktionen af ​​NED ved androgen deprivation og IL-6 behandling blev bekræftet under anvendelse af LNCaP-celler. Neurit forlængelse, en typisk fænotype af NED-celler, blev observeret (fig. 2A og 2B). Interessant nok blev graden af ​​autophagy induktion stærkt korreleret med graden af ​​NED blandt LNCaP-celler. Denne korrelation blev yderligere bekræftet ved Western blot analyse. IL-6 behandling steg betydeligt ekspressionen af ​​neuron-specifikke markør, tubulin III og omdannelsen af ​​LC3-I til LC3-II (fig. 2C). Vores resultater tyder på, at aktiveringen af ​​autofagi kan være påkrævet for IL-6-induceret NED under androgen deprivation betingelser.

(A) LNCaP-eGFP-LC3 celler blev kulturen i 10% FBS, 2,5% FBS eller 2,5 % CDT suppleret RPMI 1640 i fravær (kontrol) og nærvær af 100 ng /ml IL-6 i 48 timer. Dette blev efterfulgt af fiksering, nuklear kontrastfarvning med DAPI (blå), og analyse ved fluorescensmikroskopi (FITC, 63 × forstørrelse). (B) For hver behandling blev procentdelen af ​​celler med eGFP-LC3 punktformig beregnet ved hjælp af gennemsnit fra 15 mikroskopiske felter;

barer

, SD.

(A) LNCaP-celler blev behandlet med 2,5% CDT eller 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL-6 i 48 timer. Den inducerede neurit forlængelse blev vurderet ved hjælp af lysfelt mikroskopi billeder (40 × forstørrelse). (B) Den neurit forlængelse blev kvantificeret ved hjælp af gennemsnittet fra 3-5 mikroskopiske områder;

barer

, SD. (C) LNCaP-celler blev behandlet som beskrevet i (A). Totale cellelysater (TCLs) blev fremstillet og derefter immunblottet at detektere tubulin III, androgen receptor (AR) og LC3. GAPDH blev anvendt som lastning kontrol.

Autophagy Hæmning blænder NED i LNCaP Celler

For at bestemme om autophagy induktion er afgørende for IL-6-induceret NED under androgen afsavn betingelser, vi hæmmer autophagy hjælp chloroquin (CQ), en autophagy inhibitor, der blokerer funktionen af ​​lysosomet. Som vist i figur 3A, CQ (50 uM) inhiberede stærkt IL-6-induceret NED i LNCaP-celler og let nedsat differentieringen induceres af androgen deprivation. Kvantificering af neurit længde af MetaMorph viste der var også signifikant inhibering af denne fænotype (Fig. 3B). CQ kan have andre end den ikke-specifikke virkninger Inhiberingen af ​​autofagi pathway. For yderligere at bekræfte betydningen af ​​autofagi pathway til IL-6-induceret NED under de androgen deprivation betingelser, anvendte vi små hairpin RNA’er (shRNAs), shBeclin1 og shAtg5, at knockdown ekspressionen af ​​beclin1 (Atg6) og Atg5, to ATG-gener afgørende for autophagy initiering og autophagosome dannelse hhv. Først vi etableret et shBeclin1 inducerbar knockdown cellelinje og en shAtg5 inducerbar knockdown cellelinje i LNCaP celler, nemlig LNCaP-TR-shBeclin1 og -shAtg5. Immunoblotting viste, at begge shRNAs kunne knockdown deres mål med succes (fig. 4A og 5A). Interessant beclin1 knockdown-celler udviste en signifikant lavere grad af NED end kontrolceller (fig. 4B og 4C) og et lignende resultat blev observeret i Atg5 knockdown celler (fig. 5B og 5C). Kvantificering data viste, at både Atg5 og beclin1 knockdown har signifikant inhibering effektivitet i IL-6 inducerede NED (fig. 4C og 5C). I overensstemmelse med cellemorfologien, inhibering af NED ved at slå ned beclin1 og Atg5 blev identificeret ved Western blot-analyse ved anvendelse af tubulin III-antistof (fig. 4D og 5D). Sammen disse resultater viser, at autophagy vej er afgørende for PCA celler til at undergå NED.

(A) LNCaP-eGFP-LC3 celler blev behandlet med 2,5% CDT eller 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL 6, i fravær og nærvær af 50 uM chloroquin (CQ) i 48 timer. Dette blev efterfulgt af fiksering, nuklear kontrastfarvning med DAPI (blå), og analyse ved fluorescensmikroskopi (FITC, 40 × forstørrelse). (B) Den neurit forlængelse blev kvantificeret ved hjælp af gennemsnittet fra 3-5 mikroskopiske områder;

barer

, SD.

(A) LNCaP-TR-shBeclin1 celler blev behandlet med 1 pg /ml Dox i 48 timer. TCLs blev fremstillet og immunblottet at detektere beclin1 hjælp GAPDH som lastning kontrol. (B) LNCaP-TR-shBeclin1 celler blev behandlet i 48 timer med 1 ug /ml Dox for at inducere knockdown af beclin1 og de blev derefter behandlet i yderligere 48 timer med 2,5% CDT eller 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL -6 til at inducere celle NED. Hæmningen af ​​neurit forlængelse af beclin1 knockdown blev vurderet ved hjælp af lysfelt mikroskopi billeder (40 × forstørrelse). (C) Den neurit forlængelse blev kvantificeret ved hjælp af gennemsnittet fra 3-5 mikroskopiske områder;

barer

, SD. (D) TCLs blev opnået fra LNCaP-TR-shBeclin1 celler behandlet som beskrevet i (A), og disse blev derefter analyseret ved immunoblotting under anvendelse af de angivne antistoffer.

