Abstrakt
Den ekstraordinære biologiske mangfoldighed af tropiske skove rummer en rig kemiske diversitet med et enormt potentiale som en kilde til hidtil ukendte bioaktive forbindelser. Af særlig interesse er nye miljøer for mikrobiel opdagelse. Dovendyr – trælevende pattedyr almindeligvis findes i lavlandet skove Panama – bære en bred vifte af mikro- og makro-organismer på deres grove ydre hår. Her rapporterer vi for første gang isolering af forskelligartede og bioaktive stammer af svampe fra sloth hår, og deres taksonomiske placering. Firs-fire isolater af svampe blev opnået i kultur fra overfladen af hår, der blev indsamlet fra at leve tre-tåede dovendyr (
Bradypus variegatus
, Bradypodidae) i Soberania National Park, Republikken Panama. Fylogenetiske analyser afslørede en forskelligartet gruppe af Ascomycota tilhører 28 forskellige operationelle taksonomiske enheder (Otus), hvoraf flere er afvigende fra tidligere kendt taxa. Seventy-fire isolater blev dyrket i flydende bouillon og rå ekstrakter blev testet for bioaktivitet
in vitro
. Vi fandt en bred vifte af aktiviteter over for stammer af parasitter, der forårsager malaria (
Plasmodium falciparum
) og Chagas sygdom (
Trypanosoma cruzi
), og mod den humane brystcancer MCF-7 . Halvtreds fungale ekstrakter blev testet for antibakteriel aktivitet i et nyt antibiotikum profilskærm kaldet BioMAP; af disse, 20 var aktive mod mindst én bakteriestamme, og en havde et usædvanligt mønster af bioaktivitet mod Gram-negative bakterier, der antyder en potentielt ny virkningsmåde. Sammen vores resultater viser betydningen af at undersøge nye miljøer for bioaktive svampe, og demonstrere for første gang den taksonomiske sammensætning og bioaktivitet af svampe fra dovenskab hår
Henvisning:. Higginbotham S, Wong WR, Linington RG, Spadafora C , Iturrado L, Arnold AE (2014) Sloth Hår som en roman kilde til Svampe med kraftig anti-Parasit, Anti-Cancer og Anti-bakteriel Bioaktivitet. PLoS ONE 9 (1): e84549. doi: 10,1371 /journal.pone.0084549
Redaktør: Joy Sturtevant, Louisiana State University, USA
Modtaget: 31 juli 2013; Accepteret: November 15, 2013; Udgivet: 15 januar 2014
Copyright: © 2014 Higginbotham et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af International Cooperative Biodiversity grupper program (ICBG-Panama https://www.icbg.org/indrømme nummer 2 U01 TW006634-06) og College of Landbrug og Life Sciences ved University of Arizona. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
på trods af store stigninger i udgifter til international sundhedspleje i de sidste 20 år, smitsomme sygdomme udgør fortsat en enorm byrde for global sundhed [1]. Kroniske smitsomme sygdomme som malaria og forskelligartede oversete tropiske sygdomme (NTDS) påvirker millioner af mennesker hvert år, hovedsageligt kvinder og børn i udviklingslandene [2]. Den hurtige spredning af antibiotikaresistens er faldet arsenal til rådighed til at behandle mange infektionssygdomme, med seneste fremkomsten af pandrug modstand giver sygdomme, der er genstridige til behandling med en hvilken som helst kendt stof [3]. Sideløbende ikke-smitsomme sygdomme stiger i forekomsten i forhold til smitsomme sygdomme: i 2008 kræft var ansvarlig for cirka 7,8 mio dødsfald (ca. 13% af alle dødsfald på verdensplan [4])
Naturprodukter repræsenterer en af de. de fleste væsentlige kilder til nye lægemidler i dag. Ca. 50% af alle lægemidler indført mellem 1981 og 2006 var af naturligt produkt [5] oprindelse, med yderligere 34 naturprodukt-baserede lægemidler lanceret mellem 1997 og 2007 [6]. Siden opdagelsen af penicillin over 80 år siden, har svampe bidraget enormt til naturligt produkt lægemiddelopdagelse, hvilket giver en masse uvurderlige lægemidler herunder β-lactam-antibiotika, griseofulvin, cyclosporin, fusidinsyre, og lovastatin [7]. Men i de senere år hit-rate for bioaktivitet fra svampe er aftaget, muligvis peger på den forestående udtømning af ‘lavthængende frugter’ – de nemt og ofte adgang svampe såsom jord mikrosvampe -. Som kilder til nye bioaktive metabolitter
konservative vurderinger tyder på, at det samlede antal svampearter eksisteret overstiger 5 millioner, men færre end 100.000 svampearter er blevet beskrevet [8], [9]. Dette antyder, at udforske nye miljøer, der kan være hjem for ikke tidligere beskrevet svampe kan være yderst produktive. For eksempel har de seneste undersøgelse af tropiske svampeangreb endofytter beskrives tropiske blade som en “hotspot biodiversitet” [10], [11], [12], der har vist sig frugtbar som en kilde til nye bioaktive stoffer (se [13] for en gennemgang) .
