PLoS ONE: cholestan-3β, 5α, 6β-triol Undertrykker spredning, migration og invasion for Human Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Oxysterols er oxidationsprodukter af kolesterol. Cholestan-3β, 5α, 6β-triol (forkortet triol) er en af ​​de mest udbredte og aktive oxysterols. Her rapporterer vi at triol udviser anticanceraktivitet mod humane prostatacancerceller. Behandling af celler med triol dosisafhængigt undertrykt proliferation af LNCaP CDXR-3, DU-145 og PC-3 humane prostatacancerceller og reduceret kolonidannelse i blød agar. Oral administration af triol ved 20 mg /kg dagligt i tre uger forsinket signifikant vækst af PC-3 xenotransplantater i nøgne mus. Flowcytometrisk analyse afslørede, at triol behandling ved 10-40 uM forårsagede G1 cellecyklusstop mens TUNEL-assayet viste, at triol behandling ved 20-40 uM induceret apoptose i alle tre cellelinier. Micro-vestlige Arrays og traditionelle Western blotting-metoder viste, at triol behandling resulterede i reduceret ekspression af Akt1-, phospho-Akt Ser473, phospho-Akt Thr308, PDK1, c-Myc, og Skp2 proteinniveauer samt akkumulering af cellecyklus-inhibitoren p27

Kip. Triol behandling resulterede også i reduceret Akt1 proteinekspression i PC-3 xenotransplantater. Overekspression af Skp2 i PC-3-celler delvist reddet vækstinhiberingen forårsaget af triol. Triol behandling undertrykt migration og invasion af DU-145, PC-3, og CDXR-3-celler. Ekspressionsniveauerne af proteiner forbundet med epitel-mesenkymale overgang samt fokal adhæsion kinase blev påvirket af triol behandling i disse celler. Triol behandling forårsagede forøget ekspression af E-cadherin proteinniveauer men nedsat ekspression af N-cadherin, vimentin, Slug, FAK, phospho-FAK Ser722, og phospho-FAK Tyr861 proteinniveauer. Konfokal laser mikroskopi afslørede omfordeling af β-actin og α-tubulin ved periferien af ​​de CDXR-3 og DU-145-celler. Vore iagttagelser antyder, at triol kan repræsentere et lovende terapeutisk middel til fremskreden metastatisk prostatacancer

Henvisning:. Lin C-Y, Huo C, Kuo L-K, Hiipakka RA, Jones RB, Lin H-P, et al. (2013) cholestan-3β, 5α, 6β-triol Undertrykker spredning, migration og invasion af human prostatacancer celler. PLoS ONE 8 (6): e65734. doi: 10,1371 /journal.pone.0065734

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: December 28, 2012; Accepteret: April 27, 2013; Udgivet: 13 juni 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CS-101-PP-14 (National Health Research Institutes), NSC 99-2320-B-400-015-MY3 og NSC 101-2325-B-400-014 (National Science Council) i Taiwan for CPC; DOH101-TD-C-111-004 (Department of Health) i Taiwan for JYC og CPC. CYL understøttes af DOH101-TD-C-111-004. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden hyppigst diagnosticeret kræft i mænd og den femte mest almindelige kræftform samlet i verden. I 2008 blev mere end 899.000 nye tilfælde diagnosticeres (GLOBOCAN 2008 database, version 1.2). I vestlige lande er prostatacancer den mest almindelige non-kutant carcinom i mænd. Ifølge statistikkerne for Surveillance Epidemiologi og End Resultater (SEER) af National Cancer Institute, blev mere end 240.000 mænd diagnosticeret med og mere end 28.000 mænd døde af prostatakræft i 2012 i USA. Selvom kirurgi er ofte en succes for orgel-begrænset prostatakræft, androgen ablation terapi er den primære behandling for metastatisk prostatacancer. Desværre vil de fleste prostatakræft patienter, der modtager androgen ablation terapi i sidste ende udvikle tilbagevendende, kastrationsresistent tumorer inden for 1-3 år efter behandlingen. Den mediane samlede overlevelse tid er 1-2 år efter kræft tilbagefald [1], [2]. Der findes ingen effektiv standardbehandling for patienter, der tilbagefald med fremskreden prostatacancer. Kemoterapi er ofte anvendes til behandling af metastatisk hormon-refraktær prostatacancer 2,3. Men kemoterapier viser generelt ringe effekt på forlængelse overlevelse. Derfor er der behov nye behandlinger for avancerede prostatakræft.