(A) LNCaP-TR-shAtg5 celler blev behandlet med 1 ug /ml Dox i 48 timer. TCLs blev fremstillet og immunblottet at detektere Atg5 hjælp GAPDH som lastning kontrol. (B) LNCaP-TR-shAtg5 celler blev behandlet i 48 timer med 1 ug /ml Dox at inducere knockdown af Atg5 og derefter behandlet i yderligere 48 timer med 2,5% CDT eller 2,5% CDT plus 100 ng /ml IL-6 til at inducere celle NED. Hæmningen af ​​neurit forlængelse af Atg5 knockdown blev vurderet ved hjælp af lysfelt mikroskopi billeder (40 × forstørrelse). (C) Den neurit forlængelse blev kvantificeret ved hjælp af gennemsnittet fra 3-5 mikroskopiske områder;

barer

, SD. (D) TCLs fås fra LNCaP-TR-shAtg5 celler behandlet som beskrevet i (A), og disse blev derefter analyseret ved immunoblotting under anvendelse af de angivne antistoffer.

Autophagy genekspression i Primary og recidiverende PCA Prøver

ovenstående resultater tyder på, at autophagy kan aktiveres sammen med NED i PCA celler under hormon-refraktær tilbagefald. At karakterisere forholdet mellem autofagi og NED i PCA-celler undersøgte vi ekspressionen af ​​CGA, hvilket er en NE tumormarkør, og ekspressionen af ​​LC3, et autophagy gener, i tretten par af primære og hormon-refraktær recidiverende PCA vævsprøver , parrene opnået fra den samme patient. Repræsentant immunhistokemi (IHC) resultater for CgA og LC3 er vist i figur 6. Den positive CgA farvning viser en foci mønster (figur 6, lukkede pile.), Hvilket er et typisk træk ved NE celler i recidiverende PCA prøver; men dette mønster ikke var til stede i de primære PCA prøver. Interessant nok blev en foci farvning af LC3 også observeret i recidiverende PCA prøver (fig. 6, åbne pile). Ud af de tretten par af PCA prøver, 8 (62%) viste en signifikant stigning i LC3 ekspression (gennemsnitlig LC3 immunreaktivitet (IR) for primær og recidiverende PCa tumor var 0,51 og 1,12, henholdsvis; P 0,005) i recidiverende PCa væv sammenligning til deres primære tumor modstykke.

repræsentant IHC farvning billeder af to par vævsprøver, nemlig primær og recidiverende PCa prøver fra samme individ, blev farvet ved hjælp af anti-LC3, anti-CgA, og anti-REST-antistoffer .

Autophagy induceret af IL-6 Beskytter NE differentieret LNCaP celler fra Cell Død

Autophagy er vigtig for opretholdelsen af ​​homeostase af terminalt differentierede celler [46]. Den observation, at autofagi er neurobeskyttende [47], og at autofagi induceres af IL-6 fik os til hypotesen, at autofagi kan tjene som en beskyttende mekanisme for at opretholde homeostase og øge overlevelsen af ​​IL-6-induceret terminalt differentierede NE-lignende celler . Hvis dette er tilfældet, celledrab burde forstærkes, hvis autofagi inhiberes. Til dette formål har vi udført en MTT assay til at identificere den rolle, som autophagic vej hos IL-6-induceret vækststandsning og modstand mod celledød. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, IL-6 behandling induceret vækststandsning i LNCaP-celler (fig. 7A). Når autophagy blev inhiberet ved behandling med CK, dette inducerede en signifikant forøgelse i celledød blandt IL-6 behandlede LNCaP-celler (fig. 7A). Den øgede celledrab viste sig at være i høj grad skyldes øget apoptose, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af ​​en betydelig stigning i caspase-3/7 Aktivitetsmenutast 48 timer efter IL-6 plus CQ kombineret behandling (fig. 7B). Disse resultater viser for første gang, at inhibering af autofagi er i stand til at overvinde den apoptose-resistens af IL-6-indued NE differentierede celler og viser, at autofagi er den underliggende årsag bag kemoresistens af NE-lignende celler.

(A) LNCaP-celler blev dyrket i 2,5% CDT suppleret RPMI 1640 og derefter behandlet med 100 ng /ml IL-6 eller vehikelkontrol i nærvær eller fravær af 50 uM CQ. Celleantal blev analyseret under anvendelse af en MTT celleviabilitetstest i de angivne tidspunkter.

Points

, betyder;

barer

, SD. (B) LNCaP-celler blev behandlet som beskrevet i (A) og derefter analyseret for caspase-3/7-aktivitet ved de angivne tidspunkter. Hvert datapunkt vist er middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg;

barer

, SD.

Den beskyttende rolle autophagy i kemoresistens af NE differentierede PCA celler til kemoterapeutiske lægemidler, såsom etoposid blev derefter bekræftet af de følgende resultater. Som forventet, etoposid var ikke i stand til at dræbe IL-6 inducerede NE differentieret LNCaP-celler. Interessant, etoposid inducerede en statistisk signifikant stigning i celledød efter knockdown af enten beclin1 eller Atg5 i NE differentierede LNCaP-celler, der var blevet induceret af IL-6 under androgendeprivation betingelser (Fig. 8). Når de tages sammen, de ovennævnte resultater antyder, at autofagi induceret af IL-6 i stand til at beskytte IL-6-induceret NE differentierede LNCaP-celler fra apoptotisk celledød og at en inhibering af autofagi er i stand til at ophæve det apoptose resistens samt kemoterapi modstand forbundet med NE-lignende PCA-celler.

LNCaP-TR-shBeclin1 (A) og LNCaP-TR-shAtg5 (B) celler blev behandlet med Dox i 48 timer til induceret enten beclin1 eller Atg5 knockdown henholdsvis eller venstre ubehandlet.