PLoS ONE: Beviser for kompleksitet MicroRNA-medieret regulering i kræft i æggestokkene: En Systems Approach

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) er korte (-22 nukleotider) regulerende RNA, der kan modulere genekspression og er afvigende til udtryk på mange sygdomme, herunder kræft. Tidligere undersøgelser har vist, at miRNA inhiberer oversættelse og lette nedbrydningen af ​​deres målrettede messenger RNA’er (mRNA’er), hvilket gør dem attraktive kandidater til anvendelse i cancerterapi. Men den potentielle kliniske anvendelighed af miRNA i kræftbehandling hviler tungt på vores evne til at forstå og præcist at forudsige konsekvenserne af udsving i niveauet af miRNA inden for rammerne af komplekse tumorceller. For at evaluere den prædiktive magt nuværende modeller, blev niveauer af miRNA og deres målrettede mRNA målt i laser fanget mikro-dissekeret (LCM) ovariecancer epitelceller (CEPI) og sammenlignet med niveauerne stede i æggestokkene overflade epitelceller (OSE). Vi fandt, at den forudsagte omvendt korrelation mellem ændringer i niveauerne af miRNA og niveauer af deres mRNA-mål holdt for kun ~11% af forudsagte mål mRNA. Vi viser, at denne lave omvendt korrelation mellem ændringer i niveauerne af miRNA og deres mål mRNA

in vivo

er ikke blot en artefakt af unøjagtige miRNA target forudsigelser, men den sandsynlige konsekvens af indirekte cellulære processer, der modulerer de regulatoriske effekter af miRNA

in vivo.

Vores resultater understreger kompleksiteten i miRNA-medieret regulering

in vivo

og nødvendigheden af ​​at forstå grundlag af disse kompleksiteter i kræftceller, før det terapeutiske potentiale af miRNA kan realiseres fuldt ud .

Henvisning: Shahab SW, Matyunina LV, Mezencev R, Walker LD, Bowen NJ, Benigno BB, et al. (2011) Bevis for kompleksitet MicroRNA-medieret regulering i kræft i æggestokkene: A Systems Approach. PLoS ONE 6 (7): e22508. doi: 10,1371 /journal.pone.0022508

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Marts 10, 2011; Accepteret: 27. juni, 2011; Udgivet: 21 Jul 2011

Copyright: © 2011 Shahab et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af æggestokkene Cancer Institute, The æggestokkene Cycle Foundation, The Robinson Family Foundation, The Deborah Nash Willingham Endowment Fund, The Waterfall Foundation og OBNET Kvinders Healthcare. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er medlemmer af en rigelig klasse af små (-22 NTS) regulatoriske RNA menes at spille en væsentlig rolle i en række forskellige biologiske processer og sygdomme i både planter og dyr [1]. Af nyere interesse, er den mulige bidrag afvigende udtrykte miRNA til kræft initiering og udvikling [2], [3]. Talrige

in vitro

undersøgelser har vist, at miRNA er i stand til at hæmme oversættelse og /eller lette nedbrydningen [4], [5], [6], [7] af deres målrettede mRNA gør dem attraktive kandidater til potentiel anvendelse i behandlingen af ​​kræft [8], [9]. Men den potentielle kliniske anvendelighed af miRNA i kræftbehandling hviler tungt på vores evne til at forstå og præcist at forudsige konsekvenserne af udsving i niveauet af miRNA inden for rammerne af tumorceller

in vivo

. Den generelle forventning, at ændringer i niveauet af miRNA vil blive omvendt korreleret (IC) med ændringer i niveauerne af deres mRNA mål [10], [11], [12], [13], [14], er endnu ikke endeligt undersøgt i forbindelse med tumorceller

in vivo.

for eksempel tidligere uafhængige estimater af relative miRNA niveauer i ovariecancer vs. kontroller ofte har været inkonsekvent, muligvis på grund af forskelle i prøvetype (

f.eks

., bulk vævsprøver vs mikro-dissekerede celler, etc.), biologisk variation mellem forskellige cancer undertyper og individuelle patientprøver (

f.eks

., [15], [16], [17], [18], [19], [20]) eller på grund af unøjagtigheder i forudsigelsen af ​​mRNA-mål [21], [22].

i et forsøg på at reducere variation, der kan tilsløre biologisk signifikante tendenser, vi har udført microarray (Affymetrix) analyser af miRNA og mRNA fra de samme ovariecancer epitelial (CEPI) celler isoleret fra patientprøver ved hjælp af laser capture mikro-dissektion (LCM). Vi overvågede forskelle i miRNA udtryk mellem CEPI og æggestokkene overflade epitel (OSE) celler (indsamlet fra ovarier fra normale patienter) med ekspressionsniveauer af deres formodede mRNA mål som bestemmes af forskellige forudsigelse algoritmer og eksperimentel validering. Mens ovariecancer kan opstå fra enten fimbrial epitel af æggelederen eller OSE, er det for nylig blevet vist, at begge klasser af celler er en del af en overgangsordning epitel af fælles oprindelse, og dermed enten kan tjene som en forløber for CEPI [23]. Da OSE kan høstes fra overfladen af ​​æggestokkene med minimal kontaminering, blev de udvalgt som passende kontrol i vores undersøgelse

Vi fandt, at kun ~11% af mRNA-mål viser signifikant. (P 0,005) ændringer i niveauer udtryk i CEPI forhold til normal var IC med ændringer i niveauerne af deres regulerende miRNA (p 0,01). Niveauerne af de fleste (~79%) af target mRNA var uændret i CEPI mens resten (ca. 10%) af de mRNA-mål viste ændringer i niveauet positivt korreleret (PC) med deres respektive regulerende miRNA. Vi konkluderer, at den lave forudsigelighed af miRNA regulerende virkninger i CEPI isoleret fra patientprøver kan henføres til kompleksiteten af ​​miRNA-funktion

in vivo

.

Resultater

De fleste miRNA udtrykkes forskelligt i CEPI forhold til OSE er opreguleret

Unsupervised hierarkisk gruppering af udtrykket profiler af miRNA opdaget på miRChip (Asuragen Inc, Austin, TX) blev udført på tre CEPI og tre OSE patientprøver (figur 1; se tabel 1 til klinisk information vedrørende prøver). Den miRChip indeholder i alt 13,349 sonder herunder 467 kommenterede menneskelige miRNA (Sanger miRBase v9.2 [24], [25], [26]), 455 miRNA kommenteret i forskellige andre arter og 12,894 (sonderende) sonder af forudsagt, men som endnu ikke valideret /kommenterede miRNA. Ved hjælp af en tærskel på 2-fold eller større forandring, blev fundet 42 miRNA sonder, der skal differentielt udtrykte (p 0,01) mellem vores cancer og kontrolprøver. Af disse blev 33 opreguleret og 9 nedreguleret i CEPI forhold til OSE, herunder 12 tidligere kommenterede menneskelige miRNA (9 opreguleret og 3 nedreguleret). Et zonekort af de 42 differentielt udtrykte miRNA sonder er præsenteret i figur 2a (miRNA sekvenser af disse 42 sonder, log

2 forskellen mellem CEPI og OSE, og p-værdier fra t-test er givet i tabel S1). Til selvstændigt at teste gyldigheden af ​​den differentierede miRNA ekspressionsmønstre bestemt af microarray, vi gennemførte målinger af miRNA niveauer ved hjælp af kvantitativ (real-time) polymerasekædereaktion (qPCR). Fem (

miR-141, miR-429, miR-205, miR-383 og miR-320

) af de 12 tidligere kommenterede menneskelige miRNA vist sig at være forskelligt udtrykt af microarray blev udvalgt til qPCR-analyse i tre kræft og tre kontrolprøver. De qPCR resultater bekræftede de opdagede i microarray studiet (figur 2b) forskelle.

En ukontrollerede hierarkisk gruppering af CEPI og OSE prøver blev udført ved hjælp af alle fundne probesets på Ambion miRChip array, uanset differentieret udtryk. Probesets med standardafvigelse 0,5 på tværs af alle prøver blev fjernet før klyngedannelse. Den clustering viser, at CEPI og OSE prøver klynge i separate grupper, hvilket tyder på variansen mellem grupperne er større end inden for grupperne.

(A) Hierarkisk klyngedannelse af normale og cancer patientprøver baseret på differentielt udtrykte miRNA mellem CEPI celler og OSE celler (p 0,01, ≥2fold ændre). Den dendogram til venstre viser, at proberne klynge i to grupper svarende til de opreguleret og nedreguleret miRNA differentielt udtrykte mellem normal og cancer. Id’er for udvalgte sonder er givet til højre (herunder den kommenterede menneskelige miRNA, se tabel S1 for en komplet liste). Nøgle: HSA-miR-x: kommenterede menneskelige miRNA; HSA-ASG /cand-x: forudsagt kandidat menneskelige miRNA; ppy-:

Pongo pygmaeus

miRNA; overbe-:

C. elegans

miRNA. (B) Bekræftelse af ekspressionsmønstre for udvalgte miRNA ved qPCR. Den relative ekspression af hvert miRNA i logaritmiske enheder i celler fra 3 cancerpatienter er vist sammenlignet med celler fra 3 normale ovarier efter normalisering til RNU6B (ΔΔCt metode). Disse blev fundet at være statistisk signifikant ved relative ekspression software værktøj (REST®) ved en randomiseringsmetode. Randomisering blev udført 5000 gange. I overensstemmelse med microarray resultater, miR-141, miR-205 og miR-429 blev bekræftet at være væsentligt opreguleret i cancer, mens miR-320 og miR-383 viste sig at være betydeligt nedreguleret. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien.

I modsætning til nogle tidligere undersøgelser [15], [16], [18], [19], [20], vores resultater indikerer at størstedelen af ​​miRNA viser signifikante forskelle i udtryk mellem CEPI og OSE er opreguleret i kræft i æggestokkene. Grundlaget for denne uoverensstemmelse er ukendt, men kan skyldes forskelle i prøvetype (f.eks bulk-vævsprøver vs mikro-dissekerede celler, etc.) og /eller biologisk variation mellem de enkelte patientprøver. Vores konklusion, at størstedelen af ​​miRNA er opreguleret i kræft i æggestokkene er i overensstemmelse med det faktum, at miRNA mål betydeligt beriget (hypergeometriske fordeling, p 0,05) blandt mRNA nedreguleret i vores kræft prøver, mens op-regulerede gener har relativt få miRNA mål (Figur S1; varme kort, der viser hierarkisk klyngedannelse af prøverne ved hjælp af alle probesets er præsenteret i figur S2 og kun bruger differentielt udtrykte mRNA i figur S3, en liste over alle differentielt udtrykte mRNA er vist i tabel S2). En mulig biologisk forklaring på, hvorfor miRNA er opreguleret i CEPI kan ligge i, at der i modsætning til andre kræftformer [27], [28], overgangen fra OSE til CEPI postuleres at inddrage ændringer fra en mindre differentieret til en mere differentieret tilstand [29], [30], [31].

Blandt de 12 tidligere kommenterede miRNA viser en betydelig ændring i niveauer i CEPI prøverne, miR-205, miR-141, og miR-429 er alle signifikant opreguleret i overensstemmelse med tidligere undersøgelser forbinder disse miRNA med vedligeholdelse af celler i den differentierede epitelial tilstand [32]. Af de miRNA, der er nedreguleret i CEPI forhold til OSE, miR-320 og miR-383 ligger i områder, der er forbundet med hyppige DNA kopi nummer tab i ovariecancer [19]. MIR-320 tidligere er blevet identificeret som en inhibitor af lungecarcinom proliferation [33]. Dens nedregulering i CEPI tyder på, at det kan fungere som en tumor suppressor i ovariecancer samt.

Kun ~11% af de forudsagte mRNA mål for miRNA udtrykkes forskelligt mellem CEPI og OSE vise den forventede omvendte mønster ændring i genekspression

Tidligere undersøgelser har fastslået at humane miRNA undertrykke genekspression ved parring med komplementære sekvenser lokaliseret inden for 3 ‘utranslaterede regioner (3’ UTR) af målrettede mRNA’er resulterer i translationel undertrykkelse og mRNA-nedbrydning [6 ], [7]. Baseret på disse resultater, indregnes ændringer i ekspressionsniveauerne af miRNA generelt forventes at være omvendt korreleret med ændringer i ekspressionsniveauerne af deres målrettede mRNA [10], [11], [12], [13], [14]. For at teste denne hypotese i forbindelse med celler isoleret fra patientprøver, vi sammenlignet ændringer i niveauerne af de tidligere kommenterede menneskelige miRNA med niveauer af deres forudsagte mål mRNA i vores CEPI prøver i forhold til de OSE kontrol. De formodede mRNA mål for disse tidligere kommenterede menneskelige miRNA blev oprindeligt identificeret ved hjælp Miranda algoritmen [34], [35], [36]. Resultaterne viser, at kun ~11% af ændringerne i mRNA-ekspression mellem CEPI og OSE omvendt korreleret (IC) med de observerede ændringer i miRNA niveauer (tabel 2 S3). Tidligere undersøgelser af målinger af miRNA og deres målrettede mRNA’er i en række cellelinier rapporterede lignende resultater [13], [37], [38]. Udtrykket for flertallet (Ingen ændring, NC: ~79%) af de forudsagte mRNA-mål var ikke signifikant forskellig (p 0,005 og /eller fold forandring 2) mellem CEPI og OSE prøver, mens ~ 10% af målrettede mRNA viste ændringer positivt korreleret (PC) med deres -sagerne regulerings- miRNA.

for at afgøre, om den uventet lave procentdel af IC ændringer kan være en beregningsmæssige artefakt af vores brug af Miranda algoritme til at forudsige målrettede mRNA vi gentog analysen uafhængigt ved hjælp af PicTar (www.pictar.org) og Targetscan (www.targetscan.org) miRNA target forudsigelse algoritmer. I begge tilfælde var resultaterne i overensstemmelse med vores oprindelige fund, at kun et mindretal af de ændringer i mRNA-ekspression mellem CEPI og OSE er omvendt korreleret (IC) med de observerede ændringer i miRNA niveauer (PicTar: IC 9,4%, PC 10,1%, NC 80.5%; Targetscan: IC 10,4%, PC 10,3%, NC 79,3%, se tabel 3, S4 S5). For at øge stringens af target forudsigelser, analyseres igen vi dataene kun bruger miRNA mål, var almindeligt forudsagt af alle tre algoritmer (vejkryds). Vi fandt, at ved at overlappe de tre uafhængige prædiktionsalgoritmen, hver miRNA havde færre forudsagte mål, men ved hjælp af disse almindeligt forudsagte mål, fandtes kun ca. 7% af mRNA ændringer mellem CEPI og OSE at blive omvendt korreleret (IC) med de observerede ændringer i miRNA niveauer (tabel 4). Vi analyserede også vores data ved hjælp skæringspunkter forudsigelser fra to algoritmer ad gangen (Miranda + Targetscan, MIRANDA + PicTar, og PicTar + Targetscan), og igen fandt vi, at ændringer i niveauerne af kun 6-9% af de forudsagte mRNA-mål var omvendt korreleret med ændringer i miRNA niveauer (tabel S6, S7 og S8).

Eksperimentel validering betragtes i øjeblikket som den mest stringente metode til at validere miRNA mål [39], [40]. Således yderligere at teste muligheden for, at lave omvendt korrelation mellem ændringer i miRNA niveauer og mål mRNA observeret i vævsprøverne var blot en afspejling af den begrænsede nøjagtighed target forudsigelse algoritmer, vi gennemført en række transfektionsforsøg ved hjælp af to miRNA, der var markant opreguleret i CEPI (miR-7 og miR-128) til at identificere eksperimentelt validerede mål for disse miRNA i CEPI.

En række uafhængige transfektionsforsøg blev udført med miR-7, miR-128 og en matchede sæt negative kontrol miRNA i en veletableret æggestokkræft cellelinje (HEY) [41]. For at bestemme effektiviteten af ​​vores transfektioner (positive kontroller), vi overvågede ekspressionsniveauerne af to tidligere bekræftede mRNA mål for miR-7 (epidermal vækstfaktor receptor, EGFR [42] og miR-128 (B lymfom Mo-MLV indsættelse region 1 homolog .., BMI1 [43]) regulering resultaterne bekræfter effektiviteten af ​​begge transfektioner (Figur S4) RNA blev opsamlet fra celler efter transfektion og de relative niveauer af mRNA tilstedeværende blev bestemt af Affymetrix microarray-analyser (HG-U133 Plus 2.0; Borde S9 og S10).

i overensstemmelse med resultaterne fra CEPI vævsprøver, fandtes kun et mindretal af forudsagte mRNA mål, der skal reduceres væsentligt (IC) efter miR-7 eller miR-128 transfektion (tabel 5). Den forudsagde mRNA-mål, der var betydeligt nedreguleret i disse transfektionsforsøg blev taget som “eksperimentelt valideret” mRNA mål for miR-7 og miR-128 henholdsvis. Brug kun disse mål, vi analyseres igen de microarray data fra vævsprøver og fandt, at kun ~8% (interval 0-18%) af de “eksperimentelt validerede” mRNA-mål vises ændringer i ekspression IC med ændringer i mIR-7 og mIR-128-ekspression i CEPI (tabel 6). Kollektivt vores resultater viser, at den lave omvendt korrelation mellem ændringer i niveauerne i miRNA og deres mål mRNA

in vivo

er ikke blot en artefakt af unøjagtige mål forudsigelser, men snarere en afspejling af kompleksiteten af ​​miRNA funktion i kræftceller.

diskussion

Det er velkendt, at gener og deres mRNA produkter er genstand for en bred vifte af myndighedskontrol. Den relative bidrag af fejl i disse kontrolforanstaltninger til debut og progression af sygdomme, såsom cancer, kan varieres og komplekse [44]. miRNA og andre små ikke-kodende RNA’er nylig har vist sig at være vigtige regulatorer af genekspression, og afbrydelse af miRNA ekspression er blevet impliceret i mange sygdomme, herunder cancer [3], [45], [46], [47], [ ,,,0],48]. Mens det er velkendt, at miRNA kan tjene som nyttige biomarkører for diagnosticering og stadieinddeling af en række forskellige humane cancere (f.eks [2], [49], [50]), den måde og i hvilken udstrækning miRNA bidrager til de processer underliggende cancer er kun lige begyndt at blive forstået [2], [45]. For eksempel blev den regulerende funktion miRNA oprindeligt menes at operere udelukkende på translationel niveau [51], [52], men nyere fund har vist, at disse små regulerende RNA også spille en rolle i modulering af mRNA stabilitet, og at disse to former for kontrol kan være indbyrdes forbundne [7], [53]. Vi har stadig ikke udelukke kan forekomme, at reguleringen af ​​visse målgener på translationel niveau uden væsentlige ændringer i mRNA-niveau, og derfor kan have været ignoreret i vores analyser.

Omfattende

in vitro

og

in vivo

studier tidligere har vist, at menneskelige miRNA kan undertrykke genekspression ved parring med sekvenser beliggende inden for 3 ‘utranslaterede regioner af målrettede messenger RNA’er (mRNA’er) resulterer i translationel undertrykkelse og efterfølgende mRNA nedbrydning [1 ], [6], [7]. Hidtil er der kun få eksempler på miRNA øger transkription eller translation af målgener [54], [55], hvilket resulterer i positive korrelationer mellem miRNA og målrette mRNA’er. , En generelt holdt forventning er derfor, at ændringer i ekspressionsniveauerne af mRNA vil blive omvendt korreleret med ændringer i niveauerne af deres målretning miRNA [56]. Den omstændighed, at de enkelte miRNA kan målrette mod flere mRNA og at individuelle mRNA kan målrettes af flere miRNA skaber potentialet for et komplekst netværk af interaktioner i kræftceller fyldt med en række positive og negative feedback-sløjfer [57], [58] . Desuden det faktum, at miRNA er velkendte målrette mRNA’er koder forskellige cellulære transkriptionsfaktorer og andre regulatoriske proteiner øger sandsynligheden for, at de direkte regulatoriske virkninger af miRNA kan moduleres ved indirekte eller “ned-stream” -effekter i forbindelse med cancerceller. Dette er ikke at sige, at de mekanismer, demonstrerede at ligge til grund miRNA forordning

in vitro

er ude af drift

in vivo

, men snarere, at de funktionelle konsekvenser af disse mekanismer kan maskeres og /eller afpasses efter den lovgivningsmæssige kompleksiteter, der karakteriserer kræftceller. I hvilket omfang disse kompleksiteter kan afbøde vores evne til præcist at forudsige den molekylære følge af ændringer i niveauet af miRNA i forbindelse med kræftceller har relevans for den potentielle anvendelse af miRNA i kræftbehandling.

Formålet med vores undersøgelse var at evaluere, i hvilket omfang de molekylære konsekvenser af ændringer i miRNA niveauer i kræftceller isoleret fra patientens væv kan forudsiges fra de nuværende modeller af miRNA-funktion. Det faktum, at tidligere bestræbelser på at opnå udtryk profiler af miRNA og deres mRNA-mål typisk blev udført på prøver fra forskellige patienter og /eller fra blandede (bulk) væv har bidraget til uoverensstemmende resultater (f.eks [15], [16], [17], [18], [19], [20]). I et forsøg på at reducere eksperimentel variation, vi analyseret ændringer i niveauet for miRNA og deres målrettede mRNA’er i ovariecancerceller isoleret fra de samme patienter ved LCM. Vores resultater viser, at kun ~11% af ændringerne i niveauerne af mRNA’er er IC med ændringer i niveauet for deres regulerer miRNA i samme ovariecancer (CEPI) celler. For at eliminere muligheden for, at vores resultater er blot en artefakt af forkert identificerede mRNA mål for miRNA regulering, vi gentog vores analyser ved hjælp af mål forudsagt af en række forudsigelse algoritmer, samt, mål eksperimentelt valideret i en række transfektionseksperimenter udføres i et veldokumenteret æggestokkræft cellelinje (HEY). Vores resultater konsekvent støtter den konklusion, at den forventede IC mellem ændringer i miRNA niveauer og niveauer af deres mål mRNA sker relativt sjældent i kræft i æggestokkene celler isoleret fra patientprøver, og at denne lave omvendt korrelation er ikke blot en artefakt af urigtige miRNA target forudsigelser. Snarere, vores resultater viser, at den lave omvendt korrelation mellem ændringer i miRNA niveauer og niveauer af deres mål mRNA er den sandsynlige konsekvens af indirekte cellulære processer, der modulerer eller maskerer de regulatoriske effekter af miRNA

in vivo

. Vores resultater understreger kompleksiteten i miRNA-medieret regulering

in vivo

og behovet for en bedre forståelse af grundlaget for disse kompleksiteter i kræftceller, før det terapeutiske potentiale af miRNA kan realiseres fuldt ud.

Materialer og metoder

Vævsprøver

æggestokkene tumor prøver blev indsamlet på Northside Hospital (Atlanta, Georgien) under operationen og lynfrosset i flydende nitrogen inden for 1 minut af fjernelse fra patienterne. Alle æggestokkene tumorprøver anvendt i denne undersøgelse var fra patienter diagnosticeret med serøs papillære epitelial ovariecancer. Tandbørstningerne for normale ovariale overflade epitelceller (OSE) blev bevaret straks i RNAlater (Ambion, Austin, TX). blev opnået Patient samtykke og godkendelse fra Institutional Review Boards of Georgia Institute of Technology og Northside Hospital. Den skriftlige samtykke og vores protokol (# H09227) blev godkendt af IRB. Detaljeret kliniske oplysninger for hver patient anvendt i denne undersøgelse er tilvejebragt i tabel 1.

Laser capture micro-dissektion (LCM)

frisk frosset væv fra tumorer blev skåret i syv-mikron sektioner, anvendes til ikke-opkrævet dias, så fikseret i 75% ethanol i 30 sekunder, farves og dehydreret ved hjælp af HistoGene LCM Frozen Section Farvning Kit (Arcturus, Mountain View, CA). LCM blev udført med en AutoPix Automated Laser Capture microdissection System ved hjælp af CapSure Macro Caps (Arcturus). Ca. 10.000 celler blev fanget på hvert af 5-6 hætter per prøve. miRNA blev ekstraheret fra indfangede celler under anvendelse af Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion). mRNA blev isoleret fra celler fra de samme patienter ved hjælp af PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus).

RNA ekstraktion fra æggestokkene overflade epitelceller

For miRNA qPCR og microarray, normale æggestokkene overflade epitelceller var spundet ned og resuspenderes i lysis buffer fra Mirvana miRNA Isolation Kit (for små RNA berigelse), efter producentens anbefalede protokol (Ambion). cDNA for qPCR blev syntetiseret fra RNA (10 ng) under anvendelse af TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

I mRNA qPCR og microarray total RNA-ekstraktion fra OSE blev udført under anvendelse af PicoPure RNA isolation Kit, ifølge producentens anbefalede protokol (Arcturus). På grund af begrænset antal celler indsamlet fra overfladen epitel børstninger blev OSE RNA udvundet fra 5 patienter med non-maligne æggestokke til mRNA microarray og fra to

forskellige

sæt af tre patienter med ikke-maligne æggestokke for miRNA (én sat for miRNA microarray, en anden for qPCR) (Se tabel 1 for flere detaljer om patientinformation).

Kvantitative (real-time) PCR

Total RNA (10 ng) udvundet af LCM fanget i æggestokkene tumorceller og normale OSE-celler blev omdannet til amplificeret cDNA for qPCR. TaqMan miRNA Analyser (Applied Biosystems) blev udført efter producentens protokol for HSA-miR-141, HSA-miR-429, HSA-miR-205, HSA-miR-320, HSA-miR-383 og for RNU6B endogene kontrol ved hjælp af StepOnePlus real-Time PCR maskine (Applied Biosystems). Primer-specificiteter for disse miRNA er tidligere blevet påvist [58] – [63] og RNU6B er en tidligere fastsatte kontrol for humant ovarievæv (https://www.ambion.com/techlib/tn/151/3.html; https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_044972.pdf). Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af relative Expression Software Tool (REST [59])

For mRNA qPCR, blev total RNA (1-5 ug) ekstraheret fra celler omdannes til cDNA ved hjælp af Hævet III First Strand syntese. systemet (Invitrogen). cDNA blev derefter oprenset ved anvendelse af QIAGEN PCR-oprensningskittet (Qiagen) efter producentens instruktioner. qPCR forsøg blev udført for EGFR, BMI1 og GAPDH gener ved anvendelse iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). de sekvens specifikke primere anvendes til SYBR grønne analyser er som følger: EGFR-forward: GGAGAACTGCCAGAAACTGACC, EGFR-omvendt: GCCTGCAGCACACTGGTTG, GAPDH-forward: GGTCTCCTCTGACTTCAACA, GAPDH-omvendt: AGCCAAATTCGTTGTCATAC, BMI1 frem: ACTTCATTGATGCCACAACC, BMI1-omvendt:. CAGAAGGATGAGCTGCATAA Den EGFR-primere var som designet af [60] og GAPDH-primere var som designet af [61]. BMI1 primere blev opnået fra qPCR primer database RTPrimerDB [62]. GAPDH primer effektivitet blev beregnet til at være ~ 1. specificiteten af ​​den anden primere kan fås fra den relevante publikationer /database. Alle qPCR reaktioner (for mRNA og miRNA) blev optimeret med ikke-skabelon kontroller og Rt (minus revers transkriptase) styrer før eksperimentere. GAPDH blev valgt som endogen kontrol, som det vises minimal ændring mellem celler transficeret med MIR-NC og miR-7/128 I microarray.

Alle qPCR reaktioner blev udført med mindst 2 biologiske replikater og for hver biologisk replikat mindst 3 tekniske replikater.

Cell kultur og celletransfektioner

HEY celler blev leveret af Gordon B. Mills, Institut for Systembiologi, University of Texas, MD Anderson Cancer center. Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA) suppleret med 10% v /v varmeinaktiveret føtalt kalveserum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamin (Mediatech), 10 mM HEPES-buffer (Mediatech ), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Ca. 12 timer før transfektion disse celler (dubletter eller triplikater pr transfektion, 1,5 × 10

5 per brønd) blev podet på seks-brønds plader i vækstmedium og fik lov til at adhærere natten over ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Den følgende dag efter vask af brøndene med PBS og udskiftning af vækstmediet med Opti-MEM (Invitrogen), blev celler transficeret med miRNA [HSA-MIR-7 miRIDIAN efterligne, miRIDIAN miRNA efterligner negativ kontrol # 1 (MIR-NC, en

C. elegans

miRNA, cel-miR-67, med bekræftet minimal sekvens identitet hos mennesker), eller HSA-miR-128 miRIDIAN mimic (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO)] ved hjælp af Lipofectamine 2000 transfektion agent ( Invitrogen) ifølge producentens anvisninger ved en slutkoncentration på 25 nM. Cellerne blev inkuberet i fire timer i denne reducerede serum miljø at optimere transfektion, vasket med PBS og derefter inkuberet ved 37 ° C og 5% CO

2 i 44 timer (i alt 48 h) efter tilsætning af frisk vækstmedium til brøndene . Transfektionseffektiviteten blev estimeret ud fra den relative knock-down af tidligere validerede targets (EGFR for miR-7 og BMI-1 for miR-128 [42], [43]), baseret på anbefalinger fra siRNA /miRNA reagens producent (Thermo Fisher Videnskabelig). Cellekultur blev udført ved hjælp af mindst to-tre uafhængige biologiske gentagelser.

Microarray

Tissue mRNA microarray.

Biotinmærket cRNA blev syntetiseret, hybridiseret til Affymetrix HG- U133 Plus 2.0 oligonucleotid arrays og analyseret med et GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA).

HEY celle RNA-isolering og mRNA microarray.

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy Mini RNA isolation kit (QIAGEN, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Integriteten af ​​RNA blev kontrolleret med en Agilent 2100 Bioanalyzer (1,8-2,0; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). mRNA’er blev omdannet til dobbeltstrenget (ds) -cDNA og amplificeret under anvendelse Bifald 3′-Amp System (NuGen, San Carlos, CA). Dette cDNA blev derefter biotin-mærket og fragmenteres ved hjælp Encode Biotin Module (NuGen). Det mærkede cDNA blev hybridiseret til Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 oligonucleotid arrays og analyseret med en GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

Microarray dataanalyse

Tissue miRNA microarray dataanalyse.

prøver til vores miRNA profilering undersøgelse blev behandlet af Asuragen Services (Austin, TX), i henhold til virksomhedens standard operationelle procedurer. En specialfremstillet fremstillet Affymetrix GeneChip® fra Ambion designet til miRNA sonder afledt af Sanger miRBase og offentliggjorte rapporter [24], [25], [26], [63], [64], [65]. Baggrundssignal blev estimeret ud fra antigenomiske probesekvenser leveret af Affymetrix og afledt af et større sæt kontroller anvendes på Affymetrix human exon array. Spike-i eksterne referencepunkter kontroller blev baseret på ikke-miRNA kontrol prober, der mangler homologi med det humane genom. Arrays inden for en specifik analyse eksperiment blev normaliseret efter stabilisering varians beskrevet i [66]. En Wilcoxon rank-sum test blev anvendt til bestemmelse afsløring opkald af miRNA probe signal i forhold til fordelingen af ​​signaler fra GC-indhold tilsvarende anti-genomiske prober.

En to-stikprøve-t-test, med antagelse af lige varians, blev anvendt til hypoteseprøvning. Denne test er defineret som prober anses for at være væsentligt differentielt udtrykt baseret på en p-værdi på 0,01 og log

2 forskel ≥1. Signalintensiteter fra disse differentielt udtrykte prober blev z-score normaliseret før hierarkisk klyngedannelse.

Unsupervised hierarkisk klyngedannelse af prøverne blev udført ved anvendelse Spotfire Decisionsite for Microarray Analysis (DSMA) baseret på Z-score transformeret signalværdier af alle probesets undtagen dem med standardafvigelse 0,5.