PLoS ONE: Yderligere karakterisering af HDAC og SIRT Gene Expression Opskrifter i kræft i bugspytkirtlen og deres relation til sygdom Outcome

Abstrakt

duktalt adenokarcinom i pancreas er ranking 4 for patient død fra ondartet sygdom i de vestlige lande, med nogen tilfredsstillende behandling. Vi re-undersøgte mere præcist histondeacetylaser (

HDAC

) og sirtuin (

SIRT

) genekspression mønstre i bugspytkirtelkræft med flere pancreas tumorer og normale væv. Vi examinedthe også muligt forhold mellem

HDAC

genekspression niveauer og lang sigt sygdom resultat. Desuden har vi vurderet ved anvendelse af en

in vitro

modelsystem for human pancreas tumorcellelinie hvorvidt HDAC7 knockdown kan påvirke cellens opførsel. Vi analyserede 29 pancreasadenocarcinom (PA), 9 kronisk pancreatitis (CP), 8 godartet pancreas (BP) og 11 normale pancreas væv. Med hensyn pancreas adenocarcinom, var vi i stand til at indsamle biopsier på tumoren periferien. For at vurdere den mulige inddragelse af HDAC7 i celledeling kapacitet, har vi genereret rekombinant humant Panc-1 tumor som underexpressed eller overudtrykte HDAC7. Udtrykket af

HDAC1,2,3,4,7 og Nur77

steg i PA prøver på niveauer signifikant højere end dem, der observeres i CP-gruppen (

s

= 0,0160, 0,0114, 0,0227; 0,0440, 0,0136, 0,0004, henholdsvis). Udtrykket af HDAC7, var signifikant større i PA sammenlignet med BP vævsprøver (

s

= 0,05). Mean mRNA transskription niveauer af PA for

HDAC7

HDAC2

var højere i forhold til deres modpart biopsier taget på tumor periferien (

s

= 0,0346, 0,0053, henholdsvis) . Desuden opnåede ved hjælp af konfokal mikroskopi data og en kvantitativ metode til immunfluorescensfarvning støtter kraftigt HDAC7 overekspression i PA kirurgiske prøver. Antallet af dødsfald og gentagelser i slutningen af ​​follow up var signifikant større hos patienter med overekspression af

HDAC7

. Interessant nok blev vækstraten signifikant reduceret i tilfælde af cellen der bærer shRNA konstruktion målretning HDAC7 kodende gen sammenlignet med de parentale Panc-1 tumorceller (p = 0,0015) ved 48 timer og 96 timer (p = 0,0021). Denne undersøgelse kraftigt støtte den tanke, at HDAC7play en rolle i pancreas adenocarcinom progression

Henvisning:. Ouaïssi M, Silvy F, Loncle C, Ferraz da Silva D, Martins Abreu C, Martinez E, et al. (2014) Yderligere karakterisering af

HDAC

SIRT

Gene Expression Opskrifter i kræft i bugspytkirtlen og deres relation til Disease Outcome. PLoS ONE 9 (10): e108520. doi: 10,1371 /journal.pone.0108520

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget: Marts 17, 2014 Accepteret: Juni 24, 2014, Udgivet: 2 oktober 2014

