PLoS ONE: Manglende decorin Expression fra Human Blære Cancer Cells Tilbyder ny Værktøjer i terapi for urothelial Malignancies

​​

Abstrakt

decorin, en multifunktionel lille leucin-rige ekstracellulær matrix proteoglycan, har vist sig at besidde potent antitumor aktivitet. Men der er en vis usikkerhed, om forskellige cancerceller udtrykker decorin foruden ikke-maligne stromaceller. I denne undersøgelse afklaret vi decorin udtryk ved humane blære cancerceller både

in vivo

in vitro

. Hertil kommer, at effekten af ​​adenovirus-medieret decorin ekspression på humane blære cancerceller

in vitro

blev undersøgt. Vi først demonstreret ved hjælp af den offentligt tilgængelige GeneSapiens databank, der decorin genekspression er til stede i både normale og maligne humane blære væv. Men når vi anvendte in situ hybridisering med digoxigenin-mærkede RNA-prober for decorin på humane blærecarcinom vævsprøver stammer fra et stort radikal cystektomi patient kohorte (n = 199), vi utvetydigt vist, at invasive og ikke-invasive blærecarcinomceller helt mangler decorin mRNA. De kræftceller var også negative for decorin immunoreaktivitet. I stedet blev decorin udtryk lokaliseret udelukkende originale ikke-maligne stromale områder af blære væv. I overensstemmelse med de ovennævnte resultater, humane blære cancerceller

in vitro

var også negative for decorin ekspression som vist ved RT-qPCR analyser. Manglen på decorin ekspression ved blære cancerceller blev vist ikke at skyldes methyleringen af ​​den proximale promotorregion af decorin genet. Når blære cancerceller blev transficeret med en decorin adenoviral vektor, blev deres proliferation signifikant nedsat. Afslutningsvis har vi vist, at humane blære cancerceller er totalt blottet for decorin udtryk. Vi har også vist, at adenovirus-medieret decorin gentransduktion af humane blære cancercellelinier markant inhiberer deres proliferation. Således decorin genlevering giver nye potentielle terapeutiske værktøjer i urothelial maligniteter

Henvisning:. Sainio A, Nyman M, Lund R, Vuorikoski S, Boström P, Laato M, et al. (2013) Manglende decorin Expression fra Human Blære Cancer Cells Tilbyder ny Værktøjer i terapi af urothelial Maligniteter. PLoS ONE 8 (10): e76190. doi: 10,1371 /journal.pone.0076190

Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, Canada

Modtaget: Juni 13, 2013; Accepteret: August 23, 2013; Udgivet: 11 oktober, 2013 |

Copyright: © 2013 Sainio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansielt dette undersøgelsen blev støttet af Medical Research Fund (EVO) i Turku Universitetshospital, Cancer Foundations of South-Western Finland, Foundation of Ida Montin, Oskar Öflunds Stiftelse, Den finske Kulturfond /Varsinais-Suomi Regionalfonden, Biocenter Finland, Finlands Akademi, og University of Turku. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i dag forstår vi, at ekstracellulær matrix (ECM) makromolekyler ikke kun danner en inaktiv rum påfyldning mikromiljø omkring cellerne, men fungerer som en dynamisk struktur genererer signaler til at styre celle adfærd [1]. Faktisk ECM og dets komponenter, herunder en lille leucin-rige proteoglycan decorin [2], [3], er nu kendt for at spille en central rolle i en række fysiologiske og patologiske processer via deres evne til at regulere vigtige cellulære begivenheder såsom adhæsion, migration, spredning og apoptose [4].

Små leucin-rige proteoglycaner (SLRP) danner et gen familie på fem underklasser, der består af 18 medlemmer, herunder decorin, prototypen medlem af familien, og dens nære slægtning, biglycan [5] – [6]. Med hensyn decorin, flere splejsningsvarianter (A1, A2, B-E) er blevet identificeret på mRNA niveau [7]. Decorin består normalt af en kerne glycoprotein med en molekylvægt på ca. 42 kDa og en enkelt chondroitin /dermatansulfat sidekæde. I sin kerne glycoprotein der er 10 leucinrige gentagelser (LRR), hvor hver gentagelse bestående af 24 aminosyrer og omfattende en α-helix og en β-drejning [2], [8]. Decorińs strukturelle træk, at den kan interagere med en række andre ECM-proteiner, cytokiner, vækstfaktorer og deres receptorer, såsom epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), MET (mesenchymal-epithelial overgang) receptor, dvs. receptoren for hepatocytvækstfaktor, insulin-lignende vækstfaktor-receptor i (IGF-IR) og medlemmer af ErbB receptorfamilien [8] – [10]. Via disse interaktioner decorin har alsidige handlinger i både sundhed og sygdom

