PLoS ONE: Apoptotisk død prostatacancerceller af en Gonadotropin Releasing Hormone-II Antagonist

Abstrakt

gonadotropin-releasing hormon-I (GnRH-I) har vakt stærk opmærksomhed som en hormonel terapeutisk værktøj, især for androgen-afhængige patienter med prostatacancer. Imidlertid har androgen-uafhængighed af kræft i fremskredne stadier ansporet forskerne til at søge nye medicinske behandlinger. I tidligere beretninger udviklede vi GnRH-II antagonist Trp-1 til at inhibere proliferation og stimulere autophagic død forskellige prostatacancerceller, herunder androgen-uafhængige celler. Vi screenede yderligere mange GnRH-II-antagonister til at identificere molekyler med højere effektivitet. Her, undersøgte vi virkningen af ​​SN09-2 på væksten af ​​PC3 prostatacancerceller. SN09-2 reducerede væksten af ​​prostatacancerceller men havde ingen virkning på celler afledt fra andre væv. Sammenlignet med Trp-1, SN09-2 påfaldende inhiberede prostatacancer cellevækst, selv ved lave koncentrationer. SN09-2-induceret PC3 cellevækstinhibering blev forbundet med nedsat membranpotentialet i mitokondrier hvor antagonisten blev akkumuleret, og forøget mitokondriel og cytosoliske reaktive oxygenarter. SN09-2 induceret lactatdehydrogenase frigivelse i medier og annexin V-farvning på PC3 celleoverfladen, hvilket antyder, at antagonisten stimuleret prostatacancer celledød ved at aktivere apoptotiske signalveje. Endvidere cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier til cytosolen og caspase-3-aktivering forekom i en koncentrations- og tidsafhængig måde. SN09-2 inhiberede også væksten af ​​PC3-celler xenotransplanted i nøgne mus. Disse resultater viser, at SN09-2 direkte inducerer mitokondriel dysfunktion og den deraf følgende ROS-generering, hvilket fører til ikke kun vækstinhibering men også apoptose af prostatacancerceller

Henvisning: Park S, Han JM, Cheon J, Hwang JI. , Seong JY (2014) Apoptotisk død prostatacancerceller af en gonadotropin Releasing Hormone-II antagonist. PLoS ONE 9 (6): e99723. doi: 10,1371 /journal.pone.0099723

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Februar 6, 2014 Accepteret: 18. maj 2014 Udgivet: 13 juni 2014

Copyright: © 2014 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Basic Research Program (2013R1A2A2A01068295) af National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT, og fremtidig planlægning og National R Velfærd (0.520.270 til 1). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er den mest almindelige malignitet, der opstår i den mandlige reproduktive system. Selv om de fleste prostatakræft er langsomt voksende, kan de forårsage smerte og besvær med vandladning, og de mere aggressive dem sandsynligvis metastaserer til andre dele af kroppen [1]. Globalt, prostatakræft er den sjette hyppigste årsag til kræft dødsfald hos mænd [2], og i USA, er det andenplads [3]. En fælles behandling af fremskreden prostatacancer er hormonterapi kombineret med strålebehandling [4]. Det vigtigste mål for hormonbehandling er at fjerne eller reducere serum androgen, en potentiel vækst stimulerende for prostatakræft. Men i mange tilfælde er det oprindelige regression af tumorerne, efterfulgt af genvækst uafhængig af androgen niveauer, øget aggressivitet, og høj metastatisk aktivitet [5]. Derfor er udviklingen af ​​effektive lægemidler til behandling af androgen-uafhængig prostatacancer er et presserende problem.