Copyright: © 2014 Ouaïssi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Kliniske data er grupperet på: SIRIC- site intégré de Recherche en Cancérologie, program med titlen: Alternative strategier i pancreas behandlinger mod kræft. Anmodning kan sendes til chefen for afdelingen, Dominique Lombardo (Tel +33 (0) 491 324 402)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af institutionel finansiering fra INSERM (Paris, Frankrig) og Aix -Marseille Université (Marseille, Frankrig) og af en bevilling inca-DGSO-INSERM 6038 fra steder de Recherche Intégrée sur le Cancer (SIRIC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ductal adenocarcinom i pancreas er ranking 4 for patientens død af maligne sygdomme i de vestlige lande [1]. Den aggressivitet af denne kræft er påvist ved en sygdomsrelateret dødelighed tæt tilnærme forekomsten [2]. Kræft diffusion og metastase udgør ca. 90% af alle kræftrelaterede dødsfald [2]. Metastase følger en flertrinsproces komplekse processer, hvor tilstødende sunde væv er invaderet af primære tumorceller, og som har adgang til det systemiske kredsløb og endelig formere på fjerne steder i makroskopiske sekundære tumorer via perivaskulær og /eller perilymfatisk væv [3]. I tilfælde af pancreascancer, de fleste af de patienter, der allerede har metastaser på diagnosetidspunktet. En række undersøgelser har fokuseret på at identificere mulige markører, der kan give mulighed for tidlig diagnosticering af kræft i bugspytkirtlen. Specifikke begivenheder der fremmer tumorigenese og kræft progression er forbundet med komplekse molekylære modifikationer, såsom DNA-methylering, histonacetylering, phosphorylering, ubiquitylering og ADP ribosylering. I øjeblikket resultater fra grundforskning understrege vigtigheden af ​​acetylering og deacetylering på niveau med ikke kun histon lysinrester men også andre cellulære faktorer, som formodes at forstyrre reguleringen af ​​genekspression. Faktisk er steady-sad acetyleringsgraden af ​​centrale histoner kontrolleret af de modsatrettede handlinger histon actetyltransferases (HATS) og histondeacetylaser (HDAC), hvis aktiviteter er korreleret med gen-aktivering og gen undertrykkelse eller tavshed [4]. Voksende viden om HDAC viser, at de er regulatorer af vækst, differentiering og celledød (apoptose). Dysfunktion af transkriptionel repression medieres af HDAC kan føre til carcinogenese. Faktisk graduering af ekspressionsniveauer af gener, der koder HDAC’er (over- og /eller under-udtryk) er blevet rapporteret for forskellige typer af kræft [5], [6], [7], [8]. Karakteriseringen af ​​centrale gener, der spiller en rolle i bugspytkirtlen tumor udvikling ikke kun tillader at afdække nye biomarkører, der bliver fokus for intensiv forskning interesse, men vil også kaste lys over potentielle genprodukter kan udnyttes til design af selektive midler at interferere med tumorudvikling. Nylige undersøgelser viste [9], [10], HDAC2 blev overudtrykt i pancreas adenocarcinom vævsprøver. For at give indsigt i den biologiske opførsel af kræft i bugspytkirtlen og identificere nye potentielle biomarkører, vi har i de seneste par år iværksat en undersøgelse med det formål at undersøge niveauet af

HDAC

og

SIRT

gener ekspression i et sæt af kirurgisk resektion pancreas væv, herunder 11 pancreasadenocarcinom prøver og en normal pancreas væv. Trods relativt lille antal eksemplarer undersøgte, fandt vi øget udtryk for HDAC7, en klasse IIa deacetylase, i 9 ud af 11 prøver [11], [12]. selv om vi har brugt en normal pancreas som kalibratoren for genekspression måling og andre prøver i nærheden eller langt væk fra tumoren som kontroller, vi troede dog, at yderligere undersøgelser ved hjælp af et større antal af normale pancreas væv og tumor prøver er nødvendige for at atter gennemgå mere præcist

HDAC

og

SIRTs

genekspressionsmønstre i kræft i bugspytkirtlen. Desuden blev gjort forsøg på at undersøge den mulige sammenhæng mellem HDAC genekspression og resultatet sygdom. Vi vurderer også ved hjælp af en

in vitro

modelsystem for human pancreas tumor cellelinie, om HDAC7 knockdown kan påvirke cellens opførsel.

