PLoS ONE: Samtidig målretning af Multiple Key transkriptionsfaktorer effektivt forstyrrer cancerstamceller Beriget i Side Befolkning for Human kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

En stor udfordring i behandlingen af ​​pancreas ductal adenocarcinom er svigt af kemoterapi, hvilket sandsynligvis skyldes tilstedeværelsen af ​​cancer stamceller (CSCS).

mål

at identificere side befolkning (SP) celler og karakterisere s-lignende egenskaber i humane bugspytkirtelkræft cellelinier (h-PCCLs) og udnytte effekten af ​​samtidig målretning af flere vigtige transkriptionsfaktorer vedrørende stemness af pancreas CSCS undertrykke CSC-lignende fænotyper.

Metoder

flowcytometri og Hoechst 33342 DNA-bindende farvestof efflux-assay blev anvendt til at sortere SP og ikke-SP (NSP) celler fra tre h-PCCLs: Panc-1, SW1990, og BxPc-3. Den selvfornyelse evne, invasivitet, migration og lægemiddelresistens af SP celler blev vurderet. Ekspression af CSC markørgener blev analyseret. Tumorigenicitet blev vurderet ved anvendelse af en xenograft model i nøgne mus. Virkninger af en kompleks lokkedue oligonucleotid (cdODN-SCO) designet til samtidigt at målrette Sox2, Oct4 og c-myc blev vurderet.

Resultater

CSCS blev beriget i siden andel (SP) celler indeholdt i H-PCCLs og de besad aggressive vækst, invasion, migration og narkotika-resistente egenskaber sammenlignet med NSP celler. SP celler overeksprimeres stamceller cellemarkører CD133 og ALDH1, pluripotens opretholde faktorer Nanog, Sox2 og Oct4, onkogen transkriptionsfaktor c-myc, signalmolekyle Notch1 og drug-resistente gen ABCG2. Desuden SP-celler konsekvent viste signifikant større tumorigenicitet end NSP celler i xenograft model af nøgne mus. CdODN-SOC effektivt undertrykt alle CSC ejendomme og fænotyper, og minimeret tumorigen evne SP celler og resistens mod kemoterapi. Til sammenligning den negative kontrol undladt at gøre det.

Konklusion

Resultaterne indikerer, at målrette de centrale gener, der giver den stemness af CSCS effektivt kan fjerne CSC-lignende fænotyper, og dermed kan betragtes en ny tilgang til kræftbehandling. Konkret fastlægger nærværende undersøgelse kombinationen af ​​Sox2 /Oct4 /c-myc målretning som en potentiel anti-bugspytkirtelkræft agent værdig yderligere undersøgelser i prækliniske indstillinger

Henvisning:. Wang X, Liu Q, Hou B, Zhang W, Yan M, Jia H, et al. (2013) Samtidig målretning af Multiple Key transkriptionsfaktorer effektivt forstyrrer cancerstamceller Beriget i Side Befolkning for Human bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 8 (9): e73942. doi: 10,1371 /journal.pone.0073942

Redaktør: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, England

Modtaget: 19. april, 2013; Accepteret: 24 juli 2013; Udgivet: 11 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC), kendt under sit aggressivitet i naturen, er en meget dødelig malignitet, der normalt diagnosticeres på et sent stadium, hvor der er sprunget optimale terapeutiske muligheder [1]. Den dårlig prognose kan forklares ved den sene påvisning af den neoplastiske proces, mangel på effektiv behandling, og begrænset viden om dets biologiske egenskaber. Derfor er en bedre forståelse af de cellulære /molekylære egenskaber forbundet med denne tilstand presserende behov for at udforske nye steder for diagnostik og behandling af denne triste sygdom.

