PLoS ONE: Overekspression af LAPTM4B-35: A Novel markør for dårlig prognose for prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

lysosomet-associeret protein transmembrane 4b-35 (LAPTM4B-35) er en medlem af det mammale 4-tetratransmembrane spænder proteinsuperfamilien, som er overudtrykt i flere faste maligniteter. Imidlertid ekspressionen af ​​LAPTM4B-35 og dets rolle i progressionen af ​​prostatacancer (PCA) er ukendt. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge LAPTM4B-35 ekspression i PCa og dens potentielle betydning for klinisk-patologiske variabler og prognose.

Metoder Salg

Immunhistokemi blev anvendt til bestemmelse af ekspressionen af ​​LAPTM4B-35 protein i 180 PCA væv i sammenligning med 180 normale benign prostatahyperplasi (BPH) prøver. Korrelationen mellem ekspressionen af ​​LAPTM4B-35 proteinet og clinicopathologic karakteristika patienter med PCa blev analyseret.

Resultater Salg

Statistisk analyse viste, at LAPTM4B-35 ekspression blev signifikant forhøjet i forhold til PCa BPH kontroller. Høj LAPTM4B-35 farvning var til stede i 71,11% af alle tilfælde med PSA. Den overekspression af LAPTM4B-35 var signifikant associeret med lymfeknude metastaser, sædblæren invasion, PCa scenen, højere score Gleason, højere præoperativ PSA, og biokemisk recidiv (BCR). Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at høj ekspression af LAPTM4B-35 var relateret til dårlig samlet overlevelse og BCR-overlevelse af patienter med PSA. Multivariat Cox-analyse viste, at LAPTM4B-35 var en uafhængig prognostisk faktor for både samlet overlevelse og BCR overlevelse af patienter med PSA.

Konklusioner

Overekspression af LAPTM4B-35 kan være forbundet med tumor progression og dårlig prognose i PCa og kan således tjene som en ny molekylær markør til at forudsige prognosen for PCA patienter

Henvisning:. Zhang H, Wei Q, Liu R, Qi S, Liang P, Qi C, et al. (2014) Overekspression af LAPTM4B-35: A Novel markør for dårlig prognose for prostatakræft. PLoS ONE 9 (3): e91069. doi: 10,1371 /journal.pone.0091069

Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: August 25, 2013; Accepteret: 7 februar 2014; Udgivet: 20 Mar 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NO: 81.172.451), Tianjin Major Anti-Cancer Project (12ZCDZSY17200), og Science Foundation of Tianjin medicinske universitet. (NO: 2009GSI18). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Som den mest almindelige maligne neoplasma hos mænd, prostatakræft (PCA) er den næsthyppigste årsag til tumor dødsfald i USA [1]. Selvom prognosen for patienter med lokaliseret eller regional sygdom er godt, for patienter i USA, som udvikler metastatisk sygdom, den 5-års overlevelse er kun 29% [2]. Men de molekylære mekanismer, der ligger carcinogenese og progression af PCa er endnu ikke fuldt ekspliciteret. Derfor bestræbelser på at identificere flere molekylære markører, der kan anvendes til at detektere PCa samt individualisere både patient prognose og terapi er af stor klinisk betydning.

Konventionelle prognostiske faktorer såsom Gleason score, præoperative PSA niveauer eller forholdet mellem involverede biopsier kun utilstrækkeligt forudsige patient resultat for tiden tilgængelige behandlinger. De er endnu mere begrænset i at identificere ubetydelig prostatacancer, dvs. kræft, der kan være ubehandlet, uden at forkorte patientens forventede levetid, men skåne ham morbiditet uberettiget behandling. Derfor er en yderligere indsats at finde nye diagnostiske veje og behandlingsmuligheder er et presserende forlangte at optimere patientbehandling [3] – [6]. Identifikationen af ​​nye prostatakræft biomarkører skal være af første kliniske prioritet, når man tager i betragtning problematisk heterogenitet af prostata tumorer og de løsninger, skræddersyet medicin kan give. Disse biomarkører bør være i stand til at forøge differentialdiagnose og indikerer forløbet af PCa sygdom så tidligt og så nøjagtige som muligt, således i sidste ende at begrænse mængden af ​​ikke-væsentlige medicinske procedurer [7] – [10]. Tissue biomarkører kan berige betydeligt denne fremgangsmåde ved at give meningsfulde oplysninger om forvaltning af PCa via udnyttelsen af ​​prøver fra biopsier eller prostatektomi [8], [11].