Materialer og metoder

Emne befolkning

Fra maj 2007 til august 2012, 29 pancreas adenocarcinom (PA), 9 kronisk pancreatitis (CP), 8 benigne pancreas tumorer, herunder serøs cystadenoma (SC) n = 2, mucinøs cystadenoma (n = 2), godartet IMPN ( n = 2), godartet cyste (retentional cyste, n = 1), og bugspytkirtlen endokrine tumor (n = 1), blev taget ansvaret i afdelingen for Kirurgi på la Timone Hospital (Marseille, Frankrig). Alle patienter gennemgik kontrast-forstærket thorax og abdominal computertomografi, abdominal ultralyd, magnetisk resonans og blodprøver. PA havde ingen præoperative behandling før operation. Tyve to pancreaticoduodenectomies (PD), og 7 venstre pancreatectomies blev gennemført for pancreas adenocarcinom, hhv. To PD, 4SP og 3 Frey procedurer [13] blev udført for CP. Fire PD, 2 SP og 2 mediale pancreatectomies blev udført for benigne læsioner. Fire normale pancreas (NP) biopsier blev opnået under levertransplantation på donor hepatektomi blev 7others opnået under susmesocolic operation, når radikale gastrektomi kræves venstre pankreatektomi: 3 ampulloma (AP1-3), 2 cholangiocarcinom af hovedstolen galdegang (BD1-2) , 1 gastrinom af duodenum (G), 1 normal tilstødende væv prøver efter gastrisk resektion for gastrisk adenocarcinom. Desuden er 11 prøver af kontrol væv taget ved periferien af ​​de kirurgiske prøver fra forskellige patienter med PA blev også inkluderet i denne undersøgelse. Data blev prospektivt indsamlet og et standardiseret spørgeskema blev afsluttet på tidspunktet for opfølgning og undersøgelse vurdering. Forud for operationen alle patienter havde underskrevet et informeret samtykkeerklæring, der var blevet godkendt af de lokale etiske komité. Beskyttelse udvalgets folk sydlige Middelhavsområde II, der er godkendt af bekendtgørelse dateret 31 maj 2012, stiftet i henhold til rækkefølgen af ​​generaldirektør for sundhed Agency Region Provence Alpes Côte d’Azur af 13. Juni 2012, der består af: L. BOYER, V. PRADEL, B. DUSSOL, C. Sichel, M. CAILLOL, F. VINCENT, G. NAURAYE, JP. VIDAL, O. SCHWEITZER, J. ACCIARO, diskuteret i plenum erklæringen fil opbevaring og forberedelse til videnskabelige elementer af det menneskelige legeme er identificeret af Ministeriet for videregående uddannelse og forskning under henvisning DC-2013-1857, og hvis videnskabelig direktør er Dominique Lombardo, afgav en positiv ekspertrådgivning (Filer S1, S2).

Kirurgi

Alle kirurgiske indgreb blev udført af tre erfarne pancreas kirurger (BS, YPLT, IS, MO). Erfarne senior kirurger udført alle pancreas hoved resektioner. PD blev udført ved hjælp af en pylorus bevare eller Whipple procedure, og en ende-til-ende pancreaticojejunostomy (PJA) blev konstrueret med et enkelt lag anastomose af afbrudte 5-0 PDS (Ethicon kirurgi) absorberbare suturer. Valg af kirurgisk teknik blev besluttet per-operativt bundet til kirurgens beslutning. Anterior SMA tilgang blev derefter rutinemæssigt brugt siden år 2001 at standardisere radikalitet af resektion på stedet for den retroperitoneal margen. Standard lymphadenectomy blev udført før 2001 og udvidet lymphadenectomy siden da [14]. Frosne sektion eksamen ved pancreas trans-sektion line, blev udført i alle tilfælde, og blev ikke invaderet for alle PA. Standard lymphadenectomy blev udført langs hepatoduodenal ledbånd og den fælles hepatisk arterie [15]. Alle resektioner blev udført via laparotomi. I tilfælde af venstre pankreatektomi: teknikken med distale pankreatektomi begynder med deling af pancreas hals før kontrol med milt fartøjer blev anvendt [16]. Tidlig hals division giver sikrere vaskulær kontrol. For distal pankreatektomi, primær del af halsen og milt fartøjer ligation, kombineret med deling af venstre mave-epiploic og korte gastrisk fartøjer, forud mobilisering af en devascularized prøve, falder operativ blødning og synes mest velegnet fra en carcinologic synspunkt. Efter kirurgi patienter modtog adjuverende kemoterapi i funktion af deres performance status, og ved skøn af onkolog. To bløde afløb (Peters) eller venstre bugspytkirtlen sektion for venstre pankreatektomi blev rutinemæssigt placeret nær pancreaticojejunal anastomose. Operative tid blev indspillet. I mangel af en fistel blev afløb fjernet efter 7 dage.