Gloer [14] foreslået, at produktionen af sekundære metabolitter af svampe kan være påvirket af de selektive pres bibragt af andre organismer. Dette antyder, at miljøer, hvor mange forskellige arter findes i umiddelbar nærhed kan have særligt potentiale som kilder til bioaktive metabolitter. En sådan uudforsket miljø er svampens microbiome forbundet med den grove, svampelignende hår af de tre-tåede dovendyr (
Bradypus variegatus
), en trælevende pattedyr almindeligt forekommende i de lavtliggende tropiske skove i Mellemamerika.
pelsen af tre-tåede dovendyr består af to særskilte lag: et indre lag af fint, blødt hår tæt på huden, og et ydre lag af grove hår, som er ovale i tværsnit og er ca. 0,4 mm bred [ ,,,0],15]. Disse ydre hår bære tværgående revner, der er hjemsted for en tilsyneladende allestedsnærværende grøn alge, mest almindeligt af slægten
Trichophilus
[16]. Den alge er populært menes at give camouflage for dovendyr mod den plettede baggrund af deres levesteder, men dette er ikke blevet bekræftet med data. Suutari
et al.
[16] foreslog, at exopolymeric stoffer produceret af algen kan fremme væksten af gavnlige bakterier. Sloth hår er almindeligt hjem til cyanobakterier og kiselalger, samt en række makroorganismer (fx kakerlakker, rundorm, og møl larver; [16]). Men lidt om fællesskaber af svampe på dovenskab hår.
I et forsøg på at afdække nye kilder til lægemidler til behandling af vektorbårne sygdomme, kræft og bakterielle infektioner, brugte vi en kultur tilgang til at undersøge svampesamfund forbundet med den grove, ydre hår af
Bradypus variegatus
i Panama. Her rapporterer vi isolering af svampe med bioaktivitet mod
Trypanosoma cruzi
, den kausale agent Chagas sygdom;
Plasmodium falciparum
, den kausale agent for malaria; den humane brystcancer-cellelinie MCF-7; og en række Gram-negative og Gram-positive humane patogene bakterier. Fylogenetiske analyser blev anvendt til at identificere disse svampe på en finere og mere robust niveau end det er muligt ved hjælp af typiske database-matching metoder alene. Vores resultater tyder på, at sloth hår er en interessant ny kilde til vigtige bioaktive svampe med store muligheder for udforskning af de fem andre bevarede sloth arter, der findes på tværs Neotroperne.
Materialer og metoder
Godkendelse til prøveudtagning af dovenskab hår blev opnået fra Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Smithsonian Tropical Research Institute og indsamling tilladelser blev indhentet fra Panamas Autoridad Nacional del Ambiente (ANAM). En enkelt prøve af grove ydre hår blev indsamlet fra omkring lænden af hver af ni levende tre-tåede dovendyr stødt i februar 2011 sammen Pipeline Road i Soberania National Park, Republikken Panama (N 9 ° 9 ‘, W 79 ° 44’ [17]). Hårprøver blev anbragt i sterile Falcon-rør halvt fyldt med silicagel og opbevaret ved omgivelsernes temperatur indtil forarbejdningen.
