PLoS ONE: Mutationer i menneskelige nøgne neglebånd Homolog NKD1 Fundet i kolorektal cancer Alter Wnt /Dvl /β-Catenin Signaling

Abstrakt

Baggrund

Mutation af Wnt signal antagonister APC eller Axin aktiverer β-catenin signalering i mange kræftformer, herunder hovedparten af ​​humane kolorektale adenokarcinomer. Fænotypen af ​​

apc

eller

Axin

mutation i frugt flyve

Drosophila melanogaster

er slående lighed med, der forårsages af mutation i segmentet-polaritet gen,

nøgen neglebånd (nkd)

. NKD inhiberer Wnt signalering ved binding til Dishevelled (Dsh /Dvl) familien af ​​scaffold-proteiner der linker Wnt receptoraktivering til p-catenin ophobning og TCF-afhængig transskription, men human

NKD

gener er endnu ikke direkte impliceret i kræft

Metode /vigtigste resultater

Vi identificerer for første gang mutationer i

NKD1

-. en af ​​to menneskelige

nkd

homologer – i en delmængde af DNA mismatch reparation-mangelfuld kolorektale tumorer, der ikke er kendt for at havnen mutationer i andre Wnt-pathway gener. De mutante Nkd1 proteiner er defekte på inhibering Wnt signalering; desuden de mutant Nkd1 proteiner stabilisere β-catenin og fremmer celledeling, dels på grund af en reduceret evne til hver mutant Nkd1 protein til at binde og destabilisere DVL proteiner.

Konklusioner /Betydning

Vores data hæve den hypotese, at specifikke

NKD1

mutationer fremme Wnt-afhængige tumorigenese i en delmængde af DNA mismatch-reparation-mangelfulde kolorektale adenokarcinomer og eventuelt andre Wnt-signal drevet humane kræftformer

Henvisning.: Guo J, Cagatay T, Zhou G, Chan CC, Blythe S, Suyama K, et al. (2009) Mutationer i Human

nøgen neglebånd

Homolog

NKD1, fundet i kolorektal cancer Alter Wnt /Dvl /β-Catenin Signaling. PLoS ONE 4 (11): e7982. doi: 10,1371 /journal.pone.0007982

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: August 5, 2009; Accepteret: 19 oktober 2009. I Udgivet: November 24, 2009

Copyright: © 2009 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en American Cancer Society Institutional Research Grant (til KW); National Institutes of Health (R01-GM65404 at K.W .; R01-CA60117 til S.N.T.); og Mayo Clinic /Foundation (til W.L.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aktivering af “canonical” Wnt /β-catenin signalering i næsten alle menneskelige kolorektale adenokarcinomer (CRC) gør Wnt pathway en lovende endnu uudnyttet terapeutisk target [1]. Den fremherskende paradigme for kanonisk Wnt signalering blev udledt dels gennem elegante udviklingsmæssige undersøgelser af frugt flyve

Drosophila melanogaster

og padder

Xenopus laevis

: Fravær Wnt-signal, en “ødelæggelse kompleks” komponeret af proteinerne Apc, Axin, GSK3p, og CK1 phosphorylerer β-catenin, hvilket fører til p-catenin ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning [2]. Binding af Wnt ligander til Frizzled /LRP co- receptorer aktiverer stilladset protein Dishevelled (Dsh, Dvl1, Dvl2, Dvl3 i pattedyr), hvilket fører til beslaglæggelse og nedbrydning af Axin, som giver mulighed for β-catenin at akkumulere, indtaste kernen, og binder TCF transskription faktorer til regulering målgener [2].

Et flertal (60-85%) af humant CRC exhibit aktiverede kanonisk Wnt signalering grund trunkering mutationer i

APC

at stabilisere β-catenin [3 ]. Alternativt mutationer i β-catenin

(CTNNB1) Hoteller, som blok phosphorylering og nedbrydning findes i nogle CRC, der mangler

APC

mutation [4]. CRC’er display mindst to typer af genomisk instabilitet: kromosomal instabilitet (CIN) i forbindelse med mutant Apc og p53 og giver anledning til aneuploidi, og mikrosatellit-instabilitet (MSI) forårsaget af defekt DNA mismatch repair (MMR) og resulterer i mutationer i simpel sekvens repeats (SSR) i hele genomet [5], [6]. Mutation af SSR’er i de kodende eller splejse junction regioner af vigtige regulerende gener kan skabe punkt mutant eller trunkerede proteiner, der fremmer kræft progression; ja, MMR-mangel og MSI er karakteristiske for tumorer hos patienter med HNPCC syndrom {HNPCC; alias Lynch syndrom (OMIM 120.435)} og 13-17% af sporadisk CRC [7].

