PLoS ONE: Molekylær Dissektion af induceret Platinum Resistance gennem Funktionel og Gene Expression Analysis i en Cell Culture Model af blærekræft

Abstrakt

Vi rapporterer her udvikling, funktionelle og molekylær karakterisering af en isogen, parret blærekræft cellekultur modelsystem til undersøgelse platin resistens. Den 5637 humane blærecancer-cellelinie blev dyrket over ti måneder med trinvise stigninger i koncentration af oxaliplatin til at generere en lægemiddelresistent 5637R sub cellelinie. MTT-assayet blev anvendt til måling af cytotoksiciteten af ​​flere blære cancerlægemidler. Væskescintillationstælling tilladt kvantificering af cellulær optagelse af lægemiddel og efflux af radioaktivt mærket oxaliplatin og carboplatin. Virkningen af ​​intracellulær lægemiddel inaktivering blev bedømt ved kemisk modulering af glutathionniveauer. Oxaliplatin og carboplatin-DNA-adduktdannelse og reparation blev målt ved anvendelse accelerator massespektrometri. Resistensfaktorer herunder apoptose, vækstfaktorsignalering og andre blev vurderet med RNAseq af begge cellelinier og inkluderet bekræftelse af udvalgte transkripter ved RT-PCR. Oxaliplatin, carboplatin, cisplatin og gemcitabin var signifikant mindre cytotoksiske over 5637R-celler sammenlignet med 5637 celler. I modsætning, doxorubicin, methotrexat og vinblastin havde nogen cellelinie afhængig forskel i cytotoksicitet. Ved udsættelse for terapeutisk relevante doser af oxaliplatin, 5637R-celler havde en lavere lægemiddel-DNA addukt niveauer end 5637 celler. Denne forskel blev delvist forklares ved præ-DNA-skader mekanismer såsom optagelse af lægemiddel og intracellulær inaktivering ved glutathion, samt hurtigere oxaliplatin-DNA addukt reparation. I modsætning hertil begge cellelinier havde ingen signifikante forskelle i carboplatin celle optagelse, udstrømning og lægemiddel-DNA adduktdannelse og reparation, hvilket tyder på distinkte resistensmekanismer for disse to nært beslægtede stoffer. De funktionelle undersøgelser blev udvidet med RNAseq analyse, som viste en betydelig ændring i ekspressionen af ​​83 udskrifter, herunder 50 kendte gener og 22 nye udskrifter. De fleste af de udskrifter der ikke tidligere er forbundet med blærekræft kemoresistens. Denne model og den tilhørende fænotypiske og genotypiske data har potentiale til at identificere nogle nye detaljer i resistensmekanismer af klinisk betydning for blærekræft

Henvisning:. Wang S, Zhang H, Scharadin TM, Zimmermann M, Hu B , Pan AW, et al. (2016) Molekylær Dissektion af induceret Platinum Resistance gennem Funktionel og Gene Expression Analysis i en Cell Culture Model of blærekræft. PLoS ONE 11 (1): e0146256. doi: 10,1371 /journal.pone.0146256

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juli 8, 2015; Accepteret: 15. december 2015; Udgivet 22. januar 2016

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Eventuelle RNA seq data ikke præsenteres i papiret er tilgængelige online på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SRA. RNA seq data er blevet tildelt tiltrædelse id-numre SRR1820076 og SRR1820077 for 5637 forældrenes linje; . Og SRR1820079 og SRR1820080 for 5637R linje (som repræsenterer to uafhængige forsøg for hver cellelinje)

Finansiering: AMS prøver blev analyseret på Lawrence Livermore National Laboratory i regi af DOE kontrakt DE-AC52-07NA27344 og støttet af NIH /NCRR ressource for Biomedical Accelerator massespektrometri P41 RR013461 og DOE LDRD giver 08-LW-100 (PTH og KT), og af American Cancer Society Institutional Research Grant (CXP). Denne undersøgelse blev også støttet af VA Karriereudvikling Award-2 (CXP), en NCI Cancer Center Support Grant (RDW) en Cancer Clinical Investigator Team Leadership Award (CXP), og NIH awards HHSN261201200048C, HHSN261201200084C, R01CA155642 (PTH) og T32 CA108459-08 (TS). Forfatterne takker for Susan og Gerry Knapp Family Fund. Dette arbejde blev udført, delvis i regi af det amerikanske Department of Energy ved Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344. Arbejdet rapporterede her repræsenterer ikke de synspunkter eller udtalelser fra Department of Veterans Affairs eller den amerikanske regering