Isolering og dyrkning af svampe
Hvert hår blev skyllet med sterilt vand for at fjerne snavs og løst associerede mikroorganismer. Under aseptiske betingelser hår blev skåret i stykker på ca. 2,5 cm lang og placeret på overfladen af kartoffeldextroseagar (PDA) eller 2% maltekstrakt agar (MEA) i sterile petriskåle. Pladerne blev forseglet med Parafilm, inkuberet ved stuetemperatur, og kontrolleres for nye svampevækst dagligt i 2 uger. Hyfer blev skåret aseptisk fra hver plade og overført til axenisk kultur på det samme medium. Isolater blev opbevaret som levende værdikuponer ved stuetemperatur (dvs. som agar stik med mycelium i sterilt destilleret vand) og er blevet arkiveret i indsamlingen af den internationale Biodiversity Group Cooperative (ICBG) på Smithsonian Tropical Research Institute i Panama (tiltrædelser tilgængelig på anmodning)
Fungal identifikation
Totalt genomisk DNA blev ekstraheret fra friske kulturer af svampe ifølge Arnold Lutzoni [11]. De nukleare ribosomale interne transskriberede afstandsstykker og 5,8S gen (ITSrDNA) og en tilstødende del af den nukleare ribosomale store underenhed (LSUrDNA) blev forstærket som et enkelt fragment ved anvendelse af primere ITS1F eller ITS5 og LR3 følgende Hoffman
et al.
[18]. PCR-produkter blev visualiseret ved hjælp af SYBR grønne efter elektroforese på en 1% agarose gel og indsendes til University of Arizona Genetics Core for oprydning, normalisering, og tovejs Sanger sekventering. Sekvenser blev samlet automatisk og baser kaldes med
Phred
phrap
[19], [20] med orkestrering af Mesquite [21], efterfulgt af manuel redigering i Sequencher 4.5 (GeneCodes Corp.) . Sekvenser blev sammenlignet mod NCBI ikke-redundant database ved hjælp af BLASTN [22] til at estimere taksonomiske placering og blev forelagt GenBank under tiltrædelsesforhandlingerne nos. KF746076-KF746159 (tabel S1).
Fordi identifikation kun baseret på BLAST kampe skal behandles med forsigtighed (for eksempel [23]) vi brugte fylogenetiske analyser at give stærkere følgeslutning om taksonomiske tilhørsforhold. Sekvensdata for 84 fungale isolater blev lastet som én gruppe i Mesquite [21] og tilpasses ved MUSCLE [24]. Den resulterende tilpasning, som identificerede klynger af let kan bringes på linje sekvenser, var upassende for en enkelt fylogenetisk analyse på grund af forekomsten af tvetydige og unalignable regioner. Sekvenser, aligned sammenhængende med hinanden blev delt i grupper på tilsyneladende nært beslægtede stammer. Resulterende grupper blev derefter analyseret som særskilte datasæt som følger: Alle sekvenser i hver gruppe blev sammenlignet mod NCBI database ved hjælp af BLASTN. De øverste 50 hits for hver sekvens blev hentet og filtreret for at fjerne (1) redundante sekvenser og (2) sekvenser fra potentielt mis-identificerede stammer og unvouchered prøver (se [23]). Mindst en sekvens fra en pålidelig kultur samling indgik i hvert datasæt, og en eller to outgroups blev udvalgt fra arter tæt knyttet til navngivne sekvenser i datasættet (valgt af litteraturen).