APC

mutationer er fremherskende i CIN-CRC [3], men Wnt pathway genmutation spektrum i MSI-CRC er mindre godt karakteriseret, med mutationer i Axin homolog

AXIN2

og TCF -family transskription faktor

TCF7L2

identificeret i -25% og ~35% af MSI-CRC henholdsvis [8], [9].

APC

mutation er mindre hyppige i MSI-CRC end i CIN-CRC [10], [11], mens aktiverende mutationer i

CTNNB1

, selvom udbredt i hele spektret af human cancer, er sjældne i MSI-CRC [11]. Disse data antyder, at yderligere mekanismer aktivere Wnt /β-catenin signalering i MSI-CRC

Naked kutikula (NKD) proteinfamilie dæmper kanoniske Wnt signalering ved binding og muligvis destabiliserende DSH /DVL proteiner [12] -. [ ,,,0],17].

Drosophila NKD

mutanter udvikler dødelige segmentering defekter meget ligner dem, der ses i

apc

eller

Axin

mutanter [12], [18], [19] (Fig. 1A ). Vi hypotese derfor, at ændring af

nkd

gen aktivitet i pattedyr kan aktivere Wnt signalering og forårsage kræft. Her identificerer vi nye mutationer i den menneskelige

NKD1

gen i MSI-CRC, der ændrer Wnt signalering og reducere NKD /DSH interaktioner. Vores data tyder på, at specifikke

NKD1

mutationer ændrer Wnt /β-catenin signalering i et mindretal af MSI-CRC samt eventuelt i andre β-catenin signal tumorer, hvor mutationer i de kendte Wnt regulatorer er sjældne .

(A) Wild-type,

Axin, apc

, og

NKD Drosophila

neglebånd. Vild typen skiftevis denticle bånd (pil) og nøgen neglebånd (pilespids), med hver mutant mangler denticle bands. (B)

NKD1

locus har 10 exons. Nkd1 skematisk (orange) indbefatter N-terminale myristoylering, EFX, 30aa (blå), og carboxy-terminale His-rige motiver. Exon 10 sekvenser rundt poly- (C) skrifter (rød) over native (sort) og mutante (blå) rester er vist. (C)

NKD1

elektroferogrammer viser vildtype (WT) poly- (C)

7, cellelinie TC7 med C-deletion (C6), cellelinie RKO med C-insertion (C8), og cellelinie HCT15 med G En mutation (pil) 3 ‘poly (C)

7. (D, E) α-Nkd1 blots af hele celleekstrakter (D) og Triton X-100 opløselige og uopløselige fraktioner (E) fra cellelinier med indikeret

NKD1

mutation. Pile udpege Nkd1 proteiner. β-actin indlæser kontrol i D. CCD841 har fuld længde Nkd1, med en mindre nedbrydningsprodukt ved ~35 kDa også set med transficeret

NKD1

(f.eks fig. 1E, 5C), hvorimod SW480 med mere rigelig, men vildtype Nkd1 har flere nedbrydningsprodukter.

Resultater

NKD1

mutationer i kolorektal adenocarcinom

Vi identificerede tre forskellige

NKD1

exon 10 kodende region mutationer i 5/11 CRC cellelinier og 2/40 sporadiske CRC tumorer med MSI (tabel 1), men ingen

NKD1

kodende region eller splejsningsforbindelsen mutationer i 5/5 CRC celle linjer og 50/50 tumorer uden MSI. To mutationer, enten en deoxycytidin (C) deletion eller insertion grund polymerase glidning inden for en exon-10 poly- (C)

7 tarmkanalen, resultere i syntesen af ​​trunkerede proteiner af 345 eller 298 aminosyrer (aa) (fig . 1B, C). A (C)

7-tilstødende missense mutation (G A) konverterer Arg-288, bevaret i Nkd2, at hans (Fig 1B, C.).

NKD1

mutationer blev ikke påvist i 32/40 MSI-CRC tumorer, der huser mutationer i andre Wnt-pathway-gener, herunder

APC

,

CTNNB1

,

AXIN2

og

TCF7L2

, men blev fundet i 2 af de resterende 8/40 tumorer uden læsioner i disse kendte Wnt-pathway-gener (p = 0,036, en-halet Fishers eksakte test) (tabel 1; se Materialer og metoder). Disse data indikerer en gensidig eksklusivitet blandt mutationer i

NKD1

andre Wnt-pathway gener i vores kohorte af MSI-CRC tumorprøver, hvilket tyder på, at

NKD1

mutationer er af patologisk betydning.

Både colon epitelcelle linje CCD841 og CRC-cellelinje SW480, sidstnævnte med en C T mutation i

APC

codon # 1338 [20], indkode en vildtype Nkd1 (470 aa), 53,2 kDa, der migrerer ved -50 kDa på Western blot (fig. 1D, E). Cellelinier Co115 og TC7, hver med (C)

6 mutation, har en ~39 kDa bånd, der svarer til 38,