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser : Chong-xian Pan, Paul Henderson og George Cimino er aktionærer i Accelerated Medical Diagnostics Incorporated, hvis mål er at kommercialisere brugen af ​​narkotika-DNA addukter som biomarkører for kemoterapi modstand

Introduktion

. Platin-baserede lægemidler er blandt de hyppigst ordineret anticancer lægemidler, herunder cisplatin, carboplatin og oxaliplatin. Cisplatin er blevet anvendt til at behandle en bred vifte af maligne lidelser, såsom testikelkræft, lunge-, ovarie-, blære-, hoved og hals-carcinomer og andre. For alle platin-baserede midler, iboende eller erhvervet resistens er den vigtigste årsag til behandlingssvigt (Fig 1A).

(A) De store veje for platin (Pt) lægemiddel-induceret celledød. Efter administration, cellulær optagelse og efflux bestemmer den intracellulære akkumulering af Pt midler, som kan inaktiveres ved intracellulære thiolholdige molekyler. Til sidst, Pt agenter inducerer DNA-skader, herunder lægemiddel-DNA-addukter, der udløser cellecyklusstop og DNA-reparation. DNA-adduktdannelse og reparation, afgør, hvordan celler, selv om andre faktorer også spiller en vigtig rolle, såsom pro- og anti-apoptotiske proteiner. (B) Diagram der viser dannelsen af ​​carboplatin- og oxaliplatin-DNA addukter og positioner radiokarbon etiketter på hvert lægemiddel anvendt til denne undersøgelse for at muliggøre kvantificering af lægemiddel-DNA adduktdannelse og reparation af accelerator massespektrometri.

anticancer virkning af platin-baserede lægemidler er bedst kendt for cisplatin, som kommer ind celler ved både passiv diffusion og aktiv transport. For eksempel er en kobber transporter (CTR1) kendt for at bidrage til cisplatin tilstrømning og modulerer lægemiddelfølsomhed in vitro [1, 2]. To kobber-efflux-transportere P-type adenosin triphosphater (ATP7A og ATP7B) også mægle intracellulære cisplatin niveauer [3]. Andre aktive transportører omfatter den humane organiske kation transporter (hOCT) og den humane multilægemiddelresistens og toksin ekstrudering (hMATE), som kun findes i visse typer af humane celler, i overensstemmelse med den observation, at forskellige væv kan variere i deres platin akkumulering [4] .

Når cisplatin er inde i cellen, glutathion (GSH) og andre thioler virker som reduktionsmidler for at standse platin toksicitet. Der er høj korrelation mellem intracellulære GSH niveauer og resistens over for cisplatin

in vitro

[5-7]. Metallothionein proteiner er en familie af sulfhydryl-rige proteiner, der deltager i heavy metal-binding og afgiftning og er steget i nogle cisplatinresistente resistent blæretumorer [8]. Ændringer af GSH-indholdet og gener involveret i GSH-syntese, samt metalloproteiner, er også rapporteret for oxaliplatin resistente cancercellelinier [9, 10].

Cisplatin og dens aquated eller hydroxylerede metabolitter fungerer som bifunktionelle alkyleringsmidler for DNA [11]. De resulterende lægemiddel-DNA-addukter blokere replikation og celledeling, og aktivere apoptose [2]. Andre arter, såsom cisplatin-DNA-protein krydsbindinger, vil sandsynligvis også bidrage til cisplatin toksicitet [12, 13].

Cellular respons på carboplatin (se struktur i figur 1B) menes at være meget lig cisplatin eksponering da begge lægemidler danner identiske tværbinde lægemiddel-DNA-strukturer, bortset fra at carboplatin reagerer med DNA langsommere end cisplatin [14]. Klinisk, cisplatin og carboplatin har lignende, men ikke identiske effekt, sandsynligvis på grund af forskelle i biokemi og dosering regimer.

Oxaliplatin (Fig 1B) virker på samme måde som cisplatin ved at udøve sin toksicitet via lægemiddel-DNA adduktdannelse [15 -17]. Da oxaliplatin-DNA-addukter har forskellige kemiske og biologiske egenskaber fra cisplatin-DNA-addukter, viser den ikke fuld krydsresistens med cisplatin og er mere effektivt i fx inhibering af DNA-syntese [18-20]. Desuden har forskellene mellem cisplatin og oxaliplatin blevet beskrevet til intracellulære kaskader induceret af lægemiddel-DNA-skader i forbindelse med apoptose og cellecyklusstandsning [21].