Nye beviser tyder på, at maligne tumorer er sammensat af en lille delmængde af særskilte cancerceller, betegnes “cancer stamceller” (CSCS), typisk mindre end 5% af totale celler cancer baseret på celleoverflademarkør ekspression [2-6]. CSCS findes i en sub-population af celler, der er forskellig fra den vigtigste befolkning inden tumorer eller hæmatologiske kræftformer, kaldet “side population” celler (SP celler) udviser stamceller celle-lignende egenskaber. CSCS besidder evnen til at forny sig selv og til at generere de heterogene slægter af kræftceller, der omfatter tumor; de er derfor tumorigene, i modsætning til andre ikke-tumorgene cancerceller, og er væsentlige drivkræfter for tumorprogression og metastase. Klinisk endnu vigtigere, er imidlertid den kendsgerning, at CSCS også bibringe virulens via immunsystemet svig og multiresistens til kemoterapi og strålebehandling resulterer i deres relative berigelse under behandling og hurtig tilbagefald af sygdom [2-6]. Effekten af ​​kræftbehandling måles ofte ved ablation brøkdel af tumormasse, og konventionelle kemoterapier dræbe differentierede eller differentierende celler, som udgør størstedelen af ​​tumoren, men er ude af stand til at generere nye celler. Som CSCS danner en forholdsvis lille andel af tumoren, kunne de forblive un-angrebet, der forårsager et tilbagefald af sygdommen. Derfor udvikling af specifikke terapier rettet mod CSCS besidder enorme håb om forbedring af overlevelse og livskvalitet kræftpatienter, især for lider af metastatisk sygdom.

CSCS er blevet identificeret i PDAC og bugspytkirtelkræft cellelinjer af flere laboratorier [7-14]. Humane pancreas CSCS udtrykker høje niveauer af CD133, CD24, CD44, ESA, og aldehyd dehydrogenase (ALDH1) har også mere rigelige Nanog, Oct4, Notch1, MDR1 og ABCG2 end normale pancreas væv og primære bugspytkirtelkræftceller [10-12,14, 15]. Det fremgår, at PDAC ikke kun indeholde én homogen population af CSCS snarere end forskellige subpopulationer, der kan have udviklet sig under tumorprogression, baseret på anvendelsen af ​​kombinationer af overflademarkører, der tillader deres isolation, formering, og yderligere karakterisering. En af disse populationer kaldes migrere CSCS og disse celler er i stand til at unddrage sig den primære tumor og rejser til fjerne steder såsom leveren som den foretrukne sted for metastatisk spredning.

Derfor vellykkede behandlinger af kræft ikke kun stole på at identificere kilden til cancerceller og anticancerterapi for de differentierede cancerceller, men også på at finde potentielle CSC befolkning og nå tilstrækkelig destruktion af CSCS i tumoren. Faktisk har CSC-målrettede tilgange demonstreret meget lovende i prækliniske modeller [2-6]. Disse tilgange omfatter direkte strategier, såsom ablation ved at målrette molekylære markører for CSCS eller CSC-specifikke veje, tilbageførsel af resistensmekanismer og differentiering terapi, og indirekte strategier, såsom antiangiogenisk terapi, immunterapeutiske tilgange, og afbrydelse af protumorigenic interaktioner mellem CSCS og deres mikromiljø.

Den foreliggende undersøgelse blev udført for at nå følgende to primære mål. For det første at have en omfattende karakterisering af CSC befolkninger i humane pancreas cancer cellelinjer, vi sammenlignede SP celler i BxPc-3, PANC-1 og SW1990 cellelinjer. For det andet, at udnytte muligheden for samtidig at målrette flere transkriptionsfaktorer vedrørende stemness af pancreas CSCS at forstyrre CSCS derved tumorgenese og metastase, vi designet en lokkedue oligonukleotider fragment af “en agent, flere mål” -konceptet og testet effekten af ​​dette molekyle til tavshed stemness af pancreas CSCS.

Materialer og metoder

Etik erklæring

det anvendte af alle dyr i denne undersøgelse blev godkendt af, og alle operative procedurer og pasning af dyr strengt var i overensstemmelse med retningslinjer fastsat af, det Dyreetiske Komité Xinjiang Medical University og Sun Yat-sen University.

Cell kultur

de humane bugspytkirtelkræft cellelinjer BxPc-3, Panc-1 og SW1990 oprindeligt etableret fra human primær pancreas adenocarcinom af ATCC blev købt fra Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kina) og opformeret i vores laboratorium. Alle cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM). Medium blev suppleret med 1% penicillin /streptomycin, 3 mM L-glutamin og 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco). Celler blev holdt i en fugtig inkubator ved 37 ° C indeholdende CO 5%

2.