Hver resulterende datasæt blev justeret separat i muskel. Sekvenser i hvert tilpasning blev trimmet til konsekvente start og slut punkter, og tilpasning kvalitet blev verificeret ved visuel inspektion i Mesquite. Alle justeringer blev forelagt TreeBASE (https://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S14945). Vis alle modeller af evolution blev udledt ved hjælp jModeltest [25], [26]. Fylogenetiske træer blev udledt ved maksimal sandsynlighed i garli [27], med støtte bestemt af 100 bootstrap replikater implementeret i Cipres webportalen [28], og ved hjælp Bayesianske metoder i MrBayes (tilgås via Cipres [28]). For sidstnævnte analyser bestod af 5 millioner generationer, med fire kæder, tilfældige udgangspunkter træer og prøveudtagning hvert 1000:e træ. Fuldstændighed blev vurderet på grundlag af asymptoter af -ln li værdier og evaluering af standardafvigelser for split frekvenser. Posteriore sandsynligheder billede kan slutte sig uafhængige værdier til at støtte de topologiske relationer og tilhørende understøttede værdier fra maximum likelihood analyser. Resultater af hver fylogenetisk analyse blev sammenlignet mod den eksisterende litteratur for hver taksonomiske gruppe for at sikre, at relationer kendte taxa var passende, hvilket giver selvtillid med hensyn til vores placering af dovenskab hår svampe.
Udarbejdelse af svampeangreb ekstrakter
en enkelt agar prop af hver stamme udvalgt til yderligere analyse blev overført under sterile betingelser til en frisk plade af 2% MEA og inkuberet i laboratoriet ved stuetemperatur, indtil ca. 50% af pladen blev dækket med mycelievækst. Femten agarpropper (hver 5 mm i diameter) blev skåret med en steril korkbor under sterile betingelser og overført til kolber indeholdende 37 ml 2% maltekstrakt bouillon (MEB). Kolber blev inkuberet på en orbitalryster (28 ° C, 125 rpm) i 2 uger.
Flydende kulturer blev blandet med et tilsvarende volumen ethylacetat og blandet i 2 minutter ved 9000 rpm med en Polytron (Lauda- Brinkmann, Delran, NJ, USA). Fungal biomasse blev fjernet ved vakuumfiltrering gennem Whatman filtrerpapir (# 1), og filtratet blev ekstraheret to gange med en 01:01 volumen ethylacetat. Det vandige lag blev bortkastet, og det organiske lag blev tørret og opbevaret ved -80 ° C.
Bioassays Salg
Rå organiske ekstrakter af fungale kulturer blev anvendt i bioassays mod fokale stammer af agenser, malaria (
Plasmodium falciparum
) og Chagas sygdom (
Trypanosoma cruzi
), og mod brystkræft MCF-7, som beskrevet af Higginbotham
et al
. [29]. Bioaktivitet af ekstrakter, som blev fortyndet i DMSO (10 ug /ml), blev målt som procent inhibering af vækst (% IG) sammenlignet med den negative kontrol (DMSO uden ekstrakt; 0% IG).
BioMAP analyser
en antibiotisk aktivitet profil skærm, BioMAP (Anti
bio
tic
m
ode af
en
ktion
s
rofil; [30]), blev anvendt til at teste aktiviteten af 50 rå organiske ekstrakter mod 15 humane patogene bakterier. Uddrag med potente bioaktivitet blev seriefortyndet (16 2-fold fortyndinger) og re-screenet mod det samme panel af bakterier. Vækstkurver blev afbildet ved registrering OD
600 værdier hver time i 24 timer og mindste hæmmende koncentration (MIC) blev efterfølgende beregnet for hver ekstrakt. At etablere koncentrationsafhængige uafhængig bioaktivitet profiler for hver ekstrakt, rå MIC-værdier blev normaliseret resulterer i et interval af værdier fra 0 (inaktiv) til 1 (mest bioaktive). Disse aktivitetsprofiler blev derefter sammenlignet med profiler af kendte antibiotika, der tilhører alle større strukturelle klasser. Denne metode er effektiv til at forudsige den strukturelle klasse af ukendte antibiotiske forbindelser fra komplekse eller rå blandinger [30].
