PLoS ONE: opreguleret UHRF1 Fremmer blærekræft Cell Invasion af epigenetisk inaktivering af KiSS1

Abstrakt

Ubiquitin-lignende med PHD og ringfinger domænerne 1 (UHRF1), som en epigenetisk regulator, spiller en vigtig rolle i tumorigenese og kræft progression. KiSS1 fungerer som en metastase suppressor i forskellige cancerformer, og epigenetisk inaktivering af KiSS1 øger metastatiske potentiale af cancerceller. Vi undersøgte derfor, om UHRF1 fremmer blærekræft celle invasion ved at hæmme KiSS1. Ekspressionsniveauerne af UHRF1 og KiSS1 blev undersøgt ved kvantitativ real-time PCR-analyse

in vitro

in vivo

. Rolle UHRF1 i regulering blærekræft metastase blev evalueret i blærekræft celle. Vi fandt, at UHRF1 niveauer opreguleres i de fleste kliniske prøver af blærekræft sammenlignet med parrede normale væv, og UHRF1 ekspressionsniveauer øges væsentligt i primære tumorer, der efterfølgende metastaseret sammenlignet med ikke-metastatiske tumorer. Tvunget udtryk for UHRF1 fremmer blærekræft celle invasion, mens UHRF1 knockdown formindsker celle invasion. Overekspression af UHRF1 øger methylering af CpG nukleotider og reducerer ekspressionen af ​​KiSS1. UHRF1 og KiSS1 ekspressionsniveauet er negativt korreleret

in vivo

in vitro

. Knockdown af KiSS1 fremmer blærekræft celle invasion. Vigtigere, tvungen ekspression af KiSS1 delvist ophæver UHRF1-induceret celleinvasion. Disse data viste, at opreguleret UHRF1 øger blærekræft celle invasion af epigenetisk inaktivering af KiSS1

Henvisning:. Zhang Y, Huang Z, Zhu Z, Zheng X, Liu J, Han Z, et al. (2014) opreguleres UHRF1 Fremmer blærekræft Cell Invasion af epigenetisk inaktivering af KiSS1. PLoS ONE 9 (10): e104252. doi: 10,1371 /journal.pone.0104252

Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, USA

Modtaget: April 2, 2014 Accepteret: 7 jul 2014; Udgivet: 1 okt 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Menneskelig blærekræft ligger på andenpladsen i hyppigheden af ​​kræft i [1], og omkring 50% af patienter diagnosticeret med muskel-invasiv blærekræft (MIBC) udvikler fjernmetastaser i lungerne og lever, hvilket resulterer i dårlige 5-års overlevelsesrater [2]. I øjeblikket er de fremskridt i passende terapi til forbedring overlevelsesrate begrænset, fordi de underliggende mekanismer, der forårsager kræft metastaser ikke er godt forstået. Derfor er det meget vigtigt at afsløre den molekylære mekanisme for blærekræft metastase til udvikling effektiv terapi.

UHRF1, også kaldet ICBP90 i mennesker og Np95 i mus, er en multidomain protein, som er nødvendig for epigenetisk regulering af genekspression og kromatin modifikation [3], [4]. UHRF1 øger G1 /S overgang som målet for E2F transkriptionsfaktor [5], og ændringer i UHRF1 ekspressionsniveauet regulerer cellecyklusprogression, celledeling og celle migration [6], [7]. UHRF1 opreguleres i flere typer af cancere, og overekspression af UHRF1 er involveret i tumorigenese og cancer progression [8], [9]. Adskillige rapporter har vist, at UHRF1 kan være en vigtig biomarkør for diagnose og prognose af kræft [5]. Unoki

et al

viste, at UHRF1 overekspression er forbundet med kvalitet og stadium af blærekræft [10]. Overekspression af UHRF1 i blærekræft også korreleret med øget risiko for kræft progression efter transuretral resektion [10]. Wang

et al

viste, at UHRF1 er overudtrykt i kolorektal cancer (CRC) cellelinier og kliniske prøver [5]. UHRF1 ekspressionsniveauerne er korreleret med kræft metastase og fattige Dukes iscenesættelse. UHRF1 knockdown inducerer celle apoptose og cellecyklusstandsning ved G0 /G1-fasen og undertrykker celleproliferation og migration.