For nylig LAPTM4B (lysosomale protein transmem-bran 4A) , som oprindeligt blev identificeret som en ny gen opreguleret i human hepatocellulært carcinom [12], [13], blev med succes klonet ved fluorescens differential display, hurtig amplifikation af cDNA-ender, og revers transkriptase-polymerasekædereaktion. Det er blevet påvist, at LAPTM4B gen er kortlagt til kromosom 8q22.1 med et mRNA, der består af 7 exons og koder for et 35 kDa protein, LAPTM4B-35, som er en type-III-transmembranprotein med fire formodede transmembrane regioner. Undersøgelser har vist, at aktiviteten af ​​LAPTM4B-35 er forhøjet i flere humane kræftformer. Endvidere er overekspression af LAPTM4B-35 er forbundet med en dårlig prognose og bidrager til cellulær transformation, tumorgenese, og metastatisk progression i disse cancere [14] – [18]. Men den clinicopathologic betydning og biologiske rolle LAPTM4B-35 i PCa fortsat uklare.

Til dato har der ikke været nogen offentliggjorte rapporter, hvori rolle LAPTM4B-35-ekspression i PSA. Således er formålet med denne undersøgelse var at undersøge ekspressionen af ​​LAPTM4B-35 i PCa og analysere dens forhold til forskellige clinicopathologic karakteristika, herunder PCa patient resultat.

Materialer og metoder

Patient og vævsprøver

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienterne. Godkendelse fra Medical Ethics Committee for Tianjin Medical University blev opnået med henblik på forskning (TMUhMEC2012015). Efter Institutional Review Board godkendelse, arkiverede formalin-fikseret, blev paraffinindlejrede prøver fra 180 patienter med PCa og 180 patienter med benign prostatahyperplasi (BPH), som blev kirurgisk behandlet i anden hospital i Tianjin Medical University, Tianjin, Kina mellem januar 1999, og december 2010 [19] – [21]. Alle vævsprøver og dias blev undersøgt af erfarne patologer. Ingen af ​​patienterne modtog kemoterapi, immunterapi, eller strålebehandling før operationen. De klinisk-patologiske træk af patienter, herunder præoperativ PSA, Gleason score, PCa scenen, lymfeknude status, angiolymphatic invasion status, status kirurgisk margen, sædblæren invasion status, og BCR er opsummeret i tabel 1.

immunhistokemisk farvning

Fire-mikrometer sektioner på formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver blev opnået, efterfulgt af hæmatoxylin og eosin-farvning til PCA patologi bekræftelse. Vi tog afsnittene umiddelbart nær hematoxylin og eosin-farvede dele til immunohistokemi og afparaffineres de valgte væv i xylen og rehydreret med graduerede alkohol fusioner efter standardprocedurer. Efterfølgende blev afparaffinerede sektioner nedsænket i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0) og opvarmet i femten minutter i en mikrobølgeovn. Efter sekventiel inkubering med 3% hydrogenperoxid og 10% normalt gedeserum i ti minutter individuelt, endogen peroxidaseaktivitet og uspecifik immunoglobulin binding blev konsekutivt blokeret i nævnte rækkefølge. Derefter blev avidin-biotin immunoperoxidaseteknik vedtaget at udføre immunhistokemisk farvning. Snit blev inkuberet i en time med primær kanin-anti-humant polyklonalt antistof LAPTM4B-35-antistof (fortynding 1:100) (LAPTM4BN199-Pab; Abcam Co) ved stuetemperatur, skyllet og inkuberet i 30 minutter med biotinyleret sekundært antistof. Når alle dele blev vasket grundigt med vand, blev de inkuberet med et biotin-mærket sekundært antistof efterfulgt af peberrodsperoxidasekonjugeret streptavidin i tredive minutter hver. Inkubation med 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid i 0,01% H2O2 i 10 minutter leveret farveudvikling. Derefter blev objektglassene modfarvet med Meyer hematoxylin i tredive til tres sekunder, og blev monteret i vandigt monteringsmedium. Endelig immunohistokemi blev udført med en immunhistokemisk kit, ifølge producentens instruktioner. Negative kontrolglas blev farvet med kaninserum.