Flowcytometrianalyse og cellesortering

SP-celler er en lille gruppe af celler, som farves svagt eller slet ikke, når de behandles med Hoechst 33342 farvestof. Disse celler kan isoleres ved anvendelse af flowcytometri protokoller oprindeligt fastlagt ved Goodell et al. i en undersøgelse af murine knoglemarv [16,17]. H-PCCLs blev løsnet fra dyrkningsskålen med 0,25% trypsin, vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og suspenderes ved 1 x 10

6 celler /ml i dyrkningsmedium indeholdende 2% FBS. Tumorcellerne og cellelinier blev inkuberet med Hoechst 33342 farvestof (Sigma-Aldrich) i en endelig koncentration på 5 ug /ml med eller uden verapamil (100 uM; Sigma-Aldrich) ved 37 ° C i 90 min med intermitterende rystning hver 15 min. Verapamil blev anvendt til at verificere SP fænotype, da det kan reducere sidegrenen ved at blokere multidrug transportører. Efter vasket to gange med PBS blev cellerne resuspenderet i iskold PBS indeholdende 2% FBS, gennem en 40-um mesh-filter til opnåelse af enkelt-cellesuspensioner, og holdes på is indtil flowcytometrianalyse. Propidiumiodid (PI; 2 pg /ml; Sigma-Aldrich) blev tilsat til at mærke og eksklusive døde celler. Celleanalyse og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) blev udført under anvendelse af en FACS Vantage SE udstyret med version 6.0 af FACS DIVA software (BD Biosciences, Erembodegem, Belgien). Hoechst 33342 farvestof blev ophidset af en 350-nm ultraviolet laser, og fluorescensemission var dobbelt bølgelængde analyseret (Hoechst blå med 402-450 nm filter, Hoechst rød med 650-670 nm filter).

Cell spredning og cellecyklus assays

et tusind sorteret SP og ikke-SP (NSP) -celler blev podet i separate brønd i en 96-brønds plade i tre eksemplarer og dyrket i Leibovitz L-15-medium med 1% penicillin /streptomycin og 10 % FBS i 3 dage. Væksten blev målt under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) -metode. Kort beskrevet 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS; Sigma) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. En 150-pi alikvot af DMSO blev derefter tilsat, og absorbansen blev målt ved en mikropladelæser (Multiscan MK3, Thermo LabSystem, USA) ved en bølgelængde på 490 nm.

I celle-cyklus-assay, 5 x 10

5 frisk sorterede celler blev vasket to gange med PBS og fikseret med 2 ml 70% iskold ethanol ved 4 ° C natten over. Cellerne blev derefter overført til PBS, farvet med 20 pg /ml PI og 1 mg /ml RNase og analyseret ved anvendelse af flowcytometri. Resultaterne er udtrykt som procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklus.

Klon dannelse analyser

De følgende trin blev ansøgt om analyserne (1). Agar (10 g /l; DNA-kvalitet) blev smeltet i mikrobølgeovn og 2 × DMEM suppleret med 200 ml /l FBS blev opvarmet til 40

oC i et vandbad. Lige volumener af disse to opløsninger blev derefter blandet for at give en ny opløsning af 5 g /l agar + 1 × DMEM + 100 ml /l FBS (2). Dernæst blev 1 ml af blandede opløsning tilsat til hver brønd af en 6-brønds plade til dannelse af basen agar (3). Derefter blev 7 g /l agar (DNA-kvalitet) smeltes i mikrobølgeovn og afkølet til 40

oC i et vandbad, og 2 × DMEM og 200 ml /l FBS opvarmet til den samme temperatur (4). Frisk sorteret SP og ikke-SP-celler blev passeret gennem en 40-um filter for at tilvejebringe en enkelt cellesuspension og blev talt. Tre ml DMEM, 1,5 ml 2 x DMEM indeholdende 200 ml /l FBS og 1,5 ml agar herunder 500 sorterede celler blev derefter blandet sammen, og en 1,5 ml cellesuspension af denne opløsning blev anbragt i hver brønd i en 6-brønds plade som topagar (5). Endelig blev 100 celler udsået i hver brønd, og blev inkuberet ved 37

oC i en befugtet inkubator i 2-3 wk. Kolonier enten venstre ufarvet, eller blev farvet med 5 g /l MTT (Sigma-Aldrich) i 1 time og talt under et dissektionsmikroskop (proceduren blev gentaget tre gange) (6). Efter SP-celler blev podet i blød agar-assays blev kolonier indeholdende mere end 50 celler (primære koloni), fjernes fra blød agar med sterile Pasteur-pipetter, behandlet med trypsin og dissocieret mekanisk i enkelte celler. Derefter, trin (5) blev gentaget for den sekundære koloni.