rolle decorin i kræft progression og dets terapeutiske potentiale som en tumor undertrykke antimetastatiske agent har været i fokus for mange undersøgelser [10] – [11]. . I første omgang decorin blev forbundet med kræft, da det blev opdaget, at decorin /p53 dobbelt knockout mus udviklede tumorer hurtigere end kontroller [10]. Resultaterne viste, at afbrydelse af decorin genet ikke fører til spontan udvikling af tumorer, men manglende decorin er permissiv for tumorigenese [10]. I efterfølgende studier har vist ekspression af decorin reduceres i flere kræftformer, såsom colon [12], prostata [13], og ovariecancere [14]. Endvidere i brystcancer lav ekspression af decorin er blevet vist, at være forbundet med en kortere tid til progression og ringere overlevelse [15]. På den anden side har levering af decorin gen eller protein vist sig at føre til væksthæmning af forskellige cancere [16] – [18] gennem forskellige virkningsmekanismer såsom via binding til vækstfaktorreceptorer nævnt ovenfor, og modulere deres aktivitet [11 ]. Vi har for nylig vist, at forskellige typer af humane brystcancerceller helt mangler decorin mRNA [19]. Vi har også vist, at vedhæftningen, proliferation og apoptose af MCF-7 humane brystcancerceller kan påvirkes af decorin transduktion [19].

I blærekræft, som er 9

th mest almindelige cancer diagnose verdensplan [20], ekspressionen af ​​decorin er tidligere blevet vist at være nedsat [21] – [24]. Som decorin fungerer som en naturlig antagonist for IGF-IR i tumorer, kan dens reduceret ekspression bidrage til øget IGF-IR-aktivitet, hvilket fører til udviklingen af ​​IGF-IR-afhængige kræftformer gennem øget cellulær motilitet og invasion [23] – [24 ]. Det er også muligt, at antitumor virkning decorin på blærekræft er medieret via decorin-associeret tumorsuppressorgen mitostatin, hvis aktivitet er reduceret ved fremskreden blærekræft lindre vækst og spredning af neoplastiske celler [25].

Selvom flere undersøgelser har undersøgt decorin udtryk i forskellige kræftformer, herunder blærekræft, er der en vis usikkerhed om, hvorvidt forskellige kræftceller udtrykke det eller ej. I denne undersøgelse undersøgte vi udtryk for decorin af humane blære cancerceller både

in vivo

in vitro

. Vi undersøgte også effekten af ​​decorin gen transduktion om spredning af humane blære cancerceller

in vitro

.

Materialer og metoder

GeneSapiens database

Vi brugte GeneSapiens database til at evaluere de tidligere offentliggjorte resultater mht decorin ekspression i normale og maligne humane væv [26]. Denne database (https://www.genesapiens.org/) dækker de relative genekspression mønstre for 17 330 gener på tværs af alle de 9783 kommenterede normale og patologiske menneskelige vævsprøver fra offentligt tilgængelige Affymetrix microarray eksperimenter. I GeneSapiens database er der oplysninger om 35 forskellige epiteliale carcinomer

in vivo

. Til denne undersøgelse anvendte vi decorin ekspression af 174 prøver, der repræsenterer humane blærecancer og sammenlignet med data fra 20 normale humane blære vævsprøver.

Tumorprøver

Etisk godkendelse til anvendelse af den kliniske materiale af denne undersøgelse blev givet af den etiske komité i Hospital District of Southwest Finland. Den Etiske Komité frafaldes behovet for skriftligt informeret samtykke. Blærekræft vævsprøver blev afledt fra 199 radikale cystektomi patienter opereret i 1985-2005 i Turku Universitetshospital, Turku, Finland. De patologiske kendetegn patienterne er vist i tabel 1. Væv microarrays (TMA) blev konstrueret ved at opnå 3 repræsentative kerner fra donor radikale cystektomi blokke. Vi brugte 5 um på hinanden følgende sektioner fra TMA blokke til hæmatoxylin og eosin (HE) farvning, in situ hybridisering (ISH) og immunhistokemi (IHC). Brugen af ​​prøverne havde godkendelse af den lokale etiske komité.

decorin in situ hybridisering

Vi udførte decorin ISH på alle TMA sektioner ved sondering prøverne med menneskelig decorin antisense og sense enkeltstrenget RNA riboprober som tidligere beskrevet detaljeret [27].