I hypothalamus-hypofyse-gonade-aksen, gonadotropin-frigivende hormon-I (GnRH-I) syntetiseret i hypothalamus stimulerer sekretionen af ​​hypofysegonadotropiner luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH), som igen modulerer syntese og sekretion af androgener, herunder testosteron, fra testiklerne [6]. Kronisk administration af en GnRH-I-agonist ført til nedregulering af GnRH-receptoren i hypofysen, hvilket resulterer i en markant reduktion i cirkulerende androgen niveauer [7]. GnRH-I-antagonister også reduceret serum androgen niveauer ved at inaktivere GnRH-receptoren [6], [8]. Disse resultater antyder, at hormonbehandlinger vha GnRH-I agonister og antagonister er anvendelige til behandling af godartet prostatahyperplasi og androgenafhængige prostatakræft. Endvidere har nylige undersøgelser vist, at GnRH-I direkte påvirker både androgen-afhængige og androgen-uafhængige prostatacancerceller. GnRH-I agonister inhiberede epidermal vækstfaktor- eller insulin vækstfaktorstimulerede prostatacancer celleproliferation, og inducerede apoptose af cancercellerne under forhold med serum deprivation [9], [10]. Disse virkninger blev foreslået at være medieret af GnRH-I-receptoren, som stimulerer G

i-bundet signalering-afhængig aktivering af apoptose-relaterede proteiner, herunder c-Jun NH

2-terminale kinase (JNK) [11 ]

i de fleste hvirveldyr, den anden type af GnRH, kaldet GnRH-II, er identificeret, som er strukturelt konserveret i evolutionen fra fisk til pattedyr [12] -. [14]. GnRH-II udtrykkes ikke blot i hjernen men også i perifere reproduktive og immune væv [15]. Denne brede ekspressionsmønster kan give en række fysiologiske funktioner på peptidet. Svarende til GnRH-I, GnRH-II er i stand til at regulere reproduktion hos hunner ved at stimulere sekretionen af ​​LH og FSH [16], [17]. Selv om begge GnRHs virke på humane granulosaceller-luteal celler, de udviser forskellige hormonelle regulering mønstre [18], [19]. GnRH-II produceres af humane T-celler stimulerer laminin receptorekspression og cellemigration [20]. Interessant, GnRH-II-induceret laminin receptor ekspression ikke blokeres af GnRH-I-antagonist cetrorelix, hvilket indebærer, at GnRH-II ikke interagerer med GnRH-I receptoren [20]. For nylig har vi og andre grupper identificeret GnRH-II-receptoren i ikke-pattedyr. Receptoren bindes til GnRH-II med højere følsomhed og affinitet end til GnRH-I [21], [22]. Endvidere blev en GnRH-II-specifikke receptor klonet fra abe og betegnes mammal GnRH-II receptor [23]. Receptoren er stærkt selektiv for GnRH-II og synes at være forskellig fra den GnRH-I receptoren med hensyn til hurtig internalisering upon ligand-interaktion og signalveje. I human, er GnRH-II receptor-lignende gener lokaliseret i kromosom 1 og 14. Selv mRNA’er for disse gener udtrykkes i mange væv, herunder hjernen og endda i mange cellelinjer, de synes at være ikke-funktionelle pseudogener skyldes en tidlig stopkodon [24], [25]. Fraværet af et funktionelt G-protein-koblede receptorer for GnRH-II i humant antyder muligheden af ​​andre typer bindingspartnere på plasmamembranen, mens dens funktionelle mediatorer forbliver stadig ukendt.

Interessant GnRH-II udviser den evne til at inhibere proliferation af ovariecancerceller samt prostatacancerceller [26], [27]. GnRH-II forventes at fungere på prostatacancerceller ved at interagere med ukendte proteiner, baseret på vores tidligere observation, at radioaktivt mærket GnRH-II blev i stand til at binde forskellige menneskelige prostata cancerceller [27]. Denne binding blev fortrængt af ikke-mærket GnRH-II, men ikke af GnRH-I. Dette resultat indebærer, at GnRH-II kan være et potentielt lægemiddel til behandling af prostatakræft, selvom højaffinitetsbinding af GnRH-II til prostatacancerceller tilsyneladende ikke skyldes ekspressionen af ​​en konventionel GnRH-II-receptor. For nylig har vi udviklet en ny GnRH-II antagonist, kaldet trptorelix-1 (Trp-1). Trp-1 er i stand til at inducere død af androgen-afhængige og -uafhængige prostatacancerceller af underliggende mekanismer såsom mitokondriel dysfunktion efterfulgt af reaktive oxygenarter (ROS) og autofagi [28].