Sphere formation assays

Sorted SP og NSP celler fra de tre h-PCCLs blev ført gennem en 40-um filter til opnåelse af en enkelt cellesuspension. Derefter 4 ml medium indeholdende 100 celler blev tilsat til plader med 6 brønde med serumfrit kulturmedium DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies) suppleret med epidermal vækstfaktor (10 ug /l), insulin (20 mg /l) og bFGF (10 ug /l). Portioner af epidermal vækstfaktor, insulin og basisk fibroblastvækstfaktor blev tilsat to gange om ugen. Efter 10 d blev plader visuelt undersøgt for dannelsen af ​​flydende kugler og kugler blev talt under et dissektionsmikroskop.

Invasion assay

invasivitet af sorteret SP og NSP celler blev bestemt under anvendelse af 6-brønds Matrigel invasion kamre (BD Biosciences Discovery Labware). Celler blev podet i øverste kammer på Matrigel coatede membran (24 brønde insert, porestørrelse, 8 mm, Corning Costar) ved 2 × 10

5 pr insert i serumfrit DMEM ved 37

oC med 5 % CO

2 i 48 timer. Ydre brønde blev fyldt med DMEM indeholdende 5% FBS som kemo-tiltrækningsstof. De ikke-invaderende celler blev fjernet ved pensling øverste lag af Matrigel med Q-tip. Membranen indeholdende invaderende celler blev farvet med hematoxylin i 3 min, og derefter vasket og monteret på objektglas. De invaderende celler på hele membranen blev talt under et lysmikroskop ved 40 × mål.

Transwell migration assay

Sorted SP eller NSP-celler ved 1 x 10

5 blev udpladet i den øverste kammer på den ikke-coatede membran (24 brønde insert, porestørrelse, 8 mm, Corning Costar) og fik lov til at migrere mod serumholdigt medium i det nedre kammer. Cellerne blev fikseret efter 24 timer inkubation med methanol og farvet med 0,1% krystalviolet (2 mg /ml, Sigma-Aldrich). Antallet af celler invaderer gennem membranen blev talt under et lysmikroskop (40 ×, tre tilfældige felter per brønd).

Drug modstand analyse

Prøver af 2 × 10

3 frisk sorteret SP og NSP-celler blev podet i plader med 96 brønde in triplo med 200 pi DMEM per brønd. Efter en 12 timers restitutionsperiode, blev celler udsat for forskellige koncentrationer af gemcitabin i 72 timer. Virkningerne på cellevækst blev undersøgt af MTT-analysen, som beskrevet ovenfor. Cellen overlevelsesrate (SR) blev beregnet ved anvendelse af formlen: SR = (gennemsnitlig absorbans testbrønden /middelabsorbans af kontrollen) × 100%; cellen modstand sats (RR) blev beregnet ved hjælp af formlen:. RR = 100% -SR

apoptotiske celler blev bestemt ved fluorescein (FITC) -Annexin-V metoder. Kort fortalt blev frisk sorterede celler udsået i 6-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

5 celler /brønd. Efter 12 timer på genopretning blev cellerne udsat for forskellige koncentrationer af gemcitabin i 48 timer. Cellerne blev derefter farvet med Annexin-V og PI hjælp af ApoAlert ™ Annexin V Apoptosis Kit (Clontech, Cosete Tech, Jinan) ifølge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev celler høstet ved trypsinisering og vasket to gange med kold PBS. Pellets blev resuspenderet i 100 pi 1 × Annexin bindingsbuffer og 5 pi FITC-Annexin-V. En 1-pi bearbejdning opløsning af PI ved 100 ug /ml blev tilsat til hver 100 pi cellesuspension. Cellerne blev inkuberet på is i 1 time, vasket igen med kold PBS og resuspenderes i 300 pi 1 × Annexin-bindingsbuffer. De farvede celler blev straks analyseret ved flowcytometri.

In vitro differentiering undersøgelse

Frisk sorteret SP og NSP-celler blev dyrket ved en tæthed på 1 x 10

5 celler /brønd i en 6-brønds kulturplade i Leibovitz L-15-medium med 1% penicillin /streptomycin og 10% FBS og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2. Efter 7 dage, SP- og ikke-SP afledte celler blev re-analyseret for tilstedeværelsen af ​​en SP fraktion ved hjælp af de metoder der er beskrevet ovenfor.