Farvning Evaluering

LAPTM4B-35 protein ekspressionsniveauer blev klassificeret semikvantitativt baseret på den totale kombinerede snesevis af procentdelen af ​​positive-farvende tumorceller og farvningsintensitet [21]. Procentdelen af ​​positive celler, målt som omfanget af immunfarvning, blev scoret som følger: 0, mindre end 5% farvning; 1, 5% til 50%; og 3, 50% farvning. Den farvningsintensitet blev scoret som følger: 0, ingen farvning eller kun svag farvning; 1, moderat farvning; og 2, stærk farvning. Den score farvningsintensitet plus procentdelen af ​​positive farvning blev anvendt til at definere ekspressionsniveauerne: 0 til 2, lav ekspression og på 3 til 4, høj ekspression [21]. Proceduren for scoring blev udført i to eksemplarer af 2 uafhængige patologer, der har erfaring i at evaluere immunhistokemi og havde ikke kendskab til clinicopathologic oplysninger eller de tilsvarende hematoxylin og eosin dias. Overensstemmelsen rate mellem de to primære patologer var større end 96%. I tilfælde af betydelig uenighed, dias pågældende blev re-revideret samtidigt af de to oprindelige patologer, sammen med en tredje patolog ved en multiheaded mikroskop, for at løse meningsforskelle.

Statistisk analyse

chi-square test blev anvendt til at analysere forskellene i kategoriske variable. Samlet overlevelse og BCR-overlevelse blev beregnet efter den Kaplan-Meier-metoden og evalueret ved log-rank test. Cox regression (proportional hazard model) blev udført for multivariat analyse af prognostiske indikatorer. P 0,05 blev betragtet som signifikant. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 17.0 software.

Resultater

LAPTM4B-35 protein er overudtrykt i PCA væv

LAPTM4B-35-ekspression overudtrykt i PCA tilfælde sammenlignet med BPH , og forskellen var statistisk signifikant (P 0,001) (tabel 1). Som vist i figurer S1, S2, S3, S4, den LAPTM4B-35 ekspression blev lokaliseret i cytoplasmaet i prostataceller. Af de 180 prøver med PCa undersøgt, LAPTM4B-35-ekspression var lav i 52 (28,89%) af 180 patienter med PCa og høj i 128 (71.11%) af 180 patienter. LAPTM4B-35-ekspression var signifikant højere i scenen og sædblæren invasion tilfælde højere partnerskabs- og samarbejdsaftale; LAPTM4B-35-ekspression var også signifikant forøget i PCA patienter med lymfeknude metastaser, højere præoperativ PSA, højere Gleason score, og BCR. Endvidere blev der ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem LAPTM4B-35 immunoreaktivitet og alder, angiolymphatic invasion, og status kirurgisk margen. Sammenhængen mellem LAPTM4B-35 ekspression og clinicopathologic faktorer er vist i tabel 2.