Oxysterols er oxidationsprodukter af kolesterol. Oxysterols spiller væsentlige roller i reguleringen cholesterolhomeostase, trombocytaggregation, apoptose, og protein prenylering [4]. Men oxysterols forbundet med udviklingen af ​​åreforkalkning, neurologiske sygdomme og kræft [4]. Visse oxysterols er blevet rapporteret til at udvise anticancer effekter, eventuelt via modulering af kolesterol efflux, Akt, eller lever X-receptorer (LXRs) [5], [6]. For eksempel behandling med 22 (R) -hydroxycholesterol, 24 (S) -hydroxycholesterol, 7α-hydroxycholesterol, 7β-hydroxycholesterol, 25-hydroxycholesterol, og 5α, 6α-epoxycholesterol undertrykte proliferationen af ​​humane prostata, bryst, colon, lunge, og leukæmi cancerceller [7] – [14]. Disse oxysterols forårsaget enten G1 cellecyklusstandsning [7] – [11] eller apoptose i cancerceller [12] – [14]. Derfor oxysterols med cytotoksisk aktivitet kan være et potentielt terapeutisk middel til avancerede prostatakræft.

cholestan-3β, 5α, 6β-triol (forkortet triol) er en af ​​de mest udbredte oxysterols. Triol er afledt fra cholesterol ved oxidation via dannelse af 5α, 6α-epoxycholesterol og 5β, 6β-epoxycholesterol [15], [16] som mellemprodukter. Tidligere 5α, blev 6α-epoxycholesterol rapporteret at udvise anticanceraktivitet [13]. I denne undersøgelse undersøgte vi evne triol til at undertrykke spredning af avancerede humane prostatakræft-cellelinier både

in vitro

in vivo

. Vi anvendte Micro-vestlige Arrays, et nyligt udviklet antistof-baseret, high-throughput Western blotting assay [17] – [20], for at studere de signalproteiner ramt af triol i fremskreden prostatacancer celler. Vores observationer foreslog, at triol kan repræsentere en lovende terapeutisk middel til avanceret metastatisk prostatacancer.

Materialer og metoder

Materialer

cholestan-3β, 5α, 6β-triol blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Matrigel blev købt fra BD Bioscience (San Jose, CA, USA).

Cell Culture

Prostatakræft cellelinjer PC-3, DU-145, og LNCaP underlinjer var en gave fra laboratoriet professor Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, USA). Disse cellelinier blev beskrevet tidligere [7], [8], [10], [21] – [27]. LNCaP CDXR-3 celler blev passeret og vedligeholdes som beskrevet tidligere [7], [8], [10], [11], [21] – [23], [27]. DU-145 og PC-3-celler blev holdt i DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA), penicillin (100 U /ml ) og streptomycin (100 ug /ml) (komplet medium) som tidligere beskrevet [28]. De PZ-HPV-7-celler blev erhvervet fra Bioresource Indsamling og Research Center (BCRC, Hsinchu City, Taiwan) og blev dyrket i en keratinocyt-serumfrit medium (Gibco /Invitrogen) med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor og 50 ug /ml oksehypofyseekstrakt.

celleproliferationsassay

celler blev podet ved en densitet på 3 x 10

3 celler /brønd i 100 pi komplet medium i 96-brønds plader. Proliferationsassays blev udført under vedligeholdelse betingelser (DMEM med 10% FBS til PC-3 og DU-145; DMEM med 10% CS-FBS i LNCaP CDXR-3). Relative celleantal blev analyseret ved måling af DNA-indholdet i cellelysater med det fluorescerende farvestof Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO, USA) som tidligere beskrevet [8], [10], [11], [21], [ ,,,0],23], [24], [27], [28]. Alle readouts blev normaliseret til gennemsnittet af kontrolgruppen tilstand (ingen triol behandling) i hvert enkelt eksperiment. Eksperimentet blev gentaget tre gange. Ti brønde blev anvendt til hver tilstand. Den middelværdi og standardafvigelse repræsenterede gennemsnittet og standardafvigelsen henholdsvis af resultaterne fra alle 30 brønde i de tre forsøg.