Resultater og Diskussion
I alt 84 svampeangreb isolater blev undersøgt fra den grove ydre hår af ni levende individer af tre-tåede dovendyr (
Bradypus variegatus
) stødt sammen Pipeline Road i Soberania National Park, Republikken Panama. Hårprøver blev transporteret til laboratoriet i sterile Falcon-rør, som var blevet halvt fyldt med silicagel, et tørremiddel, som er effektiv til lagring fungal væv [31], [32]. Hvert stykke dovenskab hår placeret på agar gav flere svampesygdomme isolater, der repræsenterer en bred vifte af morphotypes. Fylogenetiske analyser af axeniske stammer afslørede en forskelligartet gruppe af svampe, hvoraf nogle synes at være nye i forhold til tidligere observeret eller sekventeret systematiske enheder (tabel 1, figur 1). Mange af disse isolater viser bioaktivitet
in vitro
mod parasitter, der forårsager malaria og Chagas sygdom, brystcancerceller, og begge grampositive og gramnegative humane patogene bakterier (tabel 2; Tabel 3).
Topologi af hvert træ afspejler ML analyse, og værdier over grene indikerer ML bootstrap værdier og Bayesianske posteriore sandsynligheder ( 0,50 og 0,75, henholdsvis). Outgroups og taxon prøveudtagning til hvert træ blev valideret af litteraturen undersøgelser (se metoder). Taksonomiske konklusioner er præsenteret i tabel 1. Figur 1 (A): Placering af F5073 i gruppe 17; (B) F4847 i gruppe 18; (C) F4831a i gruppe 19; (D) F4819 i gruppe 20; (E) F4801 i gruppe 5; (F) F4806 i gruppe 7; (G) F4886 i gruppe 8; (H) F5071 i gruppe 15; (I) F4812-F4816, F4830, F4831, F4845, F4852-F4856, F4860, F4873, F4882, F4883 og F4900-F4902 i gruppe 1; (J) F4803, F4817, F4820, F4823, F4824, F4826, F4827, F4829, F4837, F4841, F4842, F4846, F4848, F4857, F4858, F4861, F4862, F4870, F4872, F4875, F4878, F4879, F4894-F4896 , F4908, F4909, F5069 og F5074 i gruppe 2; (K) F4818 og F4839 i gruppe 10; (L) F4877, F4890 og F4897 i gruppe 11; (M) F4828 og F4898 i gruppe 12; (N) F4876 og F4881 i gruppe 13; (O) F4863 og F4884 i gruppe 6; (P) F4821, F4874, F4889 og F4913 i gruppe 3; (Q) F4802, F4807, F4825, F4844, F4906 og F5068 i gruppe 4; (R) F4850 og F4891 i gruppe 9; (S) F4904 og F4905 i gruppe 14; og (T) F5070 og F5072 i gruppe 16. Vejviser
Phylogenetisk analyser
84 svampe isolater repræsenterede 28 operationelle taksonomiske enheder (Otus) baseret på 95% sekvenslighed (tabel 1). De to mest rigelige Otus repræsenteret 34 (40,5%) af isolaterne. De resterende 50 isolater var repræsenteret med 26 særskilte Otus.
BLAST sammenligninger med GenBank forudsat foreløbige vurderinger af taksonomisk placering og lighed med tidligere sekventeret svampe (tabel 1). Alle isolater var Ascomycota. Fjorten isolater havde en øverste match til dyrkede fugal kloner og 23 havde en øverste match til dyrkede men uidentificerede svampe. De resterende 47 isolater havde kampe til navngivne stammer, der forsøgsvis foreslåede placering i sordariomycetes (Xylariales, Glomerellales, Hypocreales), Dothideomycetes (Botryosphaeriales og Pleosporales), og Eurotiomycetes (Eurotiales). Til mere trygt bestemme taksonomiske placering, blev sekvenser analyseret ved hjælp af maximum likelihood og Bayesianske metoder
Sekvenser der justeret godt til hinanden, blev opdelt i klynger for at oprette 20 grupper med tilsyneladende lignende arter (tabel 1, figur 1).. Én gruppe indeholdt 29 sekvenser fra sloth-hår svampe, en gruppe indeholdt 20 sekvenser og de resterende 18 grupper indeholdt mellem 1 og 6 sekvenser hver. Mellem 34 og 165 sekvenser fra nært beslægtede taxa blev kompileret for hver gruppe at gøre ikke-redundante datasæt, som en eller to egnede outgroups blev sat baseret på en gennemgang.