UHRF1 er en meget vigtig regulator af DNA-methylering, og uregelmæssig DNA-methylering er en hyppig epigenetisk begivenhed i blærekræft [6], [11]. UHRF1 genkender hemimethyleret DNA dannet under DNA-replikation og rekrutterer DNMT1 (DNA methyltransferase1) for at sikre trofast vedligeholdelse af DNA-methyleringsmønstre i datterceller [6]. KiSS1 er identificeret som undertrykke metastaser i forskellige kræftformer, såsom blærecancer, brystcancerceller og melanom [12]. KiSS1 koder for et 145-aminosyre-protein, som forarbejdes til KiSSpeptins (KP), herunder KP10, KP13, KP14 og KP54 [12], [13], [14]. Nylige undersøgelser har vist, at KiSS1 epigenetisk er bragt til tavshed af hypermethylering i blærekræft [15]. Cebrian

et al

viste, at KiSS1 hypermethylering ofte observeres, og er korreleret med lav genekspression, blive gendannet ved demethylering azacytidin i blære cancerceller [12]. Hypermethylering af KiSS1 er også korreleret med høj tumorklassificering og scene. På trods af disse spændende fund, er lidt om, hvorvidt UHRF1 øger blærekræft celle invasion af epigenetisk inaktivering af KiSS1.

I undersøgelsen, vi testede, om UHRF1 /KiSS1 repræsenterer en ny vej regulerer blærekræft celle invasion. Vores resultater viste, at UHRF1 udtryk er opreguleret i primære tumorer, der efterfølgende metastaseret, og overekspression af UHRF1 fremmer blærekræft celle invasion af epigenetisk inaktivering af KiSS1.

Materialer og metoder

Kliniske prøver og cellelinier

Humane blære væv blev opnået med skriftligt informeret samtykke fra Beijing Friendship Hospital tilknyttet Capital Medical University. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Capital Medical University. 47 prøver (tabel 1) af patologisk og normalt diagnosticerede biopsiprøver (≥ 3 cm fra blæren cancervæv) blev opsamlet fra patienter med blærecancer, herunder 22 med ikke-muskel-invasiv [NMI, stadium PTA-PT1] og 25 med muskel-invasiv [MI, stage ≥T2] .Human blære cancerceller blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og blev opretholdt i RPMI 1640 med 10% FBS (GIBCO, Carlsbad, CA).

Real-time kvantitativ PCR

Total RNA fra blære cancer cellelinjer og prøver blev ekstraheret ved anvendelse Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). RT (revers-transkription) reaktionen blev udført under anvendelse af en M-MLV revers transkriptase-kit (Invitrogen). Real-time kvantitativ PCR blev udført ved hjælp af en standard SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) protokol om StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems) i overensstemmelse med anvisningerne fra den respektive producent. p-actin blev anvendt som intern kontrol for mRNA. Respektive ACt-værdier (både UHRF1 og KiSS1) blev opnået ved normalisering til p-actin. Relativ ekspression blev beregnet med hensyn til kontrollen. Resultaterne blev udtrykt som 2

-ΔΔCt. *

s

. 0,05

Overekspression og Lille interfererende RNA

For at overekspression UHRF1, plasmid pcDNA-UHRF1 blev konstrueret ved at indføre en

HindIII-EcoRI

fragment indeholdende UHRF1 cDNA ind i de samme steder i pcDNA3.1. Den UHRF1 genet blev amplificeret ved PCR under anvendelse af forward og reverse primere: cccaagcttgggATGTGGATCCAGGTTCGGACCATGGACGGG og ggaattccTCACCGGCCATTGCCGTAGCCGGGGAAG. pcDNA-UHRF1 blev transficeret i blærekræft cellelinjer ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

For at hæmme endogene UHRF1 og KiSS1 udtryk, blære cancerceller blev transficeret med 30 nM anførte angivet siRNA eller negativ kontrol ved hjælp af lipofectamin 2000. UHRF1-siRNA’er (referencesekvens, sc-76805) blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Den KiSS1-siRNA’er (henvisning sekvens, sc-37443) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology.

Transwell invasion assay

Cell invasion blev undersøgt ved hjælp af Transwell invasion assay med indsatse af 8-um porestørrelse (Corning Costar) som tidligere [16] beskrevne. Kort fortalt blev blære cancerceller (RT4 eller T24) suspenderet i serumfrit medium, og derefter podet på Matrigelcoatede Transwell filtre i BioCoat Matrigel invasion kamre. Den serumholdigt medium blev anvendt som en kemo-tiltrækningsstof i det nedre kammer. Blærekræft celler blev behandlet med angivne reagenser i 72 timer og derefter celler, som ikke invaderer gennem porerne blev elimineret ved at anvende en vatpind. Celler på den nedre overflade af membranen blev farvet med krystalviolet. De celletal blev bestemt ved at tælle de gennemtrængende celler under et mikroskop ved 200 × forstørrelse i tilfældige områder i hver brønd.