Vi syntetiserede yderligere GnRH -II antagonister sammenlignes med den Trp-1 virkning og forbedre død virkning. Her præsenteres en anden antagonist, SN09-2 der er i stand til at inhibere proliferation og inducere død i humane prostatacancerceller med en højere effektivitet end den for Trp-1. Endvidere er de funktionelle mekanismer ved dødsfaldet er forskellige formular Trp-1 og involverer aktivering af apoptotiske veje.

Materialer og metoder

GnRH-II analoger og reagenser

GnRH-II antagonist [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4CL) -D-Pal (3) -Ser-Phe-D-Lys-Trp-Tyr-Arg-D-Ala-NH

2], betegnet som SN09-2, og dets fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret formular blev syntetiseret ved AnyGen (Gawngju, Korea). Trp-1 [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4CL) -D-Pal (3) -Ser-Tyr-D-Cit-Trp-Tyr-Pro-D-Ala-NH

2 ] blev også syntetiseret af samme selskab [28].

den mitokondrielle membranpotentiale detektor 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid (JC 1), MitoTracker, og 2 ‘, blev 7’-dichlorfluorescein-diacetat (DCF-DA) købt hos Invitrogen (Palo Alto, CA, USA). Celledyrkningsmedier, herunder Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) blev opnået fra Welgene Inc. (Daegu, Korea). Føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin var fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Alle reagenser herunder Hoechst 33342, Annexin-V, H

2O

2, og bovint serumalbumin blev fremskaffet fra Sigma (St. Louis, MO), medmindre andet er angivet. Antistoffer mod spaltet caspase-3, intakt caspase-3, og cytochrom C blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danver, MA, USA). Anti-p-actin-antistoffer var fra Sigma.

Cellekultur

Alle cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PC3, LNCaP, DU145, og DLD1 cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS, 100 enheder penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og befugtet 5% CO

2. HeLa-celler blev dyrket i DMEM indeholdende 10% FBS under de samme betingelser.

reportergenassay

CV-1-celler var kultur natten over i 24-brønds plader og efterfølgende transficeret med liposom kompleks indeholdende pGL3 /SRE-luc plasmider med noget frog GnRHR-II (bfGnRHR-II) eller grøn abe GnRHR-II (gmGnRHR-II). Yderligere 48 timer senere blev celler behandlet med GnRH-II (1 nM for bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II) og forskellige koncentrationer af SN09-2 eller Trp-1 i 6 timer vasket med PBS og solubiliseret med lysisbuffer. Luciferaseaktivitet af celleekstrakter blev bestemt ved anvendelse af standard luciferase assay system fra BioTek Instrument, Inc. (Winooski, VT). For at bestemme transfektionseffektiviteten blev luciferaseaktiviteter normaliseret til β-gal-aktivitet. Alle data er beregnet ud fra mindst tre uafhængige forsøg normaliseret til ubehandlede grupper.

Cell levedygtighed assay

Celler blev podet i 12-brønds plader i tre eksemplarer (1 × 10

4 celler /godt). Efter 24 timer blev celler behandlet med de angivne koncentrationer af GnRH-II-antagonister solubiliseret i 0,1% DMSO hver 24 timer for det angivne antal dage. Derefter blev cellerne vasket med phosphatbufret saltvand (PBS), dissocieret med trypsin /EDTA og resuspenderet i 500 pi komplet vækstmedium. Trypanblåt (0,4%) farvestof-eksklusive celler blev talt under et omvendt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Lactatdehydrogenase frigivelsesassay

lactatdehydrogenase (LDH) -aktivitet blev udført ifølge til producentens instruktioner (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Kort fortalt blev PC3-celler podet i 12-brønds plader med 2 × 10

4 celler /brønd. Næste dag blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af SN09-2 i 5% FBS-holdigt RPMI 1640 i 3 dage. Dyrkningsmedierne blev overført til Eppendorf-rør og centrifugeret i 1 min ved 5000 rpm. Et hundrede mikroliter af hver supernatant blev overført til en optisk klar plade med 96 brønde. Et hundrede mikroliter frisk fremstillet reaktionsblanding blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 30 minutter ved 25 ° C. Absorbansen af ​​prøverne blev målt under anvendelse af 490-nm bølgelængde filter af ELISA-læser.