Immunhistokemi

IHC analyser blev udført for decorin med et kanin polyklonalt antistof (H-80, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, fortynding 1:400) og for biglycan med et gede-polyklonalt antistof (L-15, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, fortynding 1:200) på alle TMA sektioner som beskrevet tidligere [27]. Immunfarvning for Ki-67 blev udført som beskrevet nedenfor i afsnittet for adenovirus-medieret decorin transduktion.

RT-qPCR for decorin

Tre human urin blærekræft cellelinjer RT-4, 5637, og T24 blev anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC). Disse cellelinier blev anvendt til RT-qPCR analyse for decorin. Alle cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Gibco, Paisley, Skotland) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Biochrom AG, Berlin, Tyskland), penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA), og dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2. Cellerne blev trypsiniseret, puljet, og RNA blev ekstraheret under anvendelse NucleoSpin RNA II -kit (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland) ifølge producentens instruktioner.

RNA-koncentrationer fra cancercellelinie ekstraktioner blev bestemt under anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) og integriteten af ​​RNA’et blev bekræftet med agarosegelelektroforese. Et ug RNA blev DNase behandlet med RQ1 RNase-fri DNase (Promega, Madison, WI, USA) og revers transkriberet til cDNA med M-MLV revers transkriptase og oligo (dT) 15 primer (Promega, Madison, WI, USA) i overensstemmelse producentens instruktioner. RT-qPCR blev udført som tidligere beskrevet [19].

status DNA-methylering af decorin promotor

Totalt DNA blev ekstraheret fra urinblære cancercellelinier (RT-4, 5637 og T24) ved anvendelse af QIAamp® genomisk DNA kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland) ved at følge producentens protokol. Methyleret DNA blev beriget med to forskellige analyser, først med den automatiserede MethylCap og derefter med den automatiserede MeDIP analysen ved hjælp af epigenetisk prøveforberedelse robot SX-8G IP-Star® (Diagenode). Kort beskrevet blev det genomiske DNA først fragmenteret med Covaris S2 sonikator. De methylerede DNA-fragmenter blev beriget med Methyl proteindomæne (MBD) affinitet baseret MethylCap assay eller 5-methylcytosin antistofbaseret MeDIP immunfældning assay som beskrevet af fabrikanten (Diagenode). For at undersøge status for methylering af decorin genpromotoren blev de methylerede DNA-fragmenter oprenset (MinElute PCR oprensningskit, Qiagen) og underkastet kvantitativ PCR (SybrGreenER qPCR Supermix Universal, Invitrogen) ved anvendelse 7900HT Hurtig RT-PCR-system (Applied Biosystems ). Hver prøve blev kørt i fire gentagelser og tre promotorregioner dækker forskellige decorin isoformer (A1, A2, B-E) blev undersøgt. De qPCR oligoer anvendt i RT-PCR-analyse var: DCN_A1_F 5’CAG GTG TGG AAA GGA GGA GG -3 « DCN_A1_R 5’GTG TCA GCC GGA TTG TGT TC -3 « DCN_A2_F 5’AGT FTT CAC CTG AAC FTT GA -3 « DCN_A2_R 5’GAA AGC AGC ATC TTG FTT GG -3 « DCN_B-E _F 5’CTG CAT CCC ACT CAC CCA AA -3 « DCN_B-E_R 5’TTC CTG ATG ACC GCG ACT TC -3 “. Kontrol loci forbundet med GAPDH og TSH2B genpromotorer (Diagenode) blev anvendt som negative og positive kontroller til DNA-methylering, hhv. Opsvinget% af methylerede DNA blev beregnet med formlen: recovery% input = 2? ((Ct input-log input fortynding) – CtMeDIP) * 100