Næsten alle platinbaserede lægemiddel-DNA-addukter er substrater for nukleotid excision reparation (NER) [2]. Øget DNA reparation satser er blevet dokumenteret at korrelere med resistens over for platin narkotika [5, 22-25]. Platin-DNA-addukter er også substrater for DNA fejlparringsreparationssystemet (MMR). MMR-proteiner har en meget højere affinitet for cisplatin end for oxaliplatin-DNA-addukter [26, 27]. Det er blevet rapporteret, at et defekt MMR aktivitet resulterer i en forøget modstand af cellelinier til cisplatin, men ikke at oxaliplatin [19], hvilket kan forklare den relative effekt af oxaliplatin i kolorektale cancere, der ofte defekt i MMR [28, 29] .

Molekylær pathway analyse har haft stor succes i laboratorieundersøgelser til at belyse platin mekanismer resistens over for lægemidler. Men de resulterende molekylære underskrifter resistens er sjældent anvendes på klinikken. En væsentlig grund til den store kløft mellem laboratoriet forskning og kliniske anvendelse er den meget komplekse karakter af resistensmekanismer mod cytotoksiske lægemidler. På det cellulære niveau, er over 700 gener involveret i cellulær respons på platinbaseret behandling [30].

Denne kompleksitet motiveret os til at generere en næsten isogene blærekræft cellelinje med henblik på at udvide den mekanistiske analyse af platin modstand mod blærekræft, som platinbaseret behandling er første linje i fase II og højere sygdom [31, 32]. Vi præsenterer i dette papir en fænotypisk og genotypisk analyse af en parental blærecancer-cellelinje 5637 og en datter cellelinie, der blev gjort resistente over for platin-baserede lægemidler ved udsættelse for stigende koncentrationer af oxaliplatin over flere måneder. Vi antager, at dette par cellelinier ville udvise forskelle i platin lægemiddelakkumulering, intracellulær inaktivering og lægemiddel-DNA-dannelse og reparation i overensstemmelse med deres følsomhed over for hvert lægemiddel, og at genekspression analyse af disse næsten isogene cellelinjer vil resultere i rimeligt antal testbare hypoteser, der kan være specifikke for blærekræft. Cellelinierne blev testet for følsomhed over for flere kemoterapimidler almindeligvis anvendes til behandling af blærecancer. Cellelinierne blev også vurderet i detaljer med hensyn til mekanistiske forskelle i respons på [

14C] oxaliplatin og [

14C] carboplatin. Den

14C sporstof aktiveret bestemmelse af narkotika optagelse og efflux ved væskescintillationstælling (LSC) og lægemiddel-DNA adduktdannelse og reparation af accelerator massespektrometri (AMS). De cellelinjer blev også analyseret for RNA udskrift udtryk ændringer ved RNAseq, som førte til identifikationen af ​​flere kendte og nogle nye udskrifter med hensyn til platinbaseret lægemiddelresistens. Bidraget fra de gener, repræsenteret ved disse udskrifter til kemoresistens er stort set ukendt. Belysning af disse mekanistiske detaljer i efterfølgende arbejde kan i sidste ende hjælpe med at designe personlige terapi for at overvinde kemoresistens og styre udviklingen af ​​nye terapeutiske midler mod blærekræft.

Materialer og metoder

Narkotika

oxaliplatin (5 mg /ml) blev indkøbt fra Sanofi-Aventis (Bridgewater, NJ, USA) og

14C-mærket oxaliplatin ([

14C] oxaliplatin) (specifik aktivitet på 58 mCi /mmol) og [

14C] carboplatin (54 mCi /mmol) blev indkøbt fra Moravek Biochemicals. Blandinger af kulstof-mærkede og ikke-mærkede oxaliplatin eller carboplatin (USP Pharmaceutical Grade) blev anvendt for at minimere brugen af ​​kulstof, og opnå de forskellige specifikke aktiviteter, der kræves til denne undersøgelse. Lægemiddelopløsninger blev fremstillet umiddelbart før brug. Andre lægemidler blev opnået fra UC Davis Cancer Center Pharmacy (USP Pharmaceutical Grade).