Vævsprøver

Alle kirurgiske prøver blev gennemgået af en højtstående patolog. Klinisk og patologisk iscenesættelse (tabel S1) blev revurderet i henhold til amerikansk fælles udvalg om kræft TNM stadieinddeling af kræft i bugspytkirtlen om PA. Tumorerne havde været lynfrosset i RNA senere og flydende nitrogen i 15 sekunder og straks opbevaret ved -80 ° C. Tumorer karakteristika blev registreret i alle patienter (tabel S1). Dette omfattede sin placering, median størrelse på diagnosetidspunktet, UICC iscenesættelse, udvidelse af neoplastisk sygdom ved diagnose, antal metastase websteder, når til stede, og nodal status. Alle prøver blev gradueret efter regler klassificeringskriterier 6

th udgave (2002) af amerikanske Blandede Cancer Staging Manuel (AJCC) [17]. Den radikalitet af resektion blev gradueret efter R-klassificering af Den Internationale Union mod Kræft (R0: ingen residual tumor, R1: mikroskopisk residual tumor, R2: makroskopisk residual tumor

in situ

) [18]. Den retroperitoneal margen blev gradueret R1 hvis residual mikroskopisk tumor blev identificeret inden for 1 mm i det transeuropæiske sektion line [19]. Siden år 2002 blev den patologiske undersøgelse af de kirurgiske prøve standardiseret i henhold til Luttges

et al.

Protokol [20], ved hjælp af rutine blæk markering af retroperitoneale trans-sektion linje. I tilfælde af vaskulær resektion blev den komplette vaskulære segment indlejret og begge ender blev undersøgt separat som yderligere resektion marginer.

Tissue Behandling og immunofluorescens histologiske Undersøgelse

Vævsprøver (21 PA og 6 NP prøver ) blev rutinemæssigt fikseret i 10% formalin, indlejret i paraffin og yderligere skåret i 5 mm sektioner umiddelbart opbevaret ved 4 ° C eller farvet med hematoxylin-phloxine-safran (HPS).

Reagenser og mAb’er

for Western blot-analyse, et monoklonalt muse-anti-actin-antistof og POD-mærket anti-muse-antistof {fra Sigma (St Louis, MO)}, blev anvendt. En kanin polyklonalt anti-HDAC7 antistof var fra Euromedex (Souffelweyersheim, Frankrig), POD-mærket anti-kanin antistof var fra Cell Signaling (Beverly, MA). DMEM cellekulturmedier, penicillin, streptomycin, trypsin-EDTA, hygromycin B og neomycin var fra InVitrogen (Carlsbad, NM) at foretage den immunfarvning, monoklonalt muse-antistof (mAb) anti-HDAC7 (20 ug /ml, Sigma-Aldrich, Frankrig ), og en kanin anti-Nur77 antistof (Ab) (5 ug /ml, Thermo Scientific, CergyPontoise, Frankrig) blev anvendt. Biotin-konjugeret F (ab ‘) 2-fragment af ged-antistoffer mod muse IgG (Beckman Coulter, Roissy CDG, Frankrig) eller biotin-konjugeret gede-anti-kanin-IgG (Sigma-Aldrich) HDAC7 og Nur77 immunfarvning henholdsvis blev anvendt.

Immunofluorescens

formalinfikserede, paraffinindlejrede vævssnit (5 um) blev afparaffiniseret og behandlet med et antigen hentning opløsning. Vævssnit blev inkuberet 2 timer ved stuetemperatur (RT) med anti-HDAC7 eller anti-Nur77 og vasket i PBS. Snit blev derefter vasket i PBS og inkuberet 1 time ved stuetemperatur med 1:50 fortynding af biotin-konjugeret F (ab ‘) 2-fragment af gede-antistoffer til muse-IgG eller biotin-konjugeret gede-anti-kanin-IgG i HDAC7 og Nur77 immunfarvning hhv. Snittene blev vasket i PBS, behandlet 1 time ved stuetemperatur med 1:50 fortynding af streptavidin-fluorescein (Beckman Coulter). Alle snit blev monteret i Dako vandigt permanent monteringsmedium.

Snit blev observeret ved hjælp af et Zeiss Axiovert 200 M inverteret mikroskop med 20 mål, og et konfokalt laserscanningsmikroskop (CLSM) (Leica, TCS SP5) med en 60 mål. En argon-laser med en excitation af 488 nm blev anvendt til at aktivere den grønne fluorescens.