Adenovirus-medieret decorin transduktion

For transduktionseksperimenter, et rekombinant replikationsdefekt adenovirusvektor DCN-pxc1c-1 var. anvendes som tidligere beskrevet [19]. Denne vektor huser det humane decorin (DCN) cDNA under kontrol af cytomegalovirus (CMV) promotor. Til fremstilling af vektoren blev human decorin cDNA i fuld længde [28] i pGEM plasmider klones og indsættes i shuttle-plasmid pxcJL-1. Viraene blev fremstillet ved cotransfektion HEK293-celler med rygraden plasmid pBHG10. Som en kontrol vektor RAdlacZ, som huser E. coli β-galactosidasegenet (lacZ) under kontrollen af ​​CMV IE-promotoren blev anvendt. Denne vektor blev købt fra Virus Vector Facility, Center for Biotechnology, University of Turku, Turku, Finland. Menneskelig blære cancer cellelinjer RT4 og T24 blev anvendt til transduktion ifølge en protokol som beskrevet tidligere [19] med mindre modifikationer. Kort fortalt blev cancerceller opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 ug /ml) og dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2. Cellerne blev udpladet på en 8-brønds kammer slide (Thermo Scientific, Rochester, NY, USA), 30 000 celler pr. Den næste dag blev cellerne transduceret med 10, 100 og 1000 pfu /celle af DCN-pxc1c-1 eller RAdlacZ i DMEM indeholdende 10% FBS. 24 timer efter transduktion blev mediet fjernet og erstattet med frisk én. Cellerne blev derefter dyrket indtil næste dag, hvorefter de blev fikseret med 4% paraformaldehyd i phosphatpufret saltopløsning (PBS). Endelig blev spredning indeks decorin transducerede cellelinjer bestemt med en Ki-67 kanin monoklonalt antistof (30-9, Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson, Arizona, udvanding 1:200) [19]. Ki-67 positive celler blev talt i ti forskellige synsfelter (forstørrelse 10 ×) i decorin og lacZ transficerede cellekulturer samt ubehandlede kontrolkulturer. Derudover blev antallet af Ki-67 positive celler /100 celler pr felt på ti forskellige områder talt at udelukke, at den ændrede celle nummer i forskellige kulturer ville have forårsaget en forvridning i spredning resultater. Virkningen af ​​decorin transduktion på celletallet blev også målt under anvendelse af et hæmocytometer. Kort beskrevet blev cellerne udpladet på en plade med 12 brønde (Thermo Scientific, Rochester, NY, USA), 170 000 celler pr. Transfektion blev udført som beskrevet ovenfor, og celler blev talt 24 timer efter udskiftning af mediet med frisk. Cell nummer i hver behandling (Ad-DCN, Ad-LacZ kontrol og negativ kontrol) blev talt som tre gentagelser.

Statistisk analyse

Uparret studerendes

t

test var ansat i statistiske analyser.

s

værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Relativ decorin genekspression i menneskelig blærekræft baseret på GeneSapiens i silico transcriptomics data

GeneSapiens databasen afslørede, at decorin udtrykkes ved markante niveauer i næsten alle forskellige typer af epitelcarcinom humane vævsprøver

in vivo

(data ikke vist) [26]. Dette var også tilfældet for human blærecancer, men i malignt blærevæv decorin ekspression blev faldet i forhold til normal blære væv (figur 1).

Box-plot-analyse af relativ decorin genekspression i vævsprøver for normale og maligne humane urinblære hjælp GeneSapiens

i silico

database (https://www.genesapiens.org/). De kontinuerlige linjer i boksen plot billederne repræsenterer medianen udtryk niveau decorin i blære væv. Bemærk, at den relative decorin ekspression er markeret i både normale og maligne blære vævsprøver og at den relative ekspression af decorin er nedsat hos blærekræft sammenlignet med normal blære væv. Udjævnede barer i kassen skamplet billederne indikerer standardafvigelser af resultatet indgår i databanken.