Methylering Analyse af

KiSS1

En søgning efter berigelse af CpG i KiSS1 blev udført og bisulfit sekventering primere blev designet ved hjælp af CpG Island Searcher online værktøj (MethPrimer, https://www.urogene.org/methprimer/). De fremadrettede primere er GATGGAAGGGGAATAGTTTTATTAGA, og reverse primere er TACAACTAAAACTCCTTCCACCTAC [12].

Genomisk DNA blev fremstillet fra blære cancerceller ved anvendelse af Qiamp DNA blod Mini kit, og derefter det genomiske DNA blev bisulfit modificerede hjælp EZ DNA-methylering -guld Kit fra Zymo forskning [17]. PCR-produkterne blev klonet ind PMD-18T (Takara) ifølge producentens instruktioner. 9 positive kloner blev sekventeret. Dataene blev analyseret ved anvendelse af BiQ analysatoren software [17].

Statistical Analysis

Data er udtrykt som middelværdi ± SD (standardafvigelse) fra mindst tre separate forsøg. Forskellene mellem grupperne blev analyseret ved hjælp af Students

t

test. Forskellen blev anset statistisk signifikant på

s

. 0,05

Resultater

UHRF1 niveau opreguleres i metastatisk blære urothelial karcinom

UHRF1 resultater i unormal DNA-methylering og cancer metastase, og UHRF1 ekspression er korreleret med en dårlig prognose i flere kræftformer. For at vurdere, om UHRF1 regulerer blærekræft metastase, vi først undersøgt UHRF1 udtryk i blære cancer cellelinjer og kræft væv. Figur 1A viste, at ekspressionsniveauer af UHRF1 er signifikant opreguleret i de fleste blærekræft væv sammenlignet med tilstødende normale kontroller. UHRF1 er bemærkelsesværdigt forøget ekspression i 77% (36/47) af blærekræft væv (figur 1A). Når de 47 tumorvæv blev stratificeret baseret på klinisk progression, er UHRF1 udtryk steget betydeligt i primære tumorer, der efterfølgende metastaseret sammenlignet med ikke-metastatiske tumorer (Figur 1B). Derefter analyseret vi ekspressionsniveauerne af UHRF1 i begge invasive blære cancercellelinier og noninvasive blære cancercellelinjer. Blandt de tre invasive cellelinjer (253J, T24 og KU7) de UHRF1 niveauer er relativt højere end i de invasive dem (figur 1C). Disse data antyder, at UHRF1 overexpressoin kan være relateret til blærekræft metastase.

(A) Den kvantitative analyse af UHRF1 ekspressionsniveauet blev udført i blærekræft væv (n = 47) og tilstødende normalt væv. Totalt RNA blev ekstraheret og underkastet realtids-PCR til at analysere ekspressionen af ​​UHRF1 i hver prøve. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Den relative UHRF1 blev beregnet ved 2

-ΔΔCt hvor ACt = Ct (UHRF1) – Ct (β-actin) og ΔΔCt = ACt (tumorvæv) – ACt (tilgrænsende normalt væv). (B) Den blære kræft prøver blev inddelt i to grupper baseret på den kliniske udvikling. De UHRF1 niveauer i metastaser (n = 25) var højere end i no-metastaser (n = 22). *

s

0,05. (C) UHRF1 ekspressionsniveau blev analyseret ved real-time PCR i tre noninvasive og tre invasive blære cancercellelinjer. Normale urothelial celler blev anvendt som kontrol. *

s

. 0,05

opreguleret UHRF1 øger invasion blærekræft celle

in vitro

For at undersøge den rolle, UHRF1 i regulering celle invasion blev blærekræft cellelinjer behandlet med UHRF1-siRNA eller pcDNA-UHRF1 analyseret. Vi først demonstreret hvorvidt RT4 og T24 celler kan anvendes som

in vitro

model til at undersøge UHRF1 ved at analysere dets ekspression i RT4 eller T24-celler efter overekspression eller knockdown af UHRF1. Figur 2A og C viste, at pcDNA-UHRF1 behandling øger UHRF1 niveauer i ikke-invasive RT4 celler, hvorimod UHRF1-siRNA behandling nedsætter UHRF1 udtryk i invasive T24 celler. Endvidere opregulering af UHRF1 fremmer RT4 celleinvasion (figur 2B), hvorimod siRNA-medieret UHRF1 nedregulering inhiberer T24 celleinvasion (figur 2D). Disse resultater viste, at UHRF1 positivt regulerer blærekræft celleinvasion.