Virkningen af ​​LAPTM4B-35-ekspression på BCR overlevelse i PCa

For at undersøge, om LAPTM4B- 35 ekspressionsniveau er en væsentlig prædiktor for BCR-fri tid efter radikal prostatektomi, blev Kaplan-Meier-kurver afbildes mellem høj eller lav LAPTM4B-35 og BCR-tiden. Den lave LAPTM4B-35-ekspression havde signifikant længere BCR-fri tid efter radikal prostatektomi sammenlignet med patienter med høj LAPTM4B-35-ekspression (P 0,001; Figur S5). I univariat analyse, høj ekspression af LAPTM4B-35, højere score Gleason, og sædblæren invasion var relateret til en dårlig BCR overlevelse for patienter med PSA. Multivariate analyse viste, at høj LAPTM4B-35-ekspression, Gleason score, og sædblæren invasion var de uafhængige prognostiske faktorer for BCR-overlevelse. Resultaterne er til stede i tabel 3.

Virkningen af ​​LAPTM4B-35 udtryk på den samlede overlevelse i PCa

For at undersøge virkningen af ​​LAPTM4B-35 overekspression på den samlede overlevelse, vi uropført univariate analyse af traditionelle clinicopathologic variabler for prognose. Væsentlige variabler i samlet overlevelse analyse omfattede LAPTM4B-35 udtryk, PCa scenen, Gleason score, sædblæren invasion, og præoperativ PSA. Multivariat Cox regressionsanalyse tilmelding ovennævnte væsentlige parametre viste, at LAPTM4B-35 udtryk, PCa scenen, Gleason score, og præoperativ PSA var uafhængige prognostiske faktorer for samlet overlevelse af patienter med PSA. Resultaterne er vist i tabel 4.

Diskussion

I denne undersøgelse analyserede vi LAPTM4B-35-ekspression ved immunhistokemi i PCa hjælp 180 kirurgiske prøver. Vi har analyseret sammenhængen mellem LAPTM4B-35 udtryk og traditionelle clinicopathogical karakteristika i PSA. De nuværende data viste, at LAPTM4B-35 overekspression blev forbundet med dårlig overlevelse ved at analysere den samlede overlevelse og BCR-overlevelse. Høj LAPTM4B-35-ekspression var signifikant korreleret med højere PCa scene, sædblæren invasion, lymfeknude metastaser, højere præoperativ PSA, højere score Gleason, og BCR, men ikke med alderen, status kirurgisk margen, og angiolymphatic invasion. Desuden vores data viste også, at patienter med højt LAPTM4B-35-ekspression havde signifikant dårlig samlet overlevelse og BCR-overlevelse ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og log-rank test. Multivariat analyse viste, at LAPTM4B-35-ekspression var en uafhængig prognostisk faktor for både samlet overlevelse og BCR-overlevelse hos patienter med PSA. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse i detaljer for at demonstrere en sammenslutning af clinicopathologic parametre og prognostisk betydning af LAPTM4B-35 overekspression i PSA. Disse resultater viser, at høje LAPTM4B-35 ekspression spiller en kritisk rolle i progressionen af ​​PCa og er signifikant associeret med en dårlig prognose uafhængigt af andre faktorer. Dette rejser den mulighed, at LAPTM4B-35 kan være en prognostisk parameter til PCA, der er så eller mere pålidelige end de clinicopathologic faktorer øjeblikket er i brug, og antyder muligheden for at bruge LAPTM4B-35 i individualiseringen af ​​både patient prognose og terapi. Vores resultater er i overensstemmelse med de tidligere rapporter roller LAPTM4B-35 i tumorprogression, herunder galdeblære carcinoma, ovariecarcinom, hepatocellulært carcinom, brystcancer, og ekstrahepatisk cholangiocarcinom, og støtte en sammenhæng mellem høj ekspression af LAPTM4B-35 protein og ugunstige biologisk adfærd i PSA.