Cell Levedygtighed Assay

Celler blev podet ved en tæthed på 3 × 10

3 celler per brønd i en plade med 96 brønde (BD Bioscience). Efter 24 timer blev cellerne behandlet med stigende koncentrationer af triol i 48 timer eller 96 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved en MTT (3,4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2-5-diphenyltetrazoliumbromid) assay [29]. Mængden af ​​formazan blev bestemt ved måling af absorbansen ved 560 nm med en Tecan Genios ™ pladelæser (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) [29]. Alle resultater blev normaliseret til gennemsnittet af kontrolgruppen tilstand (ingen triol behandling) i hvert enkelt eksperiment. Eksperimentet blev gentaget tre gange. Hver gang ti brønde blev anvendt for hver tilstand. Middelværdien og standardafvigelsen repræsenteret resultaterne fra alle 30 brønde i de tre eksperimenter.

flowcytometrisk analyse

Celler blev podet ved en densitet på 5 x 10

5-celler i 10- cm skåle i 10 ml medium og dyrket i 24 timer inden tilsætning af triol. Efter 48 timers dyrkning i nærværelse af forskellige koncentrationer af triol blev celler fjernet med trypsin og fikseret i 70% ethanol i phosphatpufret saltvand (PBS) natten over ved -20 ° C. Fikserede celler blev vasket med PBS, behandlet med 0,1 mg /ml RNase A i PBS i 30 min, og derefter suspenderet i PBS indeholdende 50 ug /ml propidiumiodid. Cellecyklus profiler og fordelinger blev bestemt ved flow-cytometri af celler under anvendelse af en BD Facscan flowcytometer (BD Biosciences). Fordelingen cellecyklus blev analyseret ved hjælp ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME, USA), som beskrevet [10], [23], [24], [26], [27].

Soft agar-kolonidannelse Assay

PC-3 og LNCaP CDXR-3-celler (8 x 10

3) blev suspenderet i 0,3% lavtsmeltende agarose (Lonza, Allendale, NJ, USA) indeholdende DMEM med 10% FBS eller 10% trækul-strippet FBS (CS-FBS), henholdsvis og derefter lag oven på 3 ml størknet 0,5% lavtsmeltende agarose indeholdende DMEM medium med 10% FBS (PC-3) eller 10% CS-FBS ( CDXR-3) i 6 cm skåle. Cellerne fik lov at vokse ved 37 ° C med 5% CO2 i 14 dage (PC-3) eller 17 dage (CDXR-3). Pladerne blev farvet med 0,005% krystalviolet i 30% ethanol i 6 timer for at detektere cellekolonier.

TUNEL Assay

Celler blev dyrket på dækglas i 24 brønde og blev behandlet med 0, 20, og 40 uM triol i 48 eller 96 timer. Celler blev skyllet to gange med PBS og underkastet TUNEL assay under anvendelse ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit (katalognr. 630.108 fra Clontech, Mountain View, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Tunel-farvede celler blev observeret med Olympus konfokale mikroskop ved 200 × (FV300, Olympus, Tokyo, Japan).

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health (Taiwan). Protokollen blev godkendt af National Health Research Institutes Institutional Animal Care og brug Udvalg (NHRI-IACUC-101.046-A). Mus blev holdt under kontrollerede miljøbetingelser (22 ° C, 12 timer alternative lys-mørke cyklus, 50% fugtighed, foder og vand ad libitum). Anæstesi (Isofluran 1%) blev givet til at mindske smerter i mus under inokulering af prostatacancerceller. Animal omhu blev gennemført i overensstemmelse med de almindelige etiske retningslinjer (National Institutes of Health ‘s “Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr”, og klinisk laboratorium dyremedicin (K. Hrapkiewicz, L. Medina, og DD Holmes, 1998, Iowa State University Tryk). forsøget var designet til at minimere antallet af nøgne mus, der anvendes.

tumorxenoplantater i athymiske mus

Eksperimenter med mus blev godkendt af National Health Research Institutes Institutional Animal Care og brug Udvalg ( NHRI-IACUC-101.046-A). Balb /c nu /nu-mus (NCI Frederick, MD), 6-8 uger gamle, blev injiceret subkutant i begge flanker med 5 × 10