Tumorigenicitet assay in vivo

athymiske 4- til 5 -Uge gamle mus (BALB /c nøgen mus) blev leveret af SLAC Laboratory Animal (Shanghai). Mus blev huset og vedligeholdes i laminare flow kabinetter under patogenfrie betingelser. Grupper af mus blev orthotopisk inokuleret s.c. til venstre dorsale flanke af mus med frisk Weaver SP-celler ved 1 x 10

3, 1 x 10

4, 1 x 10

5, og 1 x 10

6 eller NSP-celler ved 1 × 10

3, 1 x 10

4, 1 × 10

5, og 1 × 10

6 (fire mus per gruppe). Tumorvækst blev overvåget hver 2 dage efter anden uge af podning. Musene blev aflivet på dag 50, eller når tumorerne vokser til et maksimum på 1000 mm

3. Tumorvolumen blev beregnet ved formlen 0,52 x længde x bredde

2. Fold forskel i tumorigenicitet blev beregnet ved følgende formel: NSP

min /SP

min, hvor NSP

min er den minimale antal NSP celler nødvendige for at generere en tumor og SP

min er minimums antal SP celler nødvendige for at generere en tumor. Endelig blev tumorer også spaltet at gøre enkelt-cellesuspension for SP fornyet analyse af Hoechst33342 farvestof efflux assay som beskrevet ovenfor.

Når h-PCCL-inducerede tumorer nåede et volumen på ca. 200 mm

3, én gruppe af mus modtog gemcitabin (200 mg /kg legemsvægt ip, 1 injektion hver 3 dage, 6 injektioner i alt) og den anden gruppe (der bærer de tilsvarende tumorer) blev injiceret med vehikel (0,9% NaCl; kontrolgruppe ). Tumor diameter blev målt hver 3. dag efter den første injektion. Gemcitabin blev anset effektiv, når tumor volumen faldt med mindst 50%. Tre dage efter den sidste injektion blev musene aflivet og tumorer analyseret for at bestemme andelen af ​​SP-celler som beskrevet ovenfor.

RNA-ekstraktion og real-time PCR-analyse

Sorterede celler og dyrkede celler var behandlet med TRIzol reagens (Invitrogen China Limited, Shanghai) og blandes grundigt med pipettering. De TRIzol-lysater blev derefter blandet med chloroform og centrifugeret ved 15.000 x g i 15 minutter. Efter centrifugering blev total RNA opnået ved isopropanolfældning ifølge producentens anvisninger.

Single Strand cDNA blev revers transkriberet fra totalt RNA under anvendelse af tilfældige primer under standardbetingelser med højkapacitets cDNA revers transkription kit (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA). Kvantitativ realtids-PCR med total cDNA blev udført med SYBR Green Master Mix Real-Time Core reagenser på en ABI 7500 (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. Amplifikationerne blev udført ved 95 ° C i 10 sek efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 30 s. For at kvantificere den relative ekspression af hvert gen, Ct (tærskelcyklus) værdier blev normaliseret for endogen reference (

ACt = Ct målret- Ct β-actin) og sammenlignet med en kalibrator, ved hjælp af “

ΔΔCt metoden “(

ΔΔCt =

ACt

prøve –

ACt

kalibrator). Brug af

ΔΔCt værdi blev relative udtryk beregnet (

2-ΔΔCt). Da

ACt metode er kun anvendelig, når amplifikationseffektiviteter af målet og referencen er i det væsentlige ens, vi bestemt de effektivitetsgevinster for 5 fortyndinger og delta Ct-værdier (Ct

target-Ct

β- actin) blev plottet mod udvanding (log). Hældningen af ​​den monterede linje blev derefter bestemt. Alle prøver blev testet tredobbelt, og middelværdierne blev anvendt til kvantificering.