(A) RT4 celler blev behandlet med pcDNA-UHRF1, og det relative UHRF1 blev analyseret ved realtime PCR. *

s

0,05. (B) UHRF1 blev overudtrykt i RT4 celler og invasion assay blev udført som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Repræsentative tal fra de enkelte forsøg er vist. Disse resultater viser data fra fem uafhængige forsøg, udtrykkes som gennemsnit ± SD. *

s

0,05. (C) T24-celler blev behandlet med UHRF1-siRNA, og det relative UHRF1 blev analyseret ved realtime PCR. *

s

0,05. (D) Invasion assay blev udført efter UHRF1 knockdown. Repræsentative tal fra de enkelte forsøg er vist. Disse resultater viser data fra fem uafhængige forsøg, udtrykkes som gennemsnit ± SD. *

s

. 0,05

UHRF1 øger methylering af CpG nukleotider og reducerer ekspressionen af ​​KiSS1

Tidligere undersøgelser viste, at KiSS1 hyppigt hypermethyleret i blæren cancer og er korreleret med kræft progression [12]. Her undersøgte vi, om UHRF1 regulerer blærekræft celle invasion af epigenetisk inaktivering af KiSS1. Vi først analyseres, om UHRF1 regulerer KiSS1 udtryk. Som vist i figur 3A og B, tvunget udtryk for UHRF1 hæmmer KiSS1 udtryk, mens knockdown af UHRF1 øger KiSS1 udtryk. Vi derefter analyseret ekspressionsniveauet af UHRF1 og KiSS1 i både invasive blære cancercellelinier og noninvasive blære cancercellelinjer. Figur 3C viste, at UHRF1 niveauer er relativt højere med samtidige lave niveauer af KiSS1 i invasive cellelinier. En signifikant negativ korrelation er også observeret mellem UHRF1 mRNA niveauer og KiSS1 mRNA niveauer

in vivo

(

r

2 = 0,0648,

s

= 0,0063, figur 3D). Vi yderligere undersøgt, om UHRF1 hæmmer KiSS1 udtryk ved at øge methylering af CpG nukleotider i

KiSS1

. Vi analyserede status for methylering af CpG-øer i KiSS1 af bisulfit sekventering, som tidligere rapporteret [12], [15]. De methylering analyseresultater for

KiSS1

gen i 14 blærekræft væv og tilstødende normale kontroller er opsummeret i figur 4A. Bisulfit sekventering afslørede, at

KiSS1

methylering frekvens er markant forøget i blæren cancervæv sammenlignet med tilstødende kontroller (figur 4A). Korrelation analyse viste, at

KiSS1

methylering niveau er positivt korreleret med UHRF1 udtryk i både blærekræft og normale blære væv (figur 4B, p = 0,0036, R

2 = 0,2091). Bisulfit sekventeringsanalyse viste yderligere, at UHRF1 overekspression øger methylering af CpG nucleotider af

KiSS1

(figur 4C, D). Disse resultater antyder, at UHRF1 undertrykker KiSS1 ekspression ved epigenetisk inaktivering af KiSS1.

(A og B) KiSS1 ekspressionsniveau blev analyseret i RT4 celler overudtrykkes med UHRF1 eller T24 celler behandlet med UHRF1-siRNA. *

s

0,05. (C) UHRF1 og KiSS1 niveauer blev analyseret ved real-time PCR i tre noninvasive og tre invasive blære cancercellelinier. Normale urothelial celler blev anvendt som kontrol. *

s

0,05. (D) negativ sammenhæng mellem UHRF1 mRNA niveauer og KiSS1 niveauer i 24 blærekræft prøver (

r

2 = 0,0648,

s

= 0,0063).

(A) methylering analyse af

KiSS1

gen i 14 blærekræft væv og tilstødende normale prøver. BSQ analyse viste, at

KiSS1

methylering frekvensen markant forøget med prøver blærekræft. ** P 0,01. observeres (B) En positiv korrelation mellem

KiSS1

methylering og UHRF1 udtryk (R

2 = 0,2091, p = 0,0036). (C og D) CpG ø metylering status KiSS1 blev analyseret ved bisulfit sekventering i RT4 celler. Ni individuelle kloner blev vist pr cellelinie. CpG-dinukleotider var repræsenteret mørke firkanter for methylerede cytosiner og åbne pladser til umethylerede cytosiner.