5 PC-3 celler suspenderet i 0,5 ml Matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA). blev startet Overvågning af tumorvækst en uge efter tumorinokulation. mus blev opdelt i kontrol- og behandlingsgrupper. 5 mus, der bærer 10 tumorer omfattede kontrolgruppen og 5 mus med 8 tumorer omfattede behandlingsgruppe. Tre uger efter podning med PC-3-celler blev mus i behandlingsgruppen behandlet oralt 5 dage /uge med 20 mg /kg triol. Triol blev administreret i en bærer indeholdende 1% Tween 20, 25% dimethylsulfoxid i PBS. Mus i kontrolgruppen blev tvangsfodret med kun vehikel. Triol behandling blev påbegyndt 21 dage efter podning med celler og fortsatte i 21 dage. Tumorer blev målt ugentligt bruge skydelære og volumen blev beregnet ved hjælp af formlen volumen = længde × bredde × højde × 0,52 [7], [21] – [23].

Luciferase-reporter Assay

PC-3-celler blev podet ved 2 × 10

5 celler /brønd i en plade med 12 brønde i DMEM indeholdende 10% FBS. 24 timer efter udpladning PC-3-celler blev transficeret med pRL-TK-Renilla luciferase plasmid (normalisering vektor; 5 ng /brønd), pSG5RXRα og pSG5LXRα (400 ng /brønd), 4xDR4Δ56cfos pGL3 (reportergen vektor; 500 ng /brønd ) ved anvendelse af PolyJet ™ in vitro DNA transfektionsreagens (SigmaGen Laboratories, Rockville, MD, USA). 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med stigende koncentrationer af triol eller T0901317. Efter yderligere 24 timer blev celler lyseret i 100 pi passive lysis buffer (Promega, Madison, WI, USA) og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af en dobbelt-Luciferase kit (Promega) i en 20/20

n luminometer Turner Biosystems .

Western blotting-analyse

Cells prøver blev lyseret i SDS lysis buffer (240 mM Tris-acetat, 1% SDS, 1% glycerol, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 mM dithiothreitol) indeholdende proteaseinhibitorerne 1 mM 4- (2-aminoethyl) benzensulfonylfluorid (AEBSF), 0,8 uM aprotinin, 40 uM bestatin, 14 uM E-64, 20 uM leupeptin, 15 pM pepstatin A (Sigma-Aldrich, P8340) og phosphatase hæmmere cantharidin bromtetramisol og microcystin LR (Sigma-Aldrich, P2850). Væv blev fremstillet fra væv homogeniseret i 2 × Laemmli puffer som beskrevet tidligere [7], [21] – [24]. Angivelse af proteiner, herunder Akt1-, Skp2, phospho-Akt Ser473, phospho-Akt Thr308, PDK1, phospho-p44 /42 MAPK Thr202 /Tyr204, CDK2, CDK6, fedtsyre syntase (FASN), GSK-3α, GSK-3β, Rb , cyclin B1, cyclin D1, phospho-p38 MAPK Thr180 /Tyr182, phospho-PDK1 Ser241, phospho-Rb Ser780, FAK, og MMP9 blev påvist under anvendelse af antistoffer fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). E-cadherin, N-cadherin, og p27

Kip1 antistoffer var fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Antistoffer til påvisning af c-Myc, caspase 3, caspase 8, caspase 9, PTEN var fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Slug antistof blev købt hos Abgent (San Diego, CA, USA). Vimentin antistof var fra Thermo (Waltham, Massachusetts, USA). Antistofferne mod Akt1, Akt2, Akt3, Bcl-2, P53, Cdk4, NF-KB, cyclin A, cyclin E1, cyclin E2, E2F-1, phospho-GSK-3α Ser21, phospho-GSK-3β Ser9, phospho- c-Myc Thr58 /Ser62, phospho-PTEN Ser385, phospho-FAK Ser722, phospho-FAK Tyr861, og α-tubulin var fra Millipore (Billerica, MA, USA). Antistoffer påvisning α-tubulin, β-actin, og GAPDH blev erhvervet fra Novus (Littleton, CO, USA). Antistoffer for Skp2, p21

Cip, og p27

Kip var fra Santa Cruz (Dallas, TX, USA). Peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin og anti-mus IgG sekundære antistoffer var fra Santa Cruz. Signalet af peberrodsperoxidase-mærket sekundære antistoffer blev detekteret ved forøget kemiluminescens-reaktion (ECL Western Blotting detektion kit) (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). GAPDH, α-tubulin, og β-actin blev anvendt som indlæsning kontroller.