Efter fylogenetiske analyser, højt niveau identiteter (klasse, orden, familie) kunne trygt tildelt 82 svampe, der repræsenterer 15 familier og 10 ordrer (tabel 1, figur 1). Størstedelen (81,7%) af disse var sordariomycetes. Svampe fra denne klasse er veldokumenterede kilder til bioaktive metabolitter (fx [33], [34]). De resterende isolater var Dothideomycetes (15,9%) og Eurotiomycetes (2,4%)
Firs isolater kunne trygt tildeles 15 slægter (tabel 1, figur 1).. To isolater blev givet mere tentative fylogenetiske placeringer. F4886 (figur 1 (G)) blev identificeret som
Robillarda
sp. eller som medlem af et nært beslægtet slægt i Amphisphaeriaceae. Isoler F4831a (figur 1 (C)) blev identificeret som medlem af
Paraconiothyrium
sp. eller et nært beslægtet slægt i Montagnulaceae. De to mest almindelige slægter,
Pestalotiopsis
sp. og
Hypocrea
sp., blev isoleret fra 7 af 9 og 5 i 9 sloth hårprøver, henholdsvis.
Isoler F4891 (figur 1 (R)) syntes ikke at være tæt forbundet med eventuelle navngivne sekvenser i GenBank og kunne kun identificeres som eventuelt et medlem af ordren Pleosporales (Dothideomycetes). Isoler F4850 (figur 1 (R)) havde 96% sekvenslighed med sin nærmeste match i GenBank, en ukultiverede jord svamp klon (tabel 1; [35]). Yderligere analyser er berettiget med henblik på at bekræfte, om isolerer F4891 og F4850 er nye svampearter. Generelt analyser identifikationer tildelt af fylogenetiske nøje matchede dem af den øverste BLAST hits for hvert isolat (tabel 1).
Bioaktivitet af dovenskab hår isolerer
Sloth hår svampe, der blev dyrket i flydende medium og ekstraheret med ethylacetat blev testet for bioaktivitet. Vi overvejede ekstrakter at være yderst bioaktive hvis de forårsagede mindst 50% hæmning af væksten (dvs. ≥50% IG) af parasitter eller cancerceller
in vitro
.
Alt i alt to af 70 (2,5%) ekstrakter testet var meget aktive mod
P. falciparum
, otte af 62 (12,9%) testede ekstrakter var meget aktive mod
T. cruzi
, og 15 af 73 (20,6%) testede ekstrakter var stærkt aktive mod MCF-7 brystcancer cellelinje (tabel 2). De fleste ekstrakter med bioaktivitet var aktive i kun én assay (tabel 2). Bioaktive stammer blev isoleret med samme hyppighed på MEA og PDA (tabel 2). Især nært beslægtet isolater ofte afveg i bioaktivitet: for eksempel tre af 20 isolater identificeret som
Hypocrea
sp. (Tabel 1) havde bioaktivitet kun mod MCF-7 brystcancerceller; tre var aktive mod MCF-7 brystkræftceller og
T. cruzi
(tabel 2); og en var aktiv kun mod methicillin-resistente
S. aureus Hotel (tabel 3).
Af de 16 svampe, der havde høj% IG i mindst én
in vitro
assay, 13 tilhørte Hypocreales (Hypocreaceae, Bionectriaceae og Nectriaceae) . De resterende tre svampe tilhørte Valsaceae (Diaporthales), Amphisphaeriaceae (Xylariales) og Trichocomaceae (Eurotiales). Malaria-og anti-cancer aktiviteterne er tidligere blevet rapporteret i litteraturen fra disse relativt velundersøgte fungale slægter (f.eks [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]). Men vores resultater repræsenterer, til vores bedste viden, de første rapporter af anti-trypanosomal aktivitet i
Cytospora
(Valsaceae) og
Bionectria
(Bionectriaceae).