Cellelinjer

Humane blærecancer cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA ) og dyrket med den anbefalede medium medmindre andet er angivet. At udvikle Pt-resistente sub-cellelinier, blev 5637 (HTB-9) celler dyrket omkring IC-koncentrationer

50 af oxaliplatin intermitterende med trinvis stigning i koncentration af oxaliplatin. Oxaliplatin anvendte koncentrationer varierede fra 1,5 pM til 15 uM, som er fysiologisk relevant i betragtning af maksimal plasmakoncentration hos mennesker er ca. 10 pM [33]. Efter 10 måneders dyrkning blev den resistente sub-cellelinje 5637R udviklet. For at bekræfte at 5637R stammer fra den parentale 5637-cellelinjen blev prøver af begge kulturer sendes til ATCC cellelinie Authentication Service til celle kontrol pr ATCC protokollen. Konkret femten kort tandem repeat (STR) loci plus køn bestemme locus, amelogenin, blev forstærket ved hjælp af kommercielt tilgængelige PowerPlex

® 16HS Kit fra Promega. Cellelinjen prøve blev behandlet ved hjælp af ABI Prism

® 3130 xl Genetic Analyzer. Data blev analyseret ved anvendelse GeneMapper ID v 3.2 software (Applied Biosystems). Passende positive og negative kontroller blev brugt i hele testproceduren.

MTT Assay at bestemme IC

50

IC

blev bestemt 50 værdier efter inkubation celler i 72 timer med forskellige koncentrationer af kemoterapeutiske midler, der almindeligvis anvendes til behandling af blærekræft, som tidligere beskrevet [34].

oxaliplatin og carboplatin eksponering og AMS analyse

Celler blev podet i 60 mm skåle ved en densitet på 1 x 10

6 celler /skål og fik lov at vedhæfte natten over i en 37 ° C befugtet atmosfære indeholdende 5% CO

2. Ved time 0 blev cellerne doseret og inkuberet med 10 pM oxaliplatin suppleret med 5.000 dpm /ml [

14C] oxaliplatin eller 100 uM carboplatin, suppleret med 50.000 dpm /ml [

14C] carboplatin. 24-timers inkubation blev anvendt til at efterligne

in vivo

oxaliplatin halveringstid (16,8 timer) hos patienter [35, 36]. Cellerne blev derefter vasket to gange med phosphatbufret opløsning (PBS) og holdt derefter stoffri kulturmedier. DNA blev høstet ved tidspunkter i løbet af 24-48 timer, som angivet, og renses med en Promega Wizard DNA oprensning kit. Ti mikrogram DNA per prøve blev omdannet til grafit og målt ved AMS for

14C kvantificering som tidligere beskrevet [37]. Tredobbelt sæt af AMS blev udført, og data blev plottet som tiden vs oxaliplatin-DNA addukter pr 10

8 nt.

Bestemmelse af intracellulære glutathionniveauer

Intracellulær total glutathion (GSH) niveau blev opdaget med en kolorimetrisk GSH afsløring kit pr fremstilling protokol (BioVision, Mountain View, CA). Ca. 10

7-celler blev vasket med iskold PBS, og lyseret i GSH lysepuffer. Efter inkubation på is i 10 minutter blev sulfosalicylsyre opløsning tilsat, og supernatanten blev opsamlet til måling af absorbans ved 410 nm. GSH standard inkluderet i sættet blev anvendt til at generere en standardkurve til bestemmelse af prøven GSH-koncentrationer.

Statistik

Vi brugte kvantitative resuméer af DNA-skader, IC

50 og AUC ( areal under kurve) værdier, separat af eksperiment, cellelinje og tid (middelværdi og standardafvigelse). Statistik blev beregnet med n = 3 for hver cellelinie. ANOVA-analyse af IC

50 og AUC data var baseret på en ensidig

t

-test. Alle test var på et eksperiment-wise fejlprocent på 0,05 og alle analyser brugte SAS /STAT

® eller MedCalc

® software.