Western blot-analyse

Membran og cytosoliske proteinprøver blev ekstraheret fra SP og NSP-celler fra alle tre H-PCCLs. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved proteinindholdet blev bestemt ved BCA Protein Assay Kit anvendelse af bovint serumalbumin som standard (Pierce, USA). Lige mængder af proteinprøver (~ 50 ug) blev fraktioneret ved SDS-PAGE (12% polyacrylamidgeler) og elektroforetisk overført til PVDF-membran (Millipore, Bedford, MA) under anvendelse af en Mini Trans-blot (Bio-Rad Laboratories, Shanghai). Protein- prøver (membran prøve til ABCG2 og CD133, cytosoliske prøve til ALDH1, Oct4, Sox2 og Nanog) blev inkuberet med primære antistoffer i 1: 200 ved 4 ° C natten over. Affinity rensede kanin polyklonale anti-ABCG2 (Shanghai Ruiqi Biotechnology Co LTD), kanin polyklonale anti-CD133 (Shanghai Xiangsheng Biotech Co. LTD), kanin polyklonale anti-Oct4 (Cell Signaling Shanghai), kanin polyklonale anti-Sox2 (Shanghai ExCell Bio Co. LTD) blev kanin-polyklonalt anti-ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA), og kanin polyklonalt anti-Nanog (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA) anvendt som primære antistoffer. Næste dag blev membranen inkuberet med sekundære antistoffer (Molecular Probes) fortyndet i PBS i 2 timer ved stuetemperatur. Endelig blev membranen skyllet med PBS før scanning ved hjælp af infrarøde Imaging System (LI-COR Biosciences). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol for lige indgang af proteinprøver, ved anvendelse af anti-GAPDH-antistof. Western blot bånd blev kvantificeret ved hjælp QuantityOne software ved at måle båndet intensitet (Area × OD) for hver gruppe og normalisering til GAPDH. De endelige resultater er udtrykt som fold ændringer ved at normalisere data til kontrolværdierne.

Udarbejdelse af komplekse lokkedue oligodeoxynukleotid (cdODN)

Vi har designet en cdODN bærer konsensus sekvenser for fire transkriptionsfaktorer Sox2, Oct4, og c-myc, efter det princip, som Gao et al. [18]. Single-strengede phosphorthioat oligodeoxynukleotider blev syntetiseret af IDT inkorporering (Coralville, IA). ODN’erne blev vasket i 70% ethanol, tørret og opløst i steriliseret Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris + 1 mM EDTA). Supernatanten blev renset ved hjælp af Micro Bio-spin30 søjler (BioRad, Shanghai) og kvantificeret ved spektrofotometri. De dobbeltstrengede dODNs blev derefter fremstillet ved annealing komplementære enkeltstrengede oligodeoxynukleotider ved opvarmning til 95

oC i 10 minutter efterfulgt af afkøling til stuetemperatur (RT) langsomt over 2 timer. For nemheds skyld, vi har udpeget denne cdODN-SOC. En negativ kontrol fragment (NC-cdODN), der bærer basepar udskiftning blev også syntetiseret.

Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

EMSA blev udført ifølge fremgangsmåderne beskrevet i Gao et al. [18]. Kort fortalt blev cdODN-SOC eller NC-ODN mærket med [γ-

32P] ATP. Prøven blev derefter fyldt i G-25-søjle og centrifugeret ved 7000

g

i 2 min. De rekombinante humane proteiner Sox2, Oct4 og c-myc var (Santa Cruz Biotechnology) blev inkuberet separat cdODN-SOC eller NC-ODN ved stuetemperatur i 15 minutter i 10 pi H

2O og 8 pi Master mix (12 × ) indeholdende 1 M Tris-HCI, pH 7,5, 0,5 M EDTA, 5 M NaCl, 1 M dithiothreitol, 50% glycerol, 100 pg /pl bovint serumalbumin og 1 pg /pl poly (dIdC). For supershift eksperimenter blev antistoffer (1 ug) inkluderet i reaktionen. For konkurrencemæssige eksperimenter blev umærket cdODN-SOC i 100-fold overskud af de mærkede dODNs tilføjet i de bindende reaktioner. DNA-proteinkomplekser blev separeret ved ikke-denaturerende polyacrylamidgel (7,5% i 0,4 × Tris-borat /EDTA) elektroforese. Geler blev tørret og filmet.