antal isolater stærkt bioaktive mod
T. cruzi
(tabel 2) er af særlig interesse, da vi så sjældent støder mikrober med bioaktivitet i denne analyse: kun 104 af 2698 svampeinfektioner endofytter (3,9%) fra vores overordnede kultur kollektion er meget bioaktive mod denne parasit [29]. I øjeblikket er de eneste behandlinger til rådighed for denne sygdom er NITROFURAN og benznidazol, som begge er forbundet med sådanne toksiske bivirkninger, at behandling ofte opgives [44].
Af 50 svampeangreb ekstrakter screenet af BioMAP, 20 var bioaktive mod mindst en testorganisme (tabel 3). De fleste isolater (16 af 20) aktiv mod bakterier i BioMAP assay tilhørte familier Lasiosphaeriaceae (Sordariales), Glomerellaceae (Glomerellales), Valsaceae (Diaporthales), Botryosphaeriaceae (Botryosphaeriales), og Amphisphaeriaceae (Xylariales). De resterende fire svampe tilhørte Nectriaceae, Bionectriaceae og Hypocreaceae (Hypocreales). Aktivitet over for grampositive bakterier blev påvist langt hyppigere end mod gramnegative bakterier (tabel 3)
Fem isolater (
Colletotrichum
sp F4806 (figur 1 (F));..
Cytospora
sp 1, stamme F4818 (figur 1 (K)).
Fusarium
sp 1, stamme F4898 (figur 1 (M)).
Lasiodiplodia
sp. 1, stamme F4807 (figur 1 (Q)), og
Lasiodiplodia
sp 1, stamme F4844 (figur 1 (Q)) havde særligt potent aktivitet i BioMAP assay og blev udvalgt til yderligere afprøvning Seriefortyndet.. ekstrakter blev re-testet for aktivitet mod panelet på 15 bakterier og bioaktivitet profiler blev bygget ved hjælp af normaliserede MIC-værdier (tabel 4).
uddrag fra
Lasiodiplodia
sp. 1 ( stamme F4807) var af særlig interesse, da det havde kraftig og specifik aktivitet mod gram-negative bakterier (tabel 4). bioaktiviteten profil isolatet matchede er nogen af de kendte antibiotiske klasser tidligere er testet i BioMAP assay, hvilket antyder en potentielt nye virkningsmekanisme (se [30]). Infektioner forårsaget af nye multiresistente (MDR) Gram-negative bakterier bliver en større klinisk problem i hele verden [45]. Disse infektioner oftest omfatter MDR
Pseudomonas aeruginosa
, udvidet spektrum β-lactamase producerende Enterobacteriaceae, og MDR
Acinetobacter baumannii
[46]. De seneste data tyder på, at infektioner spores til
Staphylococcus aureus
blodbanen isolater er i tilbagegang, men at infektioner med
Escherichia coli
, de mest almindelige Gram-negative arter, der er ansvarlige for infektioner i humant blod isolater er stigende i frekvens [47]. Rapporten [47] fremhæver også mangel på antibakterielle midler under udvikling for Gram-negative bakterier, med største indsats være fokuseret på Gram-positive MRSA. Den stigende forekomst af multiresistente organismer skyldes primært overforbrug af bredspektrede antibiotika og dårlig antibiotika forvaltning [48]. Derfor specificiteten af ekstrakten fra stamme F4807 for Gram-negative stammer er meget værdifuld og værd at forfølge til yderligere analyse.