Annexin V-farvning-assay

apoptose af PC3-celler blev vurderet ved anvendelse af en apoptose afsløring kit (Koma Biotech, Seoul, Korea). Efter eksponering for SN09-2 for de angivne tidspunkter eller i forskellige koncentrationer, blev PC3-celler høstet og vasket med koldt PBS og resuspenderet i bindingsbuffer indeholdende fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret annexin V-protein og propidiumiodid. Annexin V binding og PI-farvning blev bestemt ved flow cytometrisk analyse (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Apoptotiske celler blev defineret som PI-negative og annexin V-positive.

Efter behandling med SN09-2 blev PC3 celler på poly-D-lysin-overtrukne dækglas fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, vasket med PBS tre gange og inkuberet med Cy3-konjugerede annexin V. Celler blev vasket med PBS og kort tid inkuberet med Heochst33342 (10 ug /ml). Farvede celler blev visualiseret under en LSM510 konfokal mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

Western blot-analyse

celler (5 × 10

4) blev forgyldt i 100-mm skåle . Den næste dag blev cellerne behandlet med de angivne koncentrationer af SN09-2 for forskellige tidspunkter, høstet og inkuberet med puffer indeholdende 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCI, 0,5 mM DTT, og protease inhibitor cocktail (Roche) i 30 minutter på is. Cellerne blev afbrudt med en Dounce homogenisator med 20 slag og centrifugeres ved 5.900 ×

g

10 minutter til opsamling af cytosol fraktion. De resulterende pellets blev resuspenderet i kold buffer, kortvarigt sonikeret tre gange, og centrifugeret ved 5.900 x

g

i 10 minutter til opnåelse af rå mitokondrielle proteiner. Proteiner af hver fraktion (20 ug) blev påført SDS-polyacrylamidgelelektroforese (12% gel) og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, MA). Membranerne blev blokeret med 3% bovint serumalbumin og inkuberet med de passende antistoffer. Efter vask med Tris-pufret saltvand indeholdende 0,05% Tween 20 blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og signalerne blev detekteret ved anvendelse af et forøget kemiluminescens-opløsning (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, UK).

subcellulære lokalisering af SN09-2

To dage efter udpladning på poly-D-lysin-overtrukne dækglas i 12-brønds plader blev PC3-celler behandlet med 66 nM MitoTracker i 30 minutter og derefter med 10 mM FITC- SN09-2 i 10 minutter ved 37 ° C. Efter vask med PBS blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 min. Kerner blev farvet med Hoechst 33342. Fluorescens signaler blev opdaget under konfokalmikroskop.

Måling af mitokondrie membranpotentiale

mitokondrie membran potentiale blev målt ved hjælp af JC-1. Hos raske celler, JC-1 danner aggregater inden mitokondrier, genererer rød fluorescens. Men under mitochondrial depolarisering, JC-1-monomerer diffundere gennem hele cellen, der producerer grøn fluorescens. PC3-celler blev podet på poly-D-lysin-overtrukne dækglas i 12-brønds plader. Efter behandling med 10 pM SN09-2 i 3 dage blev celler inkuberet med PBS indeholdende JC-1 (2,5 ug /ml) i 20 minutter ved stuetemperatur. Celler blev vasket, fikseret med 4% paraformaldehyd og observeret under konfokalt mikroskop. Efter inkubation med JC-1 blev PC3 celler adskilt fra fad og ansøgte om fluorescens-cellesortering (FACS) analyse.

Perler konjugation og pull-down assay

Perler konjugation af SN09- 2 blev udført som beskrevet i tidligere papir [28]. Kort fortalt, N-hydroxysunninimide-aktiveret Sepharose perler blev inkuberet med SN09-2 i koblingsbuffer natten over ved 4 ° C og derefter vasket med en buffer indeholdende 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) og en puffer indeholdende 0,1 M acetat (pH 4,5) og 0,5 M NaCl. Membranfraktion af PC3-celler blev isoleret ved homogenisering og centrifugering. De resulterende pellets blev opløst i lysepuffer indeholdende 1% Triton-X 100 og centrifugeret ved 20.000 x

g

i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanter blev inkuberet med SN09-2-konjugeret sepharose og vasket med lyseringspuffer. Bundfaldet blev inkuberet med 50 pM SN09-2 og supernatanterne blev anvendt til SDS-PAGE og Western blotting med anti-GPR75 antistoffer.