Transfektion af cdODN-SOC i cellelinier

ordnet SP eller NSP celler blev transficeret med cdODN-SOC hjælp Lipofectamine 2000 (Invitrogen China Limited, Shanghai). Cellerne blev podet i 96-brønds vævskulturplader. Ved 50% konfluens blev cellerne vasket med serumfrit medium gang og derefter inkuberet med 50 pi frisk føtalt bovint serum (FBS) -fri medium. Decoy ODN’er af varierende koncentrationer og lipofectamin (0,25 pi) blev separat blandet med 25 pi Opti-MEM® Jeg Reduceret Serum Medium (Invitrogen China Limited, Shanghai) i 5 min. Så de to blandinger blev kombineret og inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Den lipofectamin: cdODN blanding blev tilsat dråbevis til cellerne og inkuberet ved 37 ° C i 5 timer. Efterfølgende blev 25 pi frisk medium indeholdende 30% FBS tilsat til brønden, og cellerne blev opretholdt i kulturen indtil anvendelse.

Indgivelse af cdODN-SOC til BALB /c nøgne mus Salg

Når tumorstørrelsen nåede ~ 200 mm

3 (ca. 7 dage efter inokulering), cdODN-SOC blev administreret dagligt af en enkelt intratumoral injektion (20 pi 100 nM cdODN-SOC blandet med Lipofectamine 2000). Tumorvækst blev overvåget regelmæssigt, og volumen (V) af tumorer på dag 5 efter cdODN-SOC behandling blev beregnet ved hjælp af formlen V = 1/2 x længde x (bredde)

2.

Data analyse

data er præsenteret som gennemsnit ± SEM for alle eksperimentelle data. Gruppe sammenligninger blev udført under anvendelse af envejs ANOVA. Post hoc-analyser af væsentlige vigtigste virkninger yderligere blev undersøgt ved hjælp af Fishers PLSD tests. En to-tailed

P

0,05 værdi blev taget for at indikere en statistisk signifikant forskel mellem to grupper. Statistiske analyser blev udført med SPSS 11.5 og kurve-fitting blev udført i Graphpad Prism software.

Resultater

Karakteristik af humane bugspytkirtelkræft cellelinier i kultur

I normal ilt kultur medium, de menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinjer (h-PCCLs) PANC-1, SW1990, og BxPc-3 alle demonstreret klare celle grænser, rig cytoplasma, tydelig kerne, og synlig nucleoli, mange igangværende delende celler med selv cellemorfologi hovedsageligt i epitel-lignende polygonal form og sjældent i spindlen form under et omvendt mikroskop (figur 1A). Under hypoxiske dyrkningsbetingelser dog cellegrænser blev uklar og cellestørrelse blev større, men med skrumpet cytoplasma, forstørret kerne, og fuzzy kernelegeme med mindre delende celler og mere spindelformede celler.

(A) Repræsentative mikrofotografier af Panc-1 og BxPc-3-celler 72 timer efter podning. (B) (C) Vækstkurver for PANC-1 og BxPc-3-celler. Symboler er forsøgsdata og kurver repræsenterer de bedste passer til eksponentiel vækst ligning: Y = Y0 × exp (k × X), hvor Y0 er Y-værdien, når X (tid) er nul, og K er hastighedskonstanten. τ er tidskonstanten (dag) og DT (fordobling-tid) er i tidsenheder i X-aksen, beregnet som ln

2 /K.

Vækst af PANC-1 og BxPc-3-celler blev vurderet. Med indledende lige seeding tæthed, viste disse celler tilsvarende vækstrater under normoxiske betingelser. Tre dage efter podning af cellerne trådte den logaritmiske vækstfase og dannede en vækst zone, som gradvist udvidede sig radialt. Cellerne havde ensartet morfologi og velordnet Aligned (figur 1B). Til sammenligning under hypoxiske dyrkningsbetingelser, cellevæksten blev væsentligt bremset med ingen tilsyneladende logaritmisk vækstfase (figur 1C). Cellerne blev disarranged og celler i vækst zone viste heterogen morfologi.

Identifikation af SP celler mod humane kræft i bugspytkirtlen cellelinjer og effekter af cdODN-SOC

Ifølge vores Hoechst33342-FACS-analyse, den h-PCCLs PANC-1, SW1990, og BxPc-3 alle indeholdt en lille subpopulation af SP-celler med andele af 8,7 ± 0,8, 4,6 ± 0,6, og 2,2 ± 0,4% (figur 2A, B). SP fraktionen i cellelinier blev væsentligt formindsket i nærvær af verapamil.