UHRF1 øger blærekræft celle invasion ved at hæmme KiSS1

UHRF1 falder KiSS1 udtryk ved at øge methylering af CpG nukleotider af

KiSS

og nedregulering af KiSS1 fremmer blærekræft celle invasion. vi spekulerede derfor, at den rolle UHRF1 i reguleringen celleinvasion delvist medieres af KiSS1. Vi først analyseres, om KiSS1 hæmning øger blærekræft celle invasion. Som vist i figur 5A og B, knockdown af KiSS1 fremmer RT4 celleinvasion. Mere vigtigt, KiSS1 overekspression dels hæmmer UHRF1-fremkaldende RT4 celleinvasion (figur 5C og D). Disse resultater bekræfter, at UHRF1 fremmer blærekræft celleinvasion, i det mindste delvist, ved epigenetisk inaktivering af KiSS1.

(A og B) RT4 celler blev behandlet med KiSS1-siRNA og invasion assay blev udført efter KiSS1 knockdown. Repræsentative tal fra de enkelte forsøg er vist. Disse resultater viser data fra fem uafhængige forsøg, udtrykkes som gennemsnit ± SD. *

s

0,05. (C og D) RT4 celler blev overudtrykt med UHRF1 eller UHRF1 plus KiSS1, og invasion assay blev udført. *

s

. 0,05

Diskussion

Hos pattedyr, DNA methylering sker ved C5 position cytosin i forbindelse med CpG-dinukleotider, hvilket resulterer i fem -methylcytosine (5mC) [18]. Modifikationen af ​​genomisk DNA ved methylering er et vigtigt epigenetisk signal, og ændringer i mønstret af DNA-methylering har været gennemgående fund i forskellige tumortyper [19]. Nylige undersøgelser viste, at epigenetisk nedarvning af DNA-methylering kræver UHRF1, som rekrutterer DNMT1 til DNA replikationsgafler gennem en unik hemimethyleret CpG-bindende aktivitet [20]. Liu

et al

rapporterede, at UHRF1 rekrutterer DNMT1 for DNA vedligeholdelse methylering gennem binding enten hemi-methylerede CpG eller H3K9me2 /3, og at tilstedeværelsen af ​​både bindingsaktiviteter sikrer high fidelity DNA vedligeholdelse methylering [20].

UHRF1 overekspression er forbundet med tumor etaper og forudser dårlige prognoser i forskellige kræftformer [21]. UHRF1 koordinater PPARG (peroxisomproliferatoraktiveret receptor γ) epigenetisk inaktivering og medierer kolorektal cancer progression [22]. Knockdown af UHRF1 fremkalder PPARG genaktivering, ledsaget af positive histon mærker og DNA demethylering, underbyggende sin rolle i PPARG lyddæmpning. Babbio

et al

viste, at UHRF1 bidrager til epigenetisk gendæmpning i prostatakræft progression [23]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at ekspressionsniveauerne af UHRF1 er steget betydeligt i de fleste blærekræft væv sammenlignet med tilstødende normale kontroller. Desuden er UHRF1 udtryk steget betydeligt i primære tumorer, der efterfølgende metastaseret sammenlignet med ikke-metastatiske tumorer. Vi fandt også, at UHRF1 niveauer er relativt højere i invasive blærekræft cellelinjer end dem i de noninvasive dem. Endvidere opreguleres UHRF1 fremmer noninvasiv RT4 celle invasion, mens knockdown af UHRF1 hæmmer invasiv T24 celle invasion. Disse data viste, at opregulering af UHRF1 bidrager til blærekræft celleinvasion.

KiSS1 er en tumormetastase suppressor gen i flere kræftformer. KiSS1 udtryk markant nedsat i invasive blæretumorer sammenlignet med deres respektive normal urothelium [24]. Lavere KiSS1 niveau er korreleret med den samlede overlevelse i blæretumorer [24]. KiSS1 væsentligt methyleret. Inaktivering af KiSS1 ved promotor methylering er en sjælden begivenhed i bugspytkirtlen ductal adenocarcinom (PDAC) [25]. KiSS1 også epigenetisk ændret i kolorektal cancer, og KiSS1 methylering er forbundet med tumor kvalitet, forudsagt gentagelse og samlet overlevelse [15]. Her fandt vi, at UHRF1 negativt regulerer KiSS1 udtryk. UHRF1 niveauer er relativt højere med samtidige lave niveauer af KiSS1 i invasiv blærekræft cellelinjer. En signifikant negativ korrelation er også observeret mellem UHRF1 mRNA-niveauer og KiSS1 mRNA niveauer på

in vivo

. Bisulfit sekventering analyse viste, at UHRF1 hæmmer KiSS1 udtryk af stigninger methylering af CpG nukleotider i

KiSS1

. Mere vigtigt, KiSS1 overekspression dels hæmmer RT4 celle invasion i UHRF1-overekspression celler.

Konklusion

Vores data viser, at opreguleret UHRF1 bidrager til blærekræft celle invasion af epigenetisk inaktivering af KiSS1.