RNAseq og QRT-PCR

Total RNA blev isoleret under anvendelse af Qiagen RNeasy mini kit. Co-oprenset genomisk DNA blev kvantificeret ved anvendelse af et 18S genspecifikke kvantitativ PCR assay med humant genomisk DNA som den mængde standard. Da totalt RNA havde høje niveauer af genomisk DNA-kontaminering (forudsagt at udgøre 15-68% af den samlede læser), et yderligere DNase behandlingstrin blev tilsat til RNA oprensningsprotokollen. Dette trin reduceret DNA-kontaminering til niveauer, der forventes at producere 0,33% af den samlede læser. rRNA blev udtømt fra prøverne ved hjælp Epicentre s RiboZero H /M /R kit. Sekventeringsreaktioner biblioteker blev foretaget fra 40 ng rRNA depleteret RNA ved anvendelse Epicentre s ScriptSeq v2 RNA-Seq Library Preparation Kit. Disse prøver blev sekventeret på 1/3 af en HiSeq PE 101 lane hver på Los Alamos National Laboratory

Rå sekventering data blev behandlet af casava 1,8 software. (Illumina, San Diego, CA) og klippede for kvalitet (Q

30, Phred skala). Analyse af RNA-Seq data blev udført ved hjælp af en standard TopHat-Manchetknapper workflow med menneskelige genom samling (feb 2009 GRCh37 /hg19) [38, 39]. Ekspressionen af ​​et transkript blev betragtet signifikant reguleret hvis FDR (p-værdi korrigeret for multipel testning) var mindre end 0,05.

I QRT-PCR, blev RNA isoleret fra subkonfluente retter ved hjælp af Qiagen RNeasy Mini Kit ifølge producentens anvisninger. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af Thermo Scientific RevertAid RT kit. QRT-PCR blev udført ved hjælp af EconoTaq PLUS 2X mester mix på en BioRad CFX96 Real-Time System instrument. Følgende primere blev anvendt: TSPAN7 (ACCAAACCTGTGATAACCTGTCT, AGGGAGATATAGGTGCCCAGA), AKR1C2 (ATTGGAATGACATACTGCATCCT, GTTCAACCGTTTCTTACCTGTGG), AKR1C1 (CGCCTGCAGAGGTTCCTAAAA, ATCAATATGGCGGAAGCCAG), Cyr61 (CCCGTTTTGGTAGATTCTGG, GCTGGAATGCAACTTCGG), HTRA1 (TCCCAACAGTTTGCGCCATAA, CCGGCACCTCTCGTTTAGAAA), og AQP3 (CCGTGACCTTTGCCATGTG, CGAAGTGCCAGATTGCATCATAA). Eventuelle RNA seq data ikke præsenteret i papiret er tilgængelig online på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra. Rå RNA seq data er blevet tildelt tiltrædelse id-numre SRR1820076 og SRR1820077 for 5637 forældrenes linje; og SRR1820079 og SRR1820080 for 5637R linje (som repræsenterer to uafhængige forsøg for hver cellelinie).

Resultater

generation af 5637R cellelinje via induceret resistens stof er beskrevet nedenfor, sammen med en række fænotypiske og genotypiske karakteriseringer. Medmindre andet er angivet, er sammenligninger mellem de to cellelinjer præsenteres i den rækkefølge, 5637R versus 5637, hhv.

Induktion af Platinum Drug Resistance

5637R cellelinje blev udviklet over 10 måneders kultur med en trinvis stigning i koncentrationen af ​​oxaliplatin i medierne. Cytotoksiciteten af ​​oxaliplatin til 5637R linje faldt med ca. 10 gange sammenlignet med den parentale cellelinje (IC

50 af 26,1 pM versus 2,45 uM, s 0,0001, tabel 1). Uventet, vi var ude af stand til at udvikle en resistent 5637 derivat ved forlænget udsættelse for carboplatin. For at sikre at 5637R stammede fra de parentale 5637-celler, blev en aliquot af hver cellelinie sendt til ATCC til bestemmelse af klonal fidelity. De 15 kort tandem repeat (STR) loci plus amelogenin af 5637 cellelinje anvendt til denne undersøgelse var en eksakt match til ATCC human cellelinie 5637 (HTB-9) i ATCC databasen. Den 5637 linje havde tre alleler, som 5637R manglede mens alle andre alleler undersøgte var de samme for begge cellelinier, tyder på, at 5637R er et derivat af 5637.