(A) Eksempler på flage cytometri analyse af SP-celler i nærvær eller fravær af 30 uM verapamil, cdODN-SOC (en kompleks attrap oligodeoxynukleotid transporterer

cis

-elementer for Sox2, Oct4 og c-myc) eller NC-ODN (negativ kontrol cdODN). (B) SP proportioner som procent af den samlede befolkning. ***

s

0,001

vs

Kontrol; n = 4.

For at udnytte, om SP celler kunne konverteres til NSP ved at målrette de centrale molekyler bestemmer stemness af CSCS testede vi virkningerne af en kompleks lokkefugle oligodeoxynucleotider fragment (cdODN) på SP celler. Den komplekse lokkedue oligodeoxynukleotid (cdODN-SOC) designet til denne undersøgelse indeholdt den typiske

cis

virkende elementer til Sox2, Oct4, og c-myc. Slående, efter forbehandlet med cdODN-SOC i 48 timer blev SP-celler næsten forsvandt i alle tre H-PCCLs, med 0,05 ± 0,03, 0,03 ± 0,1 og 0,03 ± 0,2% for PANC-1, SW1990, og BxPc-3, henholdsvis (figur 2A, B). Som en negativ kontrol, havde NC-cdODN ikke signifikant ændrer SP fraktioner i disse cellelinier.

Sekvensen af ​​dette cdODN-SOC er vist i figur 3A og evnen hos denne cd-ODN-SOC at binde Sox2, Oct4 og c-myc-proteiner blev verificeret ved vores EMSA sammenholdt med supershift anvendelse af antistoffer rettet mod disse transkriptionsfaktorer. Som afbildet i figur 3B, de forskudte bånd indikerer cdODN-proteinbinding og supersfift anførte bånd det specifikke cdODN-proteinbinding.

(A) Sekvenserne af cdODN-SOC transporterer

cis

-elementer for Sox2, Oct4 og c-myc og den negative kontrol ODN med nukleotid- udskiftninger (NC-ODN). (B) Eksempler på EMSA billeder, der viser evnen hos cdODN-SOC til at binde humant rekombinant Sox2, Oct4 eller c-myc-protein. SHIFT bands angiver positionerne af DNA-protein-komplekser og supershift bands angiver specifikke DNA-proteinbinding samlet op af den respektive antistof. Lane etiketter: 1, kontrol med nogen proteiner; 2: i nærværelse af koldt eller umærket cdODN-SOC; 3: i overværelse af cdODN-SOC; 4: i nærvær af NC-ODN; og 5:. med antistof

Differential genekspression mellem SP og NSP celler

Vi næste sammenlignet udtryk for stamcelle markører CD133 og ALDH1 (aldehyd dehydrogenase-1) [19, 20], pluripotensbestemmende opretholde faktorer Nanog, Sox2 og Oct4, onkogen transkriptionsfaktor c-myc, signalmolekyle Notch1, og lægemiddelresistente gen ABCG2 [21,22] i sorteret SP og ikke-SP (NSP) celler ved QRT-PCR for transcript niveau og Western blot på proteinniveauet. Som illustreret i figur 4, SP celler fra PANC-1 udtrykt væsentligt mere rigelige udskrifter af disse gener i forhold til NSP celler med tydelig angivelse af stængel-celle karakteristika SP celler. Resultaterne fra Western blot-analyse stemte overens med ændringerne i mRNA-niveauer (figur 4B). SP celler fra andre to h-PCCLs viste kvantitativt de samme resultater (Figur S1 og Figur S2 online).

(A) Ekspression af CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-myc, og Notch1 på mRNA-niveauet, bestemt ved real-time RT-PCR. Værdierne blev opnået ved først normaliseret til GAPDH til intern kontrol og derefter præsenteret som et forhold mellem SP i NSP. **

s

0,01 SP

vs

NSP; ***

s

0.001 SP

vs

NSP; n = 4. (B) Ekspression af CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-Myc, og Notch1 på proteinniveauet, bestemt ved Western blot analyse. Værdierne blev opnået ved først normaliseret til GAPDH til intern kontrol og derefter præsenteret som et forhold mellem SP i NSP. CD133: 120 kDa; ALDH1: 55 kDa; ABCG2: 72 kDa; Sox2: 40 kDa; Oct4: 45 kDa; Nanog: 35 kDa; c-Myc: 62 kDa; Notch1: 300 kDa.