Micro-Western Arrays

CDXR-3 og DU-145-celler blev behandlet med vehikel (DMSO) eller 10 uM triol i 48 timer. Micro-vestlige Arrays blev udført for at måle protein-ekspression og modifikation som beskrevet tidligere [17], [18], [20], [24].

Skp2 Overekspression i PC-3 Cells

ektopisk ekspression af Skp2 blev opnået ved at inficere PC-3-celler med et retrovirus genereret fra LPCX plasmid indeholdende vildtype humant Skp2 cDNA som beskrevet [10]. Puromycin-resistente kolonier blev ekspanderet og screenet for øget Skp2 proteinekspression ved Western blot analyse. PC-3 celler inficeret med en tom LPCX retrovirus blev anvendt som kontroller [10]. Celler blev lyseret i Laemmli buffer uden bromphenolblåt farvestof.

Real-Time kvantitativ polymerasekædereaktion

RNA blev ekstraheret fra PC-3 og DU-145 celler behandlet med 0, 10, og 20 uM triol i 48 timer under anvendelse af RNeasy Minikit (kat. nr 74.104, Qiagen, Venlo, Holland) ifølge producentens instruktioner. Det genomiske DNA blev fjernet ved DNase-on-søjle behandling følger med mini kit. RNA-koncentrationen blev bestemt spektrofotometrisk ved 260 nm. Lige mængder RNA blev anvendt i cDNA syntesereaktioner med Reverse Transciption SystemRevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas /Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Real-time kvantitativ PCR blev udført som tidligere beskrevet [7], [8], [21] – [23], [28] ved brug af SYBR Green system /«reagenser i en optisk plade med 96 brønde og cykliseringsbetingelser bestående af 2 min ved 50 ° C, 10 min st 95 ° C, 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 60 sekunder ved 60 ° C på en ABI Prism-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvenserne af primere til ATP-bindende kassette transporter A1 (ABCA1) var TGTCCAGTCCAGTAATGGTTC (fremad) og AAGCGAGATATGGTCCGGATT (tilbage). Transkriptet niveau af ABCA1 blev bestemt i PC-3 og DU-145-celler efter behandling med 0, 10 og 20 uM triol i 48 timer og blev normaliseret til GAPDH-niveauer i hver prøve.

Transwell Migration Assay

Migration assays med PC-3 celler blev udført med en transwell kit fra BD Bioscience (katalog nummer 353.097). PC-3 blev DU-145, og CDXR-3-celler behandlet med 0, 10 og 20 uM triol i 48 timer. Celler blev derefter fjernet fra vævskulturplader med trypsin og vasket to gange med PBS. Triol-behandlede celler (1 x 10

4) i 250 ul DMEM uden serum blev anbragt i det øvre invasion kammer og det nedre kammer blev fyldt med DMEM indeholdende 10% FBS. Den cellemigrering kammer blev indsat i det nedre rum og inkuberet i enten 6 (PC-3, DU-145) eller 24 (CDXR-3) timer ved 37 ° C. Celler på oversiden af ​​filteret blev fjernet med en vatpind. Celler bundet til filteret blev derefter fikseret med methanol i 10 min. Celler bundet til filteret blev derefter farvet med Giemsa farve (5%) i 1 time. Filtrene blev de-farvet ved vask med vand, og antallet af celler bundet til filteret blev derefter kvantificeret ved optælling celler i fotografier af de farvede filtre.