Kemoterapi narkotika cytotoksicitet

Celler blev dyrket med en række koncentrationer af cisplatin, carboplatin, gemcitabin, doxorubicin, methotrexat og vinblastin i 72 timer efterfulgt af vurdering af levedygtighed ved MTT-assayet (Middelværdier angivet i tabel 1). Disse lægemidler blev valgt på grund af deres hyppige anvendelse i behandlingen af ​​blærekræft. Den 5637R celle linje var også mere resistente over for cisplatin, men i langt mindre grad end for oxaliplatin (IC

50 2,99 pM versus 0,59 uM for 5637, p = 0,049), og carboplatin (IC

50 = 72,18 iM versus 24.34 pM, p 0,0001). Det var også mere modstandsdygtige over for gemcitabin (IC

50 = 1,44 pM versus 0,12 pM, p = 0,0015), men begge cellelinier var lige følsomme over for doxorubicin (IC

50 = 0,27 versus 0,29 pM, p = 0,45) , methotrexat (IC

50 = 1.24 pM versus 2,01 pM, p = 0,18) og vinblastin (IC

50 = 0,61 nM versus 0,60 nM, p = 0,48).

Optagelse og efflux

for at bestemme narkotika optagelse, cellerne blev inkuberet med [

14C] oxaliplatin eller [

14C] carboplatin, og stikprøven på forskellige tidspunkter i løbet af 24 timer efterfulgt af isolering af celler og LSC analyse af intracellulær akkumulering . Den 5637R linje havde en beskeden, men signifikant lavere peak intracellulær oxaliplatin niveau ved 24 timer (248,6 ± 24,7 x 10

6 molekyler per celle versus 303,7 ± 14,2 x 10

6 molekyler per celle for 5637 celler, p = 0,290 ) (fig 2A). I modsætning hertil begge cellelinier havde lignende niveauer af carboplatin optagelse ved 24 timer (1241 ± 192 X 10

6 molekyle per celle versus 1113 ± 58 x 10

6 molekyle per celle, p = 0,334), (Fig 2B ).

(AB) Sammenligning af celle optagelse og udstrømning. A. celle optagelse af oxaliplatin. 5637R celler var faldet celle optagelse. B: 5637 og 5637R havde lignende celle efflux satser. (CD) Oxaliplatin og carboplatin cellulære efflux forskelle mellem de to cellelinjer var ikke statistisk signifikante.

For at bestemme stof efflux blev cellerne udsat for [

14C] oxaliplatin eller [

14C ] carboplatin i 4 timer, vasket med PBS og dyrket i medikamentfrit medium i 24 timer. Dyrkningsmediet blev udtaget ved LSC på forskellige tidspunkter til bestemmelse af hastigheden af ​​efflux. Der var ingen signifikant forskel i oxaliplatin eller carboplatin efflux mellem de to cellelinier (udstrømningen ved 24 timer var 1514 ± 78 X 10

6 molekyler versus 1693 ± 244 X 10

6 molekyler per celle for oxaliplatin, p = 0,293 (fig 2C) og 542,3 ± 44,5 x 10

6 molekyler versus 482,5 ± 35,9 x 10

6 molekyler per celle for carboplatin, p = 0,14) (fig 2D)

Intracellulær inaktivering.

5637R celler havde en signifikant højere middel GSH-koncentration end 5637 celler (53,91 ± 0,83 nmol /mg protein versus 46.93 ± 1.20 nmol /mg protein. p = 0,003) (fig 3A). For at bestemme om den højere GSH-koncentration bidraget til kemoresistens, begge cellelinier blev dyrket i nærvær af buthionine sulphoximine (BSO), en inhibitor af gamma-glutamylcysteinsyntetase, som er nødvendig for GSH biosyntese [40]. BSO behandling faldt GSH i begge cellelinier i en dosisafhængig måde (Fig 3B). Eksponering af 5637R celler til 50 pM BSO efterfulgt af [

14C] oxaliplatin eksponering øget betyde oxaliplatin-DNA addukt niveauer 24 timer fra 285,4 ± 15,3 addukter pr 10

8 nukleotider til 424.6 ± 67,7 addukter pr 10

8 nukleotid, men dette var ikke statistisk signifikant (p = 0,113). Imidlertid BSO behandling nedsatte signifikant oxaliplatin IC

50 fra 26,08 pM for 5637R celler til 12,95 pM for BSO behandling (p = 0,002, Fig 3C). I modsætning hertil BSO behandling havde ringe effekt på følsomheden af ​​5637 celler til oxaliplatin (IC

50 af 2,45 uM ubehandlet versus 2,36 uM med BSO eksponering, data ikke vist. Uventet, BSO eksponering ikke havde nogen indvirkning på carboplatin IC

50 værdier for enten cellelinje (data ikke vist).