Lokalisering af decorin mRNA og immunoreaktivitet i maligne menneskelig blære vævsprøver

ISH analyser med DIG -mærkede RNA-prober for decorin viste klart, at invasive blærecarcinomceller var fuldstændig blottet for decorin mRNA i alle blærekræft vævsprøver (figur 2). Samme resultat var også tilfældet for de prøver, der repræsenterer ikke-invasiv in situ menneske blærekræft (figur 3). I invasive og in situ blære karcinom, blev alle detekteret decorin mRNA fundet udelukkende være lokaliseret til originale, ikke-maligne stromale områder (figur 2 og 3). Den IHC analyser af prøverne bekræftet, at decorin immunoreaktivitet boet i de samme områder med decorin mRNA (figur 2 og 3). I modsætning hertil IHC analyser af prøverne for en anden lille leucin-rige proteoglycan, nemlig biglycan, afslørede, at decorin negative områder i invasiv blærekræft væv var positive for biglycan immunreaktivitet (figur 4). Dette fund var tilfældet for in situ blærekræft vævsprøver samt (data ikke vist). Salg

Analyser blev udført på hele undersøgelsespopulationen og repræsentative billeder skal vises. Stjerner angiver områder udelukkende befolket af blæren kræftceller. Paneler A, D, G er repræsentative billeder af serielle sektioner af samme vævsprøven repræsenterer invasiv human blærekræft. A. HE-farvning. D. ISH for decorin. Positiv DIG reaktion i ISH angiver lokaliseringen decorin mRNA kan ses i lilla. G. IHC for decorin. Brun farve indikerer decorin positive maligne stromale celle områder. Dele normal (B, E, H) og maligne (C, F, I) blære vævsområder (asterisker) er vist forstørret nedenunder. Bemærk, at invasive humane blærecarcinomaceller er helt blottet for både decorin mRNA og decorin immunoreaktivitet og at decorin ekspression bor alene i de områder af originalen, ikke-malign stromavæv. I figurerne A, D og G, skala bar 50 um, og i B, C, E, F, H, og jeg, skala bar 20 pm.

Analyser blev udført på hele undersøgelsen befolkning og repræsentative billeder skal vises. Stjerner angiver områder udelukkende befolket af blæren kræftceller. Paneler A, D, G er repræsentative billeder af serielle sektioner af samme vævsprøven repræsenterer in situ human blærecancer. Pile peger på grænserne for in situ carcinom og stjerner angiver områder befolket af kun celler blærekræft. A. HE-farvning. D. ISH for decorin. Positiv DIG reaktion i ISH angiver lokaliseringen decorin mRNA kan ses i lilla. G. IHC for decorin. Brun farve indikerer decorin positive maligne stromale celle områder. Dele normal (B, E, H) og maligne (C, F, I) blære vævsområder (asterisker) er vist forstørret nedenunder. Bemærk, at in situ humane blærecarcinomaceller er helt blottet for både decorin mRNA og decorin immunoreaktivitet og at decorin ekspression bor alene i de områder af originalen, ikke-malign stromavæv. I figurerne A, D og G, skala bar 50 um, og i B, C, E, F, H, og jeg, skala bar 20 pm.

Pile angiver eksempler på maligne blære celler . A. repræsentant billede af HE-farvning af invasiv blærekræft væv. IHC for decorin (B) og biglycan (C) på den samme prøve som i A. Scale bar i A-C, 20 pm.

decorin udtryk i humane blærekræft cellelinjer

i vitro

ovenstående

in vivo

resultater viste, at maligne celler i både invasive og ikke-invasive menneskelige blærecancer vævsprøver ikke udtrykker decorin. Derfor, ved anvendelse af RT-qPCR vi næste undersøgt, om cellelinier, der repræsenterer forskellige kvaliteter af human blærecancer express decorin. Resultaterne viste, at ingen af ​​urinblæren cancercellelinjer, herunder RT-4 (oprindeligt grad I urotelial kræft), 5637 (grad II), og T24 (grad III), udtrykt decorin. For at belyse, om manglen på decorin ekspression skyldtes DNA methylering af decorin genpromotoren anvendte vi to forskellige assays, MeDIP og MethylCap, efterfulgt af kvantitativ RT-PCR for at undersøge status for methylering af den forskellige decorin genpromotoren isoformer udvundet fra kræft cellelinjer. Baseret på disse assays var vi ikke i stand til at påvise DNA-methylering i decorin genpromotoren i nogen af ​​de undersøgte blærekræft cellelinier (figur 5). Styringen promotoren af ​​TSH2B genet var methyleret og GAPDH blev ikke methyleret som forventet.