Transwell Invasion Assay

En invasion assay med PC-3-celler blev udført med vækstfaktor Reducerede BD BioCoat Matrigel invasion kamre (BD Biosciences) ifølge producentens anvisninger. PC-3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af triol i 48 timer. Celler blev derefter trypsiniseret og vasket to gange med PBS. Celler fra hver betingelse blev podet ved 4 × 10

4 celler per brønd i serumfrit DMEM i det øvre rum, og DMEM-medium med 10% FBS blev anbragt i det nedre kammer af kammeret som kemo-tiltrækningsstof. Efter 24 timers inkubation blev ikke-invaderende celler på den øvre side af kammeret fjernet, og membranerne blev fikseret med methanol, vasket og farvet med Giemsa opløsning. Invasionsevne blev vurderet ved at tælle de invaderende celler under et lysmikroskop. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Sårheling Assay

CDXR-3-celler blev forbehandlet med 0, 10 og 20 uM triol i 24 timer. Celler blev derefter fjernet fra vævskulturplader med trypsin og vasket to gange med PBS. Celler blev podet i en koncentration på 3,5 × 10

4 celler /brønd i 12-brønds plader. Efter 24 timer blev en sårhelende assay udføres ved skrabning af cellerne med en 200-pi pipettespids. Celler blev observeret ved 0, 8, og 24 timer efter skrabning og fotograferet med en levende imaging mikroskop (Leica AF 6000 LX, Leica, Wetzlar, Tyskland). Afstanden migration blev automatisk målt ved program inde direkte billedvisning mikroskop.

konfokalmikroskopi

CDXR-3 og DU-145 celler blev behandlet med 0 eller 10 pM triol i 24 timer. Celler blev derefter vasket 3 gange med PBS-buffer i 5 minutter per vask ved stuetemperatur (RT), fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur og skyllet med PBS 3 gange i 5 minutter per vask og permeabiliseret i 10 minutter ved stuetemperatur med 0,1% Triton X-100 i PBS. Celler blev blokeret i uspecifik proteinbinding med 2% bovint serumalbumin i PBS i 30 minutter, skyllet med PBS tre gange i 5 min hver. Celler blev inkuberet med β-actin eller α-tubulin antistof i en time. Efter vask blev cellerne inkuberet med sekundært FITC-konjugeret antistof i en time. Efter vask blev cellerne monteret under objektglas og forseglet med Permount. Billeder af celler blev observeret med et Olympus konfokal mikroskop ved 400 × (okular linse 10 ×; objektiv linse 40 ×). (FV300, Olympus, Tokyo, Japan)

Dataanalyse

Data er præsenteres som middelværdien +/- SD af mindst tre forsøg eller er repræsentative for forsøg gentages mindst tre gange. Students t-test (to-halet, uparret) blev anvendt til at evaluere den statistiske signifikans af resultater fra proliferationsassay eksperimenter. En Microsoft Excel add-in program ED50V10 blev brugt til at beregne halv maksimal effektiv koncentration (EF

50).

Resultater

Triol Undertrykt spredning af menneskelige prostata cancer celler

Vi først forsøgt at bestemme virkningen af ​​triol behandling levedygtighed og proliferation af tre almindeligt anvendte human prostatacancer-cellelinier (fig. 1). LNCaP CDXR-3-celler er androgenreceptor (AR) -positive, tilbagefald, androgen-uafhængige celler afledt fra parentale AR-positive androgenafhængige LNCaP 104-S-celler [27]. DU-145 og PC-3 begge er AR-negative androgen-ufølsomme celler etableret fra hjerne- [30] og knogle- [31] afledt metastase hhv. Et MTT-assay og et Hoechst farvestof-baserede proliferationsassays indikerede, at triol undertrykt både cellelevedygtighed og celleproliferation (fig. 1). Den inhiberende virkning på proliferation var dosisafhængig og forøget over tid (fig. 1, tabel S1). EF

50 for triol i MTT-analysen var magen til EF

50 målt ved Hoechst dye-baserede proliferation assay (tabel S1), hvilket antyder, at hæmning af celleproliferation blev ansvarlig for reduktionen af ​​levedygtige celler forårsaget af triol behandling i alle tre humane avancerede prostatakræft-cellelinier.

LNCaP CDXR-3, DU-145 og PC-3 prostatacancerceller blev behandlet med stigende koncentrationer af triol i 48 timer (A) (C) eller 96 timer (B) (D). Relativ levedygtighed og relative celleantal af prostatacancerceller blev bestemt ved MTT (3,4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2-5-diphenyltetrazoliumbromid) 96-brønds assay (A) (B) og Hoechst farvestof 33258- baseret 96-brønd proliferation assay (C) (D), henholdsvis som beskrevet i Materialer og Metoder. Celleantal blev normaliseret til kontrol (dimethylsulfoxid) for hver cellelinje. Stjerne (*, **, ***) repræsenterer statistisk signifikant forskel (

s

0,05,

s

0,01,

s

0,001) mellem den behandlede gruppe og kontrolgruppen.