Billede Processing

Billeder blev forarbejdet som beskrevet tidligere [11]. For hver primært antistof, blev farvningen beregnet som forholdet mellem den totale fluorescens af området (total specifik fluorescens) og overfladen af ​​dette område (gennemsnitlig specifik fluorescens, MSF). Middelværdier af seks farvede områder for hvert biopsi blev derefter beregnet.

opfølgende

Postoperativ opfølgning omfatter kliniske, biokemiske og radiologiske vurdering hver 3. måned i det første postoperative år, så, hver 6. måned op til en postoperativ forsinkelse på 5 år og bagefter hvert år op til 10 års opfølgning. Ingen patient var tabt for opfølgning. De overlevende patienter blev vurderet for recidiv og sted for tilbagefald. Opfølgning oplysninger blev indhentet fra journaler og direkte patienters høring. Opfølgning fortsatte for alle patienter i denne kohorte-juni 2013 uden at medtage nye patienter. Langsigtet opfølgning var til rådighed for alle patienter. Den gennemsnitlige varighed af opfølgning var 16 måneder (median: 18 måneder, interval: 2-53). Længden af ​​overlevelse blev beregnet fra datoen for operationen indtil dødsdagen eller den dato, som den foreliggende undersøgelse blev afsluttet.

Cell vækst og proliferation

Panc-1 celler (ATCC, CRL-1469) stammede fra human pancreas carcinoma blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FCS, 1% penicillin (100 U /ml), 1% streptomycin (100 ug /ml) og glutamin (1 mM). Celler blev podet med 4000 celler

pr

brønd i en 96-brøndsplade og cellevækst blev vurderet ved 24, 48, 72 og 96 timer ved 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyl (MTT) assay. Resultaterne er givet som middelværdi ± SD (n = 8) og er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg.

Celler transfektion

Silencing af HDAC7 genet blev udført ved stabil transfektion af Panc-1-celler med SureSilencing shRNA plasmid til human HDAC7 (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig), som giver hygromycin resistens over for transficerede celler. Overekspression af HDAC7 blev udført ved stabil transfektion under anvendelse pCDNA3-HDAC7-Flag plasmid (plasmid Addgene 13824, Eric Verdin, J. David Gladstone Institutes, San Francisco, CA, [21]), som giver neomycinresistens til transficerede celler. Panc-1-celler ved 50-80% konfluens blev transficeret med Lipofectamine LTX Reagens med PLUS Reagent (InVitrogen) ifølge producentens anvisninger. Efter en 6 timers inkubation ved 37 ° C i 5% CO2 blev transfektionsblandingen mediet erstattet med komplet DMEM-medium i 48 timer og derefter med frisk medium indeholdende 300 ug /ml hygromycin B (shRNA plasmid) eller 2 mg /ml neomycin (pCDNA3 -HDAC7-Flag plasmid). Efter 1-2weeks, i selektivt medium en grænse fortynding blev udført. Udvalgte kloner blev benævnt SH eller pFLAG cellekloner hhv. Kontroltransfektioner blev udført under anvendelse shRNA CTL vektor eller pCDNA3 tom vektor.

SDS-PAGE og Western blotting

Celler blev vasket tre gange med iskold PBS, høstet og pelleteret ved centrifugering. Pellets blev vasket to gange og lyseret ved 4 ° C i 0,1 ml lysisbuffer {50 mM Tris /HCI pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, proteaseinhibitorer (Complete ™, Roche Diagnostics)} . Homogenater blev inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C og klaret ved centrifugering ved 10 000 g i 30 minutter ved 4 ° C og nedfrosset ved -20 ° C. En alikvot blev gemt til proteinbestemmelse ved hjælp af bicinchoninsyre Kit (Sigma, St. Louis). Ens mængder af cellelysater (100 ug) i reducerende SDS-buffer blev resolveret på gradient 8-16% Tris-glycin polyacrylamidgeler (Pierce). Efter elektroforetisk migration blev proteiner overført på nitrocellulosemembraner og bearbejdet til immunoblotting ved anvendelse af passende primære og sekundære antistoffer. Efter vask blev membraner afsløret ved chemiluminescens (Roche diagnostiske, Meylan, Frankrig).