Intracellulær ROS generation

Reaktive ilt arter (ROS) var målt ved hjælp af DCF-DA. PC3-celler (1 x 10

5) blev udpladet på 60 mm skåle, dyrket i 5% FBS RPMI, og behandlet med SN09-2 i 3 timer. Efter inkubering med 5 uM DCF-DA i 30 minutter ved 37 ° C i mørke, celler blev vasket, resuspenderet i PBS, og derefter anvendt på FACS-analyse.

Immuncytokemi

PC3 celler (4 x 10

4) blev udpladet på dækglas i 12 brønd plader og behandl med 10 pM SN09-2 i 12 timer. Cellerne blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter, permeabiliseret med 0,2% Triton-X i PBS, vasket og blokeret med 3% BSA i PBS i 30 min. Polyklonale kanin-antistoffer mod kløvet caspase-3 (1:200) og monoklonalt muse-anti-p-actin antistoffer (1:1000) blev påført cellerne. Aktiv caspase-3 og β-actin blev visualiseret ved inkubation med både Alexa 594-konjugeret anti-muse og Alexa 488-konjugeret anti-kanin-sekundære antistoffer i 1 time. Derefter blev cellerne farvet med Hoechst 33342 (1 ug /ml) i 5 minutter, monteret på objektglas og observeret under konfokalt mikroskop.

In vivo

vækst af prostatacancerceller

Seks uger gammel mand athymiske nøgne mus (BALB /c-nu) blev opnået fra Harlan (Houston, TX). Musene blev opstaldet under specifikke patogenfrie betingelser i en individuelt ventilerede bure system. Alle eksperimentelle procedurer blev udført efter godkendelse fra Institutional Animal Care og brug Udvalg for Klinisk Research Institute i Seoul National University Hospital. PC3-celler (6 x 10

6) blev injiceret i den højre flanke af musene. Ti dage efter celle injektion, tumorer med volumen på omkring 20-25 mm

3 er udviklet i de fleste mus; tumorvolumener blev målt hver dag. Tumorvolumener blev bestemt ved to vinkelrette dimensioner [længde (

L

) og bredde (

W

)] og højden (

H

), målt ved hjælp af Vernier skydelære (den formel er

V

= (π /6) × (

W

×

L

×

H

). Fra denne tid, SN09-2 ( eddikesyre form) opløst i 5% N, N-dimethylacetamid (DMA), 10% glycerol og 85% destilleret vand, som er biokompatibel opløsningsmiddel blev subkutant injiceret i musene i 25 dage i træk. tumorstørrelsen i hver mus blev målt hver dag. Seks til syv mus blev anvendt for hver forsøgsgruppe.

Statistisk analyse

data blev analyseret under anvendelse PRISM4 software (GraphPad). gruppe midler blev sammenlignet ved anvendelse af Students

t

test eller envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligning A

P- Drømmeholdet værdi. . 0,05 blev accepteret som signifikant

Resultater

SN09-2 inducerer prostatakræft celle -specifik død

Vi har tidligere rapporteret, at en hidtil ukendt GnRH-II antagonist Trp-1-induceret prostatacancer celledød [28]. For at identificere en mere effektiv molekyle syntetiserede vi 65 analoger baseret på Trp-1 struktur og screenet deres død aktiviteter på PC3 og LNCaP uden nogen toksisk aktivitet på lunge fibroblast MRC-5. Endelig SN09-2 blev valgt som potentielt effektivt GnRH-II antagonist til inhibering prostatakræft cellevækst. I tidligere reporter identificerede vi Trp-1 har antagonistisk aktivitet på GnRHR-II [28]. Vores nuværende reportergenassay afslører, at SN09-2 har også en potent antagonistisk aktivitet på GnRHR-II også sammenlignet med Trp-1 (fig. 1). SN09-2 effektivt antagoniserede virkningen af ​​GnRH-II på noget frog GnRHR-II (IC

50 = 0,01 uM) og grøn abe GnRHR-II (IC

50 = 1,9 uM). Imidlertid, Trp-1 inhiberede aktivering af kun tyr frøen GnRHR-II med høj potens (IC