Svampe isoleret i denne undersøgelse blev taksonomisk overensstemmelse med grupper af svampe vides at forekomme i jord og i planter som patogener, saprotrophs eller endofytter [11], [49]. Sloths kan støde sådanne svampe i øvrigt fra luft spora, eller via direkte kontakt, når de bevæger sig ned fra træer for at defecate og urinere, på hvilket tidspunkt de graver et hul i jorden, at de efterfølgende dække med nedfaldne blade [50]. Påfaldende, sammenligning med en stor samling af endofytter fra landplanter i Panama ([29] 1269-stammer) viste, at sekvenser fra 29 isolater fra sloth hår var identiske med stammer opnået fra planter (100% lighed over hele sekvensen længde). denne undersøgelse omfatter således det kendte værtsområde og økologiske tilstand af formodede endofytter. Nogle af disse svampe kan affiliate direkte med den grønne alge, der lever grove hår af dovendyr, meget gerne endolichenic svampe associeret med grønne alger i lav thalli og er ofte taksonomisk ligner endofytter i de samme miljøer [51], [52].
Potentielle roller disse svampe i helbred dovendyr er ikke blevet undersøgt. Araújo Xavier
et al
. [50] rapporterede svampeinfektioner i
B. variegatus
forårsaget af svampe patogen
Microsporum
(som også forårsager dermatitis hos mennesker [53]), men denne slægt blev ikke genfundet i nærværende undersøgelse eller i tidligere arbejde ved Suutari
et al
. [16]. I modsætning til den menneskelige microbiome, hvor svampe omfatter 0,01% af mikrobielle Fællesskaber på eksterne overflader såsom hud [54], Suutari
et al
. [16] rapporterede, at svampe repræsenterede 8% af floraen i undersøgelser af dovenskab-hår mikrober. Den høje tæthed og diversitet af svampe, der er forbundet med dovenskab hår, kombineret med deres bioaktivitet, kan tale med en biologisk betydning dovendyr, som endnu uudforsket.
presserende behov for nye lægemidler fortsat udgør en af menneskehedens største udfordringer . Det er almindeligt enighed om, at det store flertal af bioaktive mikrober mangler at blive opdaget [9] og nyopdagede mikrobielle taxa holder en vigtig løfte om nye kemi. Rigelige beviser peger på nye miljøer som lovende kilder til endnu ubeskrevne mikroorganismer [55]. Her har vi vist, at hår af tre-tåede dovendyr (
Bradypus variegatus
) i Panama er en rig kilde af forskellige bioaktive svampe. Stammer isolerede her inkluderet medlemmer af nogle velundersøgte slægter (f.eks Hypocreales; Pleosporales), men også medlemmer af dublerede eller potentielt nye grupper (f.eks,
Endomelanconiopsis
sp F4801;.
Robillarda
sp . F4886; Ascomycota sp F4891;.. Ascomycota sp F4850). Vi forventer, at yderligere roman taxa kunne findes på dovenskab hår ved at udvide undersøgelsesmetoder til forskellige typer af medier og ved hjælp af high-throughput metoder til at vurdere samfund sammensætning. Vi forventer også, at forskellige taxa kan isoleres fra dovendyr i andre regioner, meget som samfund af endofytter i tropiske planter adskiller sig markant på regionalt plan [56], [57]. Således vores arbejde tyder på, at frugtbar udforskning af dovenskab mikrobiota er berettiget for potentielle anvendelser i lægemiddelforskning.
Støtte oplysninger
tabel S1.
Sloth hår svamp id og tiltrædelse Genbank numre
doi:. 10,1371 /journal.pone.0084549.s001
(DOCX)
Tak
Vi takker Bryson Voirin for indsamling af sloth hårprøver. Vi takker Phyllis D. Coley, Thomas A. Kursar, Meg Crofoot og Santosh Jagadeeshan for nyttige kommentarer og anden bistand og Malkanthi Gunatilaka og Jakob Riddle for sekvensanalyse. Vi takker regeringen i Panama og i særdeleshed det personale hos Panamas Autoridad Nacional del Ambiente (ANAM), for at lette denne forskning. Vi takker Smithsonian Tropical Research Institute (STRI) til at understøtte alle logistiske aspekter af dette arbejde og de mange studerende og assistenter, der har bidraget til denne mængde forskning.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.