RNA isolation og revers transkription

væv (≈30 mg) blev afbrudt i 600 pi Buffer RLT Plus ( Qiagen) ved anvendelse af en tilpasset størrelse fartøj til forstyrrelser og homogenisering med en Tissue Ruptor. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af All Prep DNA /RNA mini kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. RNA-koncentrationen blev bestemt ved absorption og RNA integritet blev kontrolleret på RNA Nano chips (Agilent, Santa Clara, CA). Revers transkription (RT) reaktioner blev udført på 1 ug totalt RNA ved anvendelse Improm-II Kit (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. D e celler blev høstet og pellets til RNA oprensning blev behandlet med det samme i RLT lysepuffer (Qiagen). Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy mini kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. RNA-prøver blev behandlet med DNase I (DNA-free kit, Ambion Inc., Austin, Texas) for at fjerne spor af forurenende genomisk DNA. Revers transkription (RT) reaktioner blev udført på 1 ug samlet RNA under anvendelse af vilkårlige hexamerer og M-MLV revers transkriptase (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.

Real-time kvantitativ PCR (Q RT-PCR) Salg

Q RT-PCR-reaktioner blev kørt tredobbelt på to uafhængige RNA-præparater fra cellulære kloner ved anvendelse af LightCycler480 SYBR Green i Master mix og LightCycler real time PCR instrument (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) som beskrevet tidligere [12]. Primerne er opsummeret i tabel S2. Primere blev udformet til at opformere et ca. 200 bp fragment i den kodende sekvens af 11 gener, der tilhører de HDAC /SIR familier. 28S RN-genet blev valgt som kontrol. Komparativ analyse af Crossing Punkt Ct-værdier (gennemsnit af

Cp

) af de 4 NP og de 7 normale pancreas biopsier for det sæt af HDAC og SIRT samt Nur77 gener viste, at de var af samme værdier med nogen statistisk signifikant forskel (figur 1, tabel S3). Derfor blev de 11 biopsier prøver udformet som en kontrolgruppe (CG) og deres gennemsnit

Cp Salg værdier for alle gener blev bestemt og anvendt som kalibratoren. De 2

-ΔΔCt metode blev anvendt til at analysere den relative genekspression [22]. De gennemsnitlige Ct (CP-værdier) blev beregnet for både målet og 28S genet og ACt (C

t,

mål

-C

t,

28S

) var fast besluttet. Den CG blev brugt som kalibratoren [til beregning af ΔΔC

t = (C

t,

mål

-C

t,

28S

) – (C

t,

mål CG

-C

t,

28S CG

)] [22]. For CG, ΔΔC

t er lig med nul, og 2

0 er lig med én, så folden ændring i genekspression i forhold til CG lig én. Evaluering af 2

-ΔΔCt angiver gange ændring i genekspression i forhold til CG.

Mean Cp af HDAC, SIRTs og Nurr77 gener og 28S transkripter af væv prøver fra kontrolgruppen. qPCR blev kørt in triplo på to uafhængige cDNA præparationer fra pancreas væv, som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Den gennemsnitlige Cp værdier Ct (gennemsnit af Cp) blev bestemt for de følgende prøver: NP-1 til 4, normale pancreas; BD-1 og 2, normale bugspytkirtel prøver fra patienter, der bærer galdegangen tumorer. AP-1 til 3: normal tilstødende væv prøver ampulloma; G-A: normal tilstødende væv prøver efter gastrisk resektion for gastrisk adenocarcinom; Gastrinoma: normal tilstødende væv prøver til gastrinoma af tolvfingertarmen

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Graph Pad 5-softwaren.. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelsen eller median med interkvartile område. Forskellene mellem to grupper blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney U test eller studerende test t. Envejs variansanalyse eller Kruskal-Wallis-test blev udført for at sammenligne mere end to grupper.

For at sammenligne for kategoriske variabler, chi-square test eller Fisher eksakt blev brugt. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere samlet og tilbagefald overlevelse. For alle tests blev en p-værdi på mindre end 0,05 anses for væsentlig.