Manglende decorin ekspression i humane blærecancer cellelinier ikke skyldes DNA-methylering af decorin genpromotoren. Status for methylering af decorin isoformer (DCN A1, A2, B-E) i blæren cancercellelinier blev undersøgt med to forskellige automatiserede assays, MethylCap og MeDIP. I figuren er kvantitative RT-PCR resultater for MethylCap assay viser% af methylering af DNA berigelse versus Input DNA. Ud over at decorin genpromotorer, er resultaterne vist for positiv kontrol TSH2B og negativ kontrol GAPDH.

Virkning af adenovirus-medieret decorin transduktion på proliferationen af ​​humane blærecancer cellelinier

in vitro

Både ISH resultater og de RT-qPCR assays viste klart, at menneskelig blære cancerceller er ikke i stand til at udtrykke decorin enten

in vivo

eller

in vitro

. Næste vi undersøgte effekten af ​​målrettede decorin transduktion om spredning af humane blære cancerceller

in vitro

. Vi brugte humane blære cancer cellelinjer RT4 og T24 og en decorin adenoviral vektor til dette formål. Cellerne blev transduceret med en titer på 10-1000 pfu /celle af adenoviral vektor og en viral koncentration på 1000 pfu /celle blev valgt til yderligere forsøg. Resultaterne viste, at adenoviral-medieret decorin transduktion faldt proliferationsindekset af cancercellerne med statistisk signifikans (figur 6). Også celletallet efter decorin transduktion blev signifikant reduceret (data ikke vist).

decorin gentransduktion nedsætter proliferation indeks T24 blære cancerceller. A. Blære cancerceller transduceret med decorin adenovirusvektor (Ad-DCN). B. Transduktion af cellerne med LacZ-vektor (Ad-LacZ Control). C. Ikke-transducerede cancerceller (negativ kontrol). Brun farve angiver Ki-67 positive celler (eksempler angivet med pile). Scale bar i A-C, 50 um. Udjævnede barer på toppen af ​​kolonnerne i D indikerer standardafvigelser. *** P 0,001, Students

t

test

Diskussion

Selvom decorińs rolle i at hæmme tumorvækst er anerkendt i dag [18], oprindelsen af. decorin udtryk i kræft er forblevet delvist uløst [12], [13], [23], [29]. Især har der været nogen usikkerhed om, hvorvidt forskellige cancerceller udtrykker decorin foruden ikke-maligne stromaceller. Vi har for nylig vist, at i forskellige former for human brystcancer, er decorin ikke udtrykkes af cancerceller [19]. Vedrørende blærevæv, har ekspressionen af ​​decorin vist sig at være fremtrædende i de subepiteliale lag af den murine urinblæren [30]. Det er også blevet vist med IHC-analyse, at decorin immunoreaktivitet markant reduceres i tumorstroma af både lave og høje klasse blæretumorer [23]. I denne undersøgelse har vi undersøgt decorin udtryk ved humane blære cancerceller både

in vivo

in vitro

. Først evalueres vi de tidligere data vedrørende decorin genekspression i forskellige kræftformer med særlig henvisning til blærekræft udnytte den offentligt tilgængelige GeneSapiens databank [26]. I lighed med tidligere undersøgelser [21] – [22], blev decorin ekspression sig at være nedsat i maligne blære humane vævsprøver sammenlignet med normale blære væv. Dernæst vi lokaliserede decorin mRNA og decorin immunoreaktivitet i vores egen omfattende radikal cystektomi patient kohorte af menneskelige blærekræft vævsprøver bruger ISH med DIG-mærkede decorin prober og et polyklonalt decorin antistof henholdsvis. Som vi har vist i human brystcancer [19], disse analyser viste klart, at også i human blærekræft alle områder og småøer befolket af maligne celler var fuldstændig blottet for decorin mRNA og immunoreaktivitet. I stedet ekspressionen af ​​decorin opholdt udelukkende i de områder af originalen, ikke-malign blære stroma. Således GeneSapiens resultater mht decorin ekspression i humane blærecancer prøver afspejle kvaliteten af ​​det oprindelige væv prøver indeholdt i databasen, dvs. foruden cancerceller prøverne indeholder forskellige mængder af stromavæv.

Vores

in vivo

resultaterne viste, at menneskelig blære cancerceller ikke udtrykker decorin. Det samme resultat blev påvist at være også for menneskelig blære cancer cellelinjer. Fordi methylering af decorin gen tidligere er blevet vist at regulere decorin ekspression i colon cancer [29], besluttede vi at undersøge, om denne epigenetiske mekanisme påvirker decorin ekspression i humane blære cancerceller samt. Men vores resultater ubestrideligt vist, at methylering af decorin genpromotor ikke spiller en rolle i human blærecancer. Således mekanismerne blokerende decorin ekspression ved humane blære cancerceller mangler at blive belyst.

forsøg med decorin transduktion er tidligere blevet gennemført for eksempel med brystcancerceller og resultaterne har vist både reducerede primær tumorvækst og forebyggelse af metastase [17], [31]. Endvidere har systemisk afgivelse af decorin protein core til brystcarcinom xenotransplantater blevet rapporteret at modulere ekspressionen af ​​flere hundrede stromale gener skaber en ugunstig tumormikromiljøet for tumorudvikling og metastase [32]. Desuden har suppression af tumorigenicitet under anvendelse decorin transduktion også blevet demonstreret med colon og pladecarcinom tumorxenoplantater [16]. Vi har for nylig vist, at adenovirus-medieret transduktion af decorin at decorin negative brystcancerceller (MCF-7) nedsat proliferation og øget apoptose af cellerne [19]. I denne undersøgelse blev humane blære cancercellelinier RT4 (gradus I) og T24 (gradus III) transduceret med en decorin adenoviral vektor, som resulterede i en identisk fald i celleproliferation, identisk med MCF-7-celler. Ovennævnte resultater sammen med den observerede mangel på decorin udtryk ved cancerceller giver en spændende mulighed for at undersøge effekten af ​​decorin på blærekræft celle adfærd som et terapeutisk værktøj. Dette kunne udføres

in vivo

f.eks med intravesikal terapi, hvor kræft blære hulrum skylles med decorin adenovirus væske [33] – [34]

Så vidt vi ved, er denne undersøgelse er den første til præcist lokalisere decorin mRNA på. cellulære niveau i human blærekræft

in vivo

. Som vi screenede prøverne for immunreaktivitet for en anden, at meget lignende SLRP decorin, nemlig biglycan, vi fandt, at tumor områder negative for decorin var positive for biglycan immunreaktivitet. Dette viser, at selv om decorin og biglycan repræsenterer meget lignende molekyler, som også deler samme funktioner, herunder deres evne til at binde TGF-β [35] deres ekspression i væv er ikke identisk. Tidligere har differentiel decorin og biglycan ekspressionssystemer mønstre blevet fundet f.eks i udviklingen skelet- og ikke-skelet væv [36], under corneal udvikling [37] og patologiske situationer såsom fibrose af partiel blæreudløbsobstruktion [38]. Desuden biglycan er også gradvist vist sig at fungere som et centralt molekyle i reguleringen af ​​immunsystemet [38]. Baseret på vores resultater, er biglycan udtryk påvist i humane blære cancerceller, som mangler decorin udtryk. Den endelige rolle biglycan udtryk i progression eller begrænsning af tumorudvikling vil kræve yderligere undersøgelser.

Konklusioner

Som konklusion på dette studie har vi vist, at den menneskelige blære cancerceller ikke udtrykker decorin enten

in vivo

eller

in vitro

, og at decorin udtryk i malignt menneskelig blære væv bor alene i de områder af originalen, ikke-maligne stroma. Vi har også vist, at manglen på decorin ekspression ved humane blære cancerceller skyldes ikke methylering af de proximale promotorregioner af decorin genet. Vi har endvidere påvist, at transduktion af dyrkede humane blære cancerceller med en decorin adenovirusvektor forårsager en signifikant inhibering i proliferationen af ​​cellerne

in vitro

. Tilsammen vores resultater viser, at den manglende decorin ekspression ved blære cancerceller tilbyder en mulighed for at bruge decorin baserede terapier i humane urothelial maligniteter.

Tak

Vi takker Bogata Fezazi og finsk Microarray og Sekventering Center på Turku Center for Bioteknologi, Turku, Finland til teknisk support. Eksperten teknisk bistand fra Sinikka Kollanus er taknemmeligt anerkendt. Forfatterne udtrykke deres taknemmelighed også Jaakko Liippo for at hjælpe med at fotografere.