Triol Behandling Hæmmet Colony Dannelse af PC-3 og CDXR-3 celler i blød agar

Behandling af PC-3 og LNCaP CDXR-3 celler med 25 pM og 50 pM triol markant inhiberede dannelsen af ​​PC-3 og LNCaP CDXR-3 kolonier i blød agar, hvilket bekræfter den anti-cancer aktivitet af triol. DU-145-celler voksede for langsomt i blød agar til påvisning tilstrækkelige kolonier til yderligere analyse (Fig. 2).

PC-3 (A) og LNCaP CDXR-3 (B) celler behandlet med 0, 10, eller 20 uM triol i 14 og 17 dage henholdsvis. Billedet er et repræsentativt resultat af tre biologiske gentagelser.

Triol Behandling Retarded Vækst af Androgen-ufølsom prostatakræft Xenografter i nøgne mus

For at afgøre, om triol kunne undertrykke tumorvækst

in vivo

, udførte vi en pilot undersøgelse med DU-145-xenografter i nøgne mus. Intraperitoneal (i.p.) injektion af 1 mg (50 mg /kg) af triol dagligt i 14 dage forårsagede en reduktion i den gennemsnitlige mængde af DU-145 xenotransplantater vokser i nøgne mus (fig. S1) 36%. Triol behandling i 14 dage påvirkede ikke legemsvægt mus (data ikke vist). For at bestemme om lavere orale doser af triol kunne hæmme væksten af ​​PC-3 prostata-xenotransplantater. vi oralt administreret triol ved 20 mg /kg fem gange om ugen. Oral administration af 20 mg /kg triol (5 gange om ugen) fra 3

rd til 6

th uge forårsagede en reduktion på 65% i gennemsnit tumorvolumen (p = 0,0002) i behandlingsgruppen sammenlignet med tumorvolumen i køretøjet kontrolgruppen (fig. 3A). Legemsvægt af både køretøjet og triol-behandlede grupper nedtrappes (fig. 3B). Dette kan skyldes cachetic effekter af PC-3 xenotransplantater. Disse observationer har bekræftet, at oral indgivelse af triol kunne forsinke væksten af ​​prostata tumorer

in vivo

.

Male Balb /c nu /nu-mus, 6-8 uger gamle, blev injiceret subkutant i begge flanker med 5 × 10

5 PC-3-celler suspenderet i 0,5 ml Matrigel. Tumorer blev målt dagligt bruger skydelære og volumen blev beregnet ved hjælp af formlen volumen = længde × bredde × højde × 0,52. Overvågning af tumorvækst blev startet én uge efter podning med tumoren. Mus blev opdelt i kontrol- og behandlingsgrupper. Kontrolgruppen havde 5 mus, der bærer 10 tumorer og behandlingsgruppen havde 5 mus, der bærer 8 tumorer. Tre uger efter den første inokulering, blev behandlingsgruppen oralt administreret triol dagligt i en dosis på 20 mg /kg, 5 dage /uge. Mus i kontrolgruppen blev tvangsfodret med kun vehikel. Behandlingen startede på dag 22 og sluttede på dag 42 efter podning med tumoren. Tumorvolumener blev vist som gennemsnit ± standardafvigelse (A), mens legemsvægt mus blev vist som middelværdi ± standardafvigelse (B).