50 = 0,25 uM). Sekvenserne af GnRH-II, Trp-1 og SN09-2 blev beskrevet i fig. 2A. PC3 celler (androgen-uafhængige prostatacancerceller) blev behandlet med 10 pM SN09-2 i dyrkningsmedier indeholdende forskellige koncentrationer af FBS. I lave koncentrationer i serum (mindre end 2%) SN09-2 inducerede mere end 95% væksthæmning af PC3 celler inden for 4 dage. Og selv i højere serumkoncentrationer, SN09-2 dramatisk inhiberede cellevæksten med mere end 85%, selv om inhibering blev svagt påvirket af serumkoncentration (fig. 2B). Behandling med SN09-2 i 4 dage inducerede 91% og 88% vækstinhibering af PC3-celler i 5% og 10% serum betingelser, henholdsvis. Dette resultat indikerer, SN09-2 negativt regulerer prostatakræft cellevækst i et serum-uafhængig måde. Dernæst blev forskellige cancerceller behandlet med 10 pM SN09-2 i 5% serum-holdige medier til bestemmelse af prostatacancer celle-specifik virkning af GnRH-II-antagonist. Tre dage efter behandling med SN09-2 blev væksten af ​​PC3 og LNCaP-celler drastisk nedreguleret, og af DU145 celler blev også inhiberet af ≈50%, hvilket antyder, at følsomheden af ​​prostatacancerceller til SN09-2 kan være forskellige. Imidlertid blev væksten af ​​celler fra andre væv, såsom HeLa (livmoderhalskræft) og DLD1 (tyktarmskræft) ikke påvirket af SN09-2 (fig. 2C). Selvom flere celler skal testes, kan disse resultater viser SN09-2 har prostatacancer cellespecifik væksthæmmende virkning.

Enten bfGnRHR-II eller gmGnRHR-II blev transficeret med SRE-luc reporter i CV-1-celler . Celler blev behandlet med antagonisterne ifølge forskellig koncentration i nærværelse af GnRH-II (1 nM for bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II).

(A) Molecular sekvenser af GnRH-II, Trp-1, og SN09-2 (B) PC3-celler blev inkuberet i RPMI-medium indeholdende forskellige koncentrationer af FBS og udsat for 10 uM SN09-2 i 4 dage. Antallet af levedygtige celler blev talt under et lysmikroskop. (C) PC3, blev DU145, LNCaP, HeLa, og DLD1 celler inkuberet med 5% FBS medier indeholdende 10 mM SN09-2 eller DMSO i 3 dage. (D) PC3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af Trp-1 eller SN09-2 i 3 dage, og derefter levedygtige celler blev talt under lysmikroskop. Cellen antallet af hver gruppe blev sammenlignet med DMSO-behandlede gruppe. CTL: DMSO-behandlet. (E) PC3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af SN09-2 i 3 dage. Brug af kultursupernatanter fra hver gruppe blev LDH-aktivitet bestemmes som beskrevet i Materialer og Metoder. Data er middelværdier ± S.E. *,

s

0,05; **,

s.

0,01 versus kontrol

I en tidligere rapport, viste vi, at Trp-1 hæmmede spredning af PC3 celler [28]. For at undersøge vækstinhibering effektiviteten af ​​GnRH-II-antagonister, tilføjede vi dem til PC3 celler dyrket i 5% serum betingelse i 3 dage. I sammenligning med kontrolgrupper, begge antagonister svækkede signifikant cellevæksten på en dosis-afhængig måde. Endvidere i alle grupper behandlet med forskellige koncentrationer, blev cellevæksten mere potent inhiberet af SN09-2 snarere end Trp-1, hvilket antyder, at SN09-2 sandsynligvis er bedre molekyle til udvikling som en prostatakræft-inhibitor (fig. 2D). Den inhiberende virkning på cellevækst kan korreleres med celledød. For at bekræfte ideen målte vi LDH-aktivitet fra celledyrkningsmedier behandlet med forskellige doser af SN09-2. Som vist i fig. 1E, aktiviteten blev forøget i alle SN09-2-behandlede celler. Dette resultat antyder, at SN09-2 er i stand til at stimulere prostata cancer celler ihjel, selv i små mængder. Selvom en høj dosis af SN09-2 let øget LDH-aktivitet, blev aktiviteten ikke svarede til dosis af agonisten, hvilket indebærer, at dette assay synes at være for følsom til at skelne dosisafhængig aktivitet på celledød.

Mitokondriel ophobning af SN09-2

i tidligere rapporter, vi og andre grupper observeret, at radioaktivt mærkede GnRH-II bundet til prostata kræftceller gennem interaktion med en cirka 80-kDa protein, hvis identitet blev betegnet som glucose-reguleret protein 75 (Grp75) baseret på væskekromatografi-elektrosprayionisering-tandem-massespektrometri [11], [28], [29]. Interessant vores pull-down assay viste også, at SN09-2 direkte interageret med Grp75 (fig. 3A). Da Grp75 findes overvejende mitokondrier, kan det endelige bestemmelsessted for SN09-2 ikke være celleoverfladen. At udforske den subcellulære lokalisering af antagonisten, vi mærkede SN09-2 med FITC og tilføjet det til PC3-celler ved en 1 uM koncentration i 10 minutter. FITC-SN09-2 signal blev ikke set på plasmamembranen men omkring kernen. Ved behandling med MitoTracker farvestof, FITC signal overlappede med den for farvestoffet, hvilket indikerer, at FITC-SN09-2 kan ophobes i mitokondrierne (fig. 3B). FITC-SN09-2 var næppe detekterbar i andre cellelinjer, såsom HeLa, MCF7, og DLD1 (data ikke vist). Mitokondrie akkumulering af dette konjugat er ganske ligner den i FITC-konjugeret GnRH-II og Trp-1, som blev svækket ved umærket GnRH-II. Dette resultat indebærer, at en ukendt endocytosis vej for GnRH-II og dens antagonister kan eksistere i prostatacancerceller. Salg

Celler blev inkuberet med FITC-konjugeret SN09-2 og MitoTracker. Efter vask blev cellerne kortvarigt mærket med Hoechst33342 (for nucleus farvning). Billederne blev taget under en konfokal mikroskop. Rød: MitoTracker, Grøn: FITC-SN09-2, Blå: Hoechst33342

Mitokondriel skader og ROS induktion i SN09-2-behandlede celler

Mitokondriel dysfunktion menes at være direkte relateret til celledød [30]. Mitokondrie målretning af SN09-2 kan være knyttet til døden virkning på prostatacancerceller gennem dysfunktion af organel. Vi undersøgte det elektriske potentiale ændring i den mitokondriske membran, hvilket indikerer mitokondriefunktion. Som vist i fig. 4A, 3-dages behandling af PC3-celler med SN09-2 nedsat antal røde fluorescensintensitet omkring kernen, men steg gul og grøn fluorescens med mere end 80% i cytoplasmaet, hvilket indikerer et fald i den mitokondriske membranpotentiale (Fig. 4B). I mange tilfælde, mitokondriel dysfunktion er en forudsætning for dannelsen af ​​cytoplasmatisk ROS. Når PC3 celler blev behandlet med 5 uM SN09-2, cytoplasmatiske ROS niveauer, målt ved fluorescensen af ​​fluoroprobe DCF-DA, blev forøget (fig. 4C). Selvom det geometriske gennemsnit af fluorescensen var meget lavere end den, der ses i H

2O

2-behandlede celler, værdien kan være nok til at indikere ændring af mitokondrisk funktion (fig. 4D). Desuden SN09-2 øgede cytoplasmatiske ROS niveauer i en dosisafhængig måde (fig. 4E).

(A) Efter behandling med 10 pM SN09-2 i 3 dage, PC3 celler på dækglas blev inkuberet med JC-1, fikseret med 4% paraformaldehyd, kortvarigt farvet med Hoechst33342 og observeret under konfokalt mikroskop. (B) SN09-2-behandlede PC3-celler blev løsnet fra skålen og påføres på FACS-analyse til at undersøge fluorescens farveændring. (C) PC3-celler behandlet med SN09-2 i 3 timer blev inkuberet med DCF-DA, og påført FACS-analyse (D) Positiv kontrol af intracellulær ROS. PC3-celler blev behandlet med H

2O

2 i 5 minutter, mærket med DCF-DA, og derefter anvendt på FACS-analyse. (E) geometriske middelværdier for fluorescenssignaler i PC3-celler behandlet med forskellige koncentrationer af SN09-2 vist grafisk. Data er middelværdier ± S.E. **,

s.

0,01 versus kontrol

SN09-2 inducerer celledød via aktivering af apoptotiske signalveje

Mitokondriel dysfunktion og den deraf følgende ROS generation kan gå forud for apoptose, en type af celledød. For at bestemme mekanismer underliggende celledød stimuleret af SN09-2 farvede vi PC3-celler med Cy3-konjugeret Annexin V, som specifikt binder til membran phosphatidylserin. PC3 celler behandlet med 10 pM SN09-2 i 24 timer blev grundigt farvet med Cy3-Annexin V, hvilket antyder, at cellerne undergår apoptotisk ændring (fig. 5A). Når celler blev påført på FACS-analyse efter farvning med FITC-konjugeret Annexin V og propidiumiodid, de fleste celler var FITC-positive, men PI-negative, hvilket indebærer, at SN09-2 stimuleret apoptotisk død, men ikke nekrotisk død. Annexin V farvning blev dramatisk forøget med 9 timer efter 10 uM SN09-2 behandling og vedvarende indtil 24 timer (fig. 5B). Under lave koncentrationer af SN09-2, få celler var FITC-positive, mens de fleste celler behandlet med høje koncentrationer (mere end 5 m) var FITC-positive, hvilket tyder på, at SN09-2 er en effektiv apoptose inducer for prostatakræft celler (Fig. 5C). Sammen med spredning resultat, den sjældne farvning af celler behandlet med mindre end 0,5 uM SN09-2 viser, at en lav dosis af antagonisten inhiberer cellevækst snarere end at stimulere celledød. Salg

(A) PC3-celler behandlet med 10 pM SN09-2 på dækglas blev inkuberet med Cy3-konjugeret annexin V, og kortvarigt farvet med Hoechst33342. Fluorescens billeder blev taget under et fluorescens mikroskop. BF: cellemorfologi under lysmikroskop (B, C) Annexin V-positive celler blev forøget på en dosis- og tidsafhængig måde (B) PC3 celler behandlet med SN09-2 blev høstet til forskellige tidspunkter, inkuberet med FITC-konjugeret annexin V, og påført FACS-analyse (C) PC3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af SN09-2 i 12 timer før annexin V farvning. Data er middelværdier ± S.E. *,

s

0,05; **,

s.

0,01 versus kontrol

Frigivelsen af ​​cytochrom c fra mitokondrier er en tidlig hændelse under caspase-afhængig celledød. Ved frigivelse af cytochrom c i cytoplasmaet, binder apoptotisk protease aktiverende faktor-1 og procaspase-9 til dannelse af apoptosome, som efterfølgende aktiverer caspase-3 og -7 ansvarlig for at ødelægge cellerne [31]. Western blot-analyse afslørede, at SN09-2 stimulerer cytochrom c-frigivelse i cytoplasmaet på en tids- og dosisafhængig måde. Den mest cytochrom c blev frigivet fra mitokondrier i celler behandlet med mere end 5 uM SN09-2 (fig. 6A, C), og cytosolisk mætning af proteinet blev opnået ved 24 timer efter behandling (fig. 6B, D).

(A-D) Western blotting af cytochrom c i den cytosoliske og mitokondriske fraktioner (A, C) PC3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af SN09-2 i 24 timer og fraktioneret i cytosol og mitochondrier. 20 ug lysater fra hver fraktion blev anvendt til SDS-PAGE og western blotting med anti-cytochrom C-antistoffer. (B, D) Celler behandlet med 10 pM SN09-2 blev høstet til forskellige tidspunkter, og derefter fraktioneret. (C, D) Signalet intensiteten af ​​hver blot blev målt og vist grafisk (E) PC3 celler behandlet med 10 pM SN09-2 blev høstet på forskellige tidspunkter, og anvendt til Western blotting med anti-caspase-3 eller et spaltet