(A) Sammenligning af carboplatin-DNA adduktdannelse mellem 5637 og 5637R. (B) Sammenligning og korrelation af IC

50 værdier med carboplatin- addukt AUC, addukt niveauer fire timer efter dosering og DNA-reparation. (C) Sammenligning af celle optagelse og udstrømning af carboplatin mellem 5637 og 5637R celler.

Drug-DNA adduktdannelse og reparation

Celler blev dyrket med [

14C] oxaliplatin ved 10 uM (den omtrentlige peak humant oxaliplatin plasmakoncentration under kemoterapi) i 24 timer, efterfulgt af vask og kultur i yderligere 24 timer [33]. Denne protokol groft efterligner

in vivo

eksponering af oxaliplatin (koncentration eksponentiel nedgang blod i løbet af ca. en dag). Celler blev høstet på forskellige tidspunkter i løbet af 48 timer for DNA-ekstraktion og accelerator massespektrometri (AMS) analyse under anvendelse af fremgangsmåder tidligere beskrevet [41]. Kort fortalt AMS virker ved at nedbryde molekylerne i en prøve i atomer, som så identificerede og kvantificerede i en lille partikelaccelerator [42]. Hvis prøven er mærket med en sjælden isotop såsom

14C, kan koncentrationen af ​​radiokarbon atomer i partikelstråle anvendes til at beregne koncentrationen af ​​lægemiddel i blodet, væv, celler og sub cellulære komponenter såsom protein og DNA. AMS analyse kræver typisk være tale om prøver, grafit før analyse, hvilket kan gøres ved anvendelse af en high throughput parallel proces. Der var en tidsafhængig stigning i oxaliplatin-DNA addukt niveauer i løbet af en 24 timers inkubation, efterfulgt af en gradvis nedgang i løbet af de efterfølgende 24 timer på grund af en kombination af DNA-reparation og fortynding af signalet ved DNA-syntese. På alle tidspunkter, de oxaliplatin-DNA addukt niveauer i 5637R-celler var lavere end adduktet niveauer i 5637 celler (figur 4A). Efter 48 timer, 5637R-celler havde meget lavere DNA-addukter end de parentale 5637-celler (78 ± 4 versus 505 ± 63 addukter pr 10

8 nukleotid, s 0,0001, tabel 2). AUC for oxaliplatin-DNA addukter integreret over 48 timer studietid var signifikant lavere for 5637R celler (9,426 ± 2457 addukter-timers pr 10

8 nukleotider versus 27,720 ± 2985 addukter-timers pr 10

8 nukleotider, s = 0,001, tabel 2).

Sammenligning af oxaliplatin og carboplatin-DNA adduktdannelse mellem 5637 og 5637R-celler. De kemoterapi 5637R celler havde højere oxaliplatin-DNA addukt niveauer på alle tidspunkter i forhold til mere behandling sensitive 5637 celler.

For DNA reparation undersøgelser blev cellerne udsat for [

14C] oxaliplatin i 24 timer, vasket og dyrket yderligere i oxaliplatin-frit medium. Faldet af oxaliplatin-DNA-addukter på flere tidspunkter i løbet af de næste 24 timer blev anvendt til at beregne den lægemiddel-DNA-addukt reparation hastighed. 5637R celler havde en reparation på 3,48 ± 0,15 addukter pr 10

8 nukleotider /time og 1,34 ± 0,30 addukter pr 10

8 nukleotider-timer til 5637 celler (p = 0,0004, tabel 2).

dannelsen og reparation af carboplatin-DNA-addukter blev tilsvarende bestemt, men med kortere lægemiddeleksponeringer (4 timers eksponering efterfulgt af vask og en tyve timers inkubation i stoffri medier) for at efterligne den hurtigere

in vivo

plasmahalveringstid sammenlignet med oxaliplatin. Carboplatin-DNA addukt niveauer og lægemiddel-DNA reparation satser var ikke signifikant forskellig mellem de to cellelinjer (AUC af 4527 ± 895 versus 4211 ± 1678 monoadduct-hr /10

8 nukleotider, p = 0,69, tabel 2 og narkotika -DNA reparation satser på 6,30 ± 3,10 versus 9,31 ± 6,74 addukter /10

8 nukleotider /time, p = 0,34 for 5637R og 5637 celler, henholdsvis (figur 4B).