Triol-behandling forårsagede G1 cellecyklusstop i prostatacancerceller

Vi næste udført flowcytometrisk analyse for at bestemme, om cellecyklusprogression af prostatacancerceller er påvirket af triol. Behandling med 10 pM triol i 48 timer forårsagede en stigning i G1-fasen cellepopulationen og et fald i S og G2 /M-fase populationer af LNCaP CDXR-3 og DU-145 prostatacancerceller (fig. 4A, 4B). Triol ved 10 uM påvirkede ikke cellecyklusprogression af PC-3-celler. Men 20 uM triol forårsagede en signifikant stigning i G1 og fald i S og G2 /M-populationer af PC-3-celler (fig. 4C). Behandling med 10-20 pM triol induceret G1 cellecyklusstop i LNCaP, DU-145 og PC-3-celler. Vi har ikke observere nogen stigning i sub-G1 befolkning i disse tre prostata cancer cellelinjer. For at bestemme om højere koncentrationer af triol vil forøge populationen af ​​celler i sub-G1, behandlede vi DU-145-celler med 0, 20, og 40 uM triol (fig. 4D). Reduktion af S-fase befolkning og induktion af G1-fasen population af DU-145-celler var endnu mere markant efter behandling med 40 pM triol. Der var imidlertid ingen signifikant stigning af celler i sub-G1 befolkning.

LNCaP CDXR-3 (A) og DU-145 celler (B) blev behandlet med 0 eller 10 pM triol i 48 timer. PC-3-celler (C) blev behandlet med 0, 10 eller 20 uM triol i 48 timer. (D) DU-145-celler blev behandlet med 0, 20, og 40 uM triol i 48 timer. Cellecyklusfordeling blev bestemt ved flowcytometri. Stjerne (*, **, ***) repræsenterer statistisk signifikant forskel (

s

0,05,

s

0,01 og

s

0,001, henholdsvis) mellem den behandlede gruppe og kontrolgruppen.

Behandling med høj koncentration af Triol apoptose i Prostata Cancer Cells

Som propidiumiodidfarvning flowcytometrisk analyse er ikke en pålidelig metode at detektere apoptose har vi benyttet TUNEL-assayet for at bestemme om triol behandling ved højere koncentrationer inducerede apoptose i prostatacancerceller. Vi behandlede CDXR-3, DU-145, PC-3-celler med 0, 20, og 40 uM triol i 48 eller 96 timer. Overensstemmelse med flowcytometrianalyse data, behandling med triol i 48 timer kun produceret en lille population af apoptotiske celler i alle disse cellelinier (data ikke vist). Behandling med triol i 96 timer dosisafhængigt resulteret i en øget populationen af ​​apoptotiske celler i alle tre prostata cancer cellelinjer (fig. 5). Selvom behandling med 20 pM triol i 96 timer kun lidt øget den apoptotiske population, behandling med 40 pM triol resulterede i en signifikant stigning i apoptose i alle tre prostata cancercellelinjer.

LNCaP CDXR-3, DU-145 og PC-3-celler blev behandlet med 0, 20, og 40 uM triol i 48 timer. Cellemorfologi blev bestemt ved lysmikroskopi. TUNEL-assayet blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder til bestemmelse af apoptotiske cellepopulation. Grønt fluorescerende lys angivet apoptotiske celler farvet med TUNEL-assay. Billeder blev set ved 200 × med Olympus konfokal mikroskop.

Micro-vestlige Array Revealed signalproteiner bliver påvirket af Triol Behandling

Vi antager, at triol kan reducere cellernes levedygtighed gennem dens virkning på protein signalering netværk. For at afgøre, hvad signalproteiner kan være påvirket af triol behandling, vi brugte Micro-vestlige Arrays (mwas), en high-throughput Western blotting assay [17] – [20], [24], til at screene for signalproteiner ramt af behandling med 10 pM triol i CDXR-3 og DU-145-celler. PTEN ofte udgår i prostatacancer, hvilket resulterer i aktivering af PI3K /Akt signalering [32]. PI3K /Akt signalering spiller en vigtig rolle i overlevelse og progression af prostatacancerceller [32], [33]. Opregulering af PI3K /er Akt aktivitet forbundet med dårlig klinisk resultat af prostatakræft [34]. Vi anvendte 48 antistoffer, der er i stand til at detektere proteiner regulerer cellecyklusprogression, celleoverlevelse og apoptose, Akt-relateret signalveje, og flere epithelial-mesenchymal overgang (EMT) markører (figur S2, tabel S2) til screening del af vores MWA undersøgelse (fig. 6). Forskelle i proteinet ekspressionsprofilen i fravær og nærvær af 20 uM triol er vist i fig. 7. Hver af de tre cellelinjer havde en unik proteinekspression respons på triol behandling. Protein- profiler af CDXR-3 og PC-3-celler efter behandling med 20 pM triol var mere ligner hinanden end til DU-145-celler.