Resultater

Angivelse af HDAC, SIRT og Nurr77 i kontrol pancreas væv

Panel af 11 normal bugspytkirtel kirurgiske prøver blev undersøgt. Disse væv prøver blev evalueret for HDAC, SIRTs og Nur77 mRNA status ved kvantitativ realtids-PCR. Som vist i figur 1 og tabel S3), når man overvejer overgangsstedet (

Cp

), der definerer det punkt, hvor fluorescensen stiger mærkbart over ryggen jorden fluorescens, de observerede for hvert gen værdier var ikke statistisk signifikant forskellig (de p-værdier varierede fra 0,13 til 1), hvilket antyder, at de målgener blev udtrykt på samme niveau i de kirurgiske prøver undersøgt. Dette tillod os at definere de 11 kirurgiske prøver som en kontrolgruppe (CG), derfor ved hjælp af de middelværdier for deres

CPS

som kalibratoren.

Sammenligning af Q RT-PCR-analyse af HDAC , SIRTs og Nur77 expressionbetween kræft i bugspytkirtlen, kronisk pankreatitis, godartet tumor og kontrolgruppe

i [12] vores tidligere rapport har vi vist, at HDAC7 væsentligt udtrykt i PA væv prøver. I betragtning af, at kun 11 PA vævsprøver og en normal pancreas biopsi blev anvendt, vi udførte qPCR-analyse af

HDAC

,

SIRTs

Nur77

udtryk i alt 46 væv prøver omfattende 29 PA. Desuden blev 11 normale pancreas væv biopsier som kalibratoren at definere mere præcist de observerbare mRNA genekspression niveauer blandt de væv fra PA, CP og B. Mean

Cp

værdier (Ct) af

HDAC7

,

Nurr77

,

SIRT1

,

SIRT2

, var signifikant lavere i PA-gruppen i forhold til CG (

s

= 0,0010; 0,040; 0,0420, 0,0366, henholdsvis) (figur 2). Dette resultat viste, at

HDAC7

,

Nurr77

,

SIRT1

,

SIRT2

var betydeligt over-udtrykt i PA prøver end i CG dem.

prøver blev kørt tredobbelt på to uafhængige cDNA præparationer fra pancreas væv, som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. (Cp) overgangssted værdier. Sammenligninger blev foretaget af Wilcoxon test og forskelle blev betragtet som signifikante ved p. 0,05

Vi derefter anvendt 2

-ΔΔCt metode til at analysere den relative genekspression i vævsprøver fra PA, B og PC [22]. Som vist i figur 3A, udtryk for

HDAC1,2,3,4,7 og Nur77

steg i PA prøver på niveauer signifikant højere end dem, der observeres i tilfælde af CP gruppe (

p

= 0,0160, 0,0114, 0,0227, 0,0440, 0,0136, 0,0004, henholdsvis). Desuden udtryk for HDAC7, var signifikant højere i PA forhold til B vævsprøver (

s

= 0,05).

(B) SIRT gener udtryk i pancreas tumorvæv. Vævsprøver fra pancreasadenocarcinom (PA), Benin Tumor (B) og kronisk pancreatitis (CP). Rød linje:. Medianen af ​​relative RNA transkriptniveauer

Q RT-PCR-analyse viste ekspressionen af ​​forskellige SIRTs mRNA’er i væv fra PA, CP, og B (figur 3B). Selv om nogle væsentlig variation i niveauet

SIRT

s gentranskription kunne dokumenteres, havde dataene ikke mulighed for at identificere en

SIRT

genekspressionsniveauer variation mellem PA, CP og B-prøver.

vi yderligere i forhold niveauerne af genekspression i nogle prøver, hvor vi var i stand til at indsamle biopsier på tumoren periferien. Som vist i figur 4A viste PA prøver statistisk højere betyde mRNA transskription niveauer for

HDAC7

HDAC2

i forhold til deres modpart biopsier taget på tumor periferien (

s

= 0,0346, 0,0053, henholdsvis). Selvom en vis grad af variation i

SIRTs

genekspressionsniveauer kunne dokumenteres mellem vævsprøver, ikke sådan bemærkelsesværdig forskel som dem observeret for

HDAC7

HDAC2

kunne ses. Disse data understøtter opfattelsen af, at blandt de

HDAC’er

SIRTs

gen undersøgt,

HDAC7

HDAC2

er to gener med det største potentiale til at være markører for PA.

pancreasadenocarcinom tumorer (PA), fjerntliggende biopsier væv (RB).

Mønstre og ekspressionsniveauer af HDAC7 og Nur77

Når du bruger HDAC7 mAb, farvningen var negative eller svagt positive i kontroldyr tilfælde (NP), hvorimod stærk positiv immunreaktivitet blev fundet i alle PA (figur 5A). For at analysere mere præcist niveauet af immunofarvning i væv prøver blev seks farvede områder for hvert immunofluorescens billede kvantificeret ved måling af MSF intensiteten af ​​farvede områder. Alle PA udstillet statistisk højere MSF værdier end kontrol prøver. Gennemsnittet af MSF intensitet fundet med mAb til HDAC7 blev øget betydeligt i PA (middelværdi = 173,78 ± 4.46) sammenlignet med kontrolprøver (middelværdi = 54,31 ± 13,26) (figur 5B) (

P

= 0,0004) . Analyse af seks farvede områder for hvert immunofluorescens billede ved at måle MSF intensitet viste, at gennemsnittet af de MSF værdier fundet med mAb til Nur77 blev øget betydeligt i PA (middelværdi = 146,50 ± 8,07) sammenlignet med kontrolprøver (middelværdi = 110,00 ± 4,41 ) (figur 6) (

P

= 0,0225).

En lille farvning findes i NP. I PA, er en stærk farvning fundet i cytoplasmaet og i forbindelse med cellens plasmamembran. Original forstørrelse 250X. Kvantitativ bestemmelse af gennemsnitlig specifik fluorescens (MSF) (B). Seks områder i hvert tilfælde blev målt. Medianerne af Læger uden Grænsers intensiteter opnået med PA og NP væv er repræsenteret ved de vandrette linjer og interkvartile interval er repræsenteret ved kasserne. (*

P

0,0004)

En moderat farvning findes i cytoplasmaet i NP.. PA-celler er stærkt farvet i cytoplasmaet og en moderat farvning blev observeret på cellen plasmamembraner. Original forstørrelse 250X. Kvantitativ bestemmelse af gennemsnitlig specifik fluorescens (MSF) (B). Seks områder i hvert tilfælde blev målt. Medianerne af Læger uden Grænsers intensiteter opnået med PA og NP væv er repræsenteret ved de vandrette linjer og interkvartile interval er repræsenteret ved kasserne. (*

P

0,0225).

Virkningen af ​​

HDAC7, HDAC2 og Nurr77

udtryk i resultatet af patient med pancreas adenocarcinom

Vi derefter undersøgt den mulige sammenhæng af gen transskription niveauer (

HDAC7

,

HDAC2

Nurr77

) og resultatet af sygdommen. Som vist i figur 7, 8, 9 og 10, ingen statistisk signifikant forskel kunne ses mellem grupperne med hensyn til samlet og sygdomsfri overlevelse, når man overvejer individer, som udtrykker mere af mindre end 4 gange baseline gen transkriptionsniveauet. Men når vi analyserede antallet af død og gentagelser i slutningen af ​​opfølgning, antal dødsfald og tilbagefald var signifikant større i patient med overekspression

HDAC7 Hotel (4 gange baseline gen transskription niveau) (figur 8) .

Samlet (fuldt optrukket linie) og sygdomsfri overlevelse (stiplet linie)

N:.. basislinjen transskription niveau i CG

N :. basislinie transskription niveau i CG

N:. basislinjen transskription niveau i CG

Udvikling af stabile humane pancreas cellelinjer under-udtrykke eller overekspression HDAC7

for at vurdere mulig inddragelse af HDAC7 i celledeling kapacitet, genereret vi rekombinante humane Panc-1 tumor celle kloner bruger et sæt af fire kommercielt tilgængelige shRNA konstruktioner og en tilsvarende kontrol plasmid. Desuden blev pCDNA3-HDAC7-Flag plasmid anvendes til at opnå overekspression af HDAC7 proteinet. Transfektioner blev også udført ved anvendelse af en pCDNA3 tom vektor som kontrol. Transkription af HDAC kodende gen blev analyseret ved Q RT-PCR.