RNAseq analyse af 5637 og 5637R celler

totalt RNA blev isoleret fra subsammenflydende celler, der var dyrket i fravær af kemoterapi narkotika, og anvendt til analyse af RNA-seq. fra dobbelte uafhængige forsøg, var der i alt 83 RNA’er med statistisk signifikant ekspression ændringer, hvoraf 50 var forbundet med kendte gener, en kendt microRNA og 22 nye udskrifter. (p 0,05, S1 Fig og S1 tabel) De resterende 10 udskrifter repræsenterer gener, som ikke giver målbare udtryk i alle replikater, men kan stadig være relevant for resistens. Fire gener med kendt relevans for kemoresistens (TSPAN7, AKR1C2, AKR1C1, og Cyr61) viste sig at blive væsentligt opreguleret i den resistente cellelinje 5637R og to gener (HTRA1 og AQP3) blev nedreguleret i forhold til forældrenes cellelinie 5637 (tabel 3). RNA-seq resultater blev yderligere bekræftet af QRT-PCR-analyse af udvalgte udskrifter af RNA isoleret fra subkonfluente dyrket uden stoffer i to eksemplarer (figur 5).

Fire gener (TSPAN7, AKR1C2, AKR1C1, og Cyr61) har øget niveauer i 5637R celler og to gener (HTRA1 og AQP3) er faldet niveauer i de resistente celler. (A) Fold ændringer i kemoresistens gen niveauer i forhold til de 5637 parentale celler som bestemt ved RNA-seq. (B) Fold ændring i kemoresistens gen transkriptniveauer forhold til 5637 parentale celler, som bestemt ved QRT-PCR.

Diskussion

Efter ti måneders cellekultur under pres fra oxaliplatin eksponering den resulterende resistente cellelinje bevaret en 5637 afstamning som bestemt af STR-analyse, som begrundede sin udpegning som 5637R. Vores resultater kan sammenlignes med andre tidligere resultater om forældremyndighed og oxaliplatin resistente kræftceller celler [43-46]. Det er gådefuldt og overraskende, at carboplatin eksponering af 5637 celler under lignende eksperimentelle betingelser ikke producere en carboplatin resistent cellelinie, selvom 5637R celler er væsentligt resistente over for carboplatin. Dette er et uventet resultat i betragtning af den næsten universelle kliniske udbrud af resistens i fremskredne kræftformer efter behandling med platinbaseret regime. Vanskeligheden ved at inducere carboplatin resistens i 5637 celler kan skyldes den kendte ringe krydsresistens mellem oxaliplatin og carboplatin eller cisplatin [2]. Oxaliplatin kan fremkalde et andet sæt af mutation spektre sammenlignet med carboplatin, som er blevet rapporteret i en

HPRT

genmutationsforsøg i CHO celler til en sammenligning mellem cisplatin og oxaliplatin [47]. Uanset hvordan de blev genereret, den resulterende par cellelinjer repræsenterer en nyttig model for induceret resistens narkotika, især i betragtning af deres relativt få fænotypiske og genotypiske forskelle.

5637R /5637 par blev evalueret af MTT-analysen for resistens over for oxaliplatin og flere stoffer, der anvendes i behandlingen af ​​blærekræft. Oxaliplatin, carboplatin og gemcitabin var signifikant mindre cytotoksiske for 5637R celler. Doxorubicin, methotrexat og vinblastin var lige så toksiske for begge cellelinier. Dette resultat er ikke overraskende i betragtning erhvervet resistens over for ét lægemiddel ofte selekterer for en eller flere mekanistiske veje, der har flere lægemidler som substrater. I klinikken, reaktion på første linje platinbaseret terapi er 40-50% for muskel invasiv blærekræft, men når modstanden ensues, efterfølgende behandlinger har kun 10-25% responsrater [48, 49]. Men der skal meget ekstra arbejde, MTT data fra vores modelsystem indikere, at det er muligt at have væsentlig cytotoksisk respons på efterfølgende kemoterapi efter indtræden af ​​platin lægemiddelresistens hvis den korrekte behandling er valgt.

Måske den mest fælles resistens mekanisme er modulering af intracellulær akkumulering via ændringer i hastigheden af ​​optagelse og efflux [42].