Men om LAPTM4B-35 er effektiv til klinisk anvendelse som erstatning for eller som supplement til de prognostiske parametre er i brug er stadig uklart, og yderligere undersøgelser er påkrævet for at identificere, om kombineret påvisning af LAPTM4B-35 sammen med nogle af disse andre molekyler vil være værdifulde i at forbedre prognostisk effektivitet. Det nære forhold mellem LAPTM4B-35 overekspression og klinisk-patologiske træk forudsagde, at LAPTM4B-35 kan spille en vigtig rolle i carcinogenese og tumor progression. I øjeblikket har der været nogle spor, der er i stand til at bidrage til at forklare dens mekanismer. Ifølge offentliggjorte data fra nogle forfattere, overekspression af LAPTM4B-35 resultater i aktivering af nogle protoonkogener, såsom c-myc, c-jun og c-fos, og malign transformation i nogle cellelinjer [22], [23] . Så LAPTM4B gen kan tjene som en protoonkogenet gennem sin oversættelse produkt, LAPTM4B-35. Disse data giver vigtige beviser til at eksplicitere den mekanisme, hvormed LAPTM4B udtryk bidrager til carcinogenese og tumor progression, selvom rolle LAPTM4B i signaltransduktionsveje i tumorceller er bestemt værd yderligere forskning.

Desuden væsentlig rolle LAPTM4B i kræft antyder muligheden for at gøre det til en potentielt mål for anticancer behandlingsformer. Det er blevet afsløret, at transfektion af LAPTM4B gen fremmes forankringsuafhængig vækst og kolonidannelse af HLE celler, hvorimod anti-sense-oligonukleotider mod LAPTM4B inhiberede proliferation af BEL-7402, et hepatocellulært carcinom cellelinie, hvori fandtes LAPTM4B ekspression. Endvidere er en høj homologi til LAPTM4A indikerede, at LAPTM4B kan have en lignende funktion i multiresistens [24], [25]. Desuden foreslår den vigtige rolle, LAPTM4B i kræft mulighed for at gøre det til en potentielt mål for anticancer behandlingsformer. Nogle tidligere undersøgelser viste, at LAPTM4B kan være et nyt mål for terapi. Alle disse resultater viser muligheden for at gøre LAPTM4B som et potentielt mål for terapi af PSA. Bestemt, er behov for yderligere stærke støtter fra grundlæggende undersøgelser.

Vores undersøgelse har nogle begrænsninger. Prøven størrelse er ikke stor nok. For at løse dette problem, skal der udføres et randomiseret studie, der undersøger sammenhængen mellem LAPTM4B-35 udtryk og prognose at bekræfte, om LAPTM4B-35 kunne bruges som en ny indikator for PCa prognose. Sammenfattende er dette den første undersøgelse for at vise en sammenhæng mellem LAPTM4B-35 overekspression og PCa. Vi viste, at LAPTM4B-35 er overudtrykt i en stor del af patienterne med PCa, og høj LAPTM4B-35-ekspression korreleret med PCa progression og dårlig prognose i PSA. Desuden kan LAPTM4B-35 være et attraktivt mål for PCa terapi. Men disse resultater stadig, at blive bekræftet af fremtidige undersøgelser.

Støtte Information

figur S1.

repræsentant fotografi, der viser høj LAPTM4B-35 ekspression i PCa ved immunhistokemi. Original forstørrelse, × 200

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s001

(TIF)

Figur S2.

Repræsentant fotografi, der viser lav LAPTM4B-35-ekspression i PCa ved immunhistokemi. Original forstørrelse, × 200

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s002

(TIF)

Figur S3.

Repræsentant fotografi, der viser lav LAPTM4B-35-ekspression i BPH ved immunhistokemi. Original forstørrelse, × 200

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s003

(TIF)

Figur S4.

repræsentant fotografi, der viser ingen LAPTM4B-35 ekspression i PCa ved immunhistokemi (negativ kontrol). Original forstørrelse, × 200

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s004

(TIF)

Figur S5.

Foreninger mellem LAPTM4B-35-ekspression og BCR-fri tid efter radikal prostatektomi i PCA patienter. Patienter med høj LAPTM4B-35-ekspression viste signifikant kortere BCR overlevelse end dem med lav LAPTM4B-35-ekspression (P 0,001, log-rank test)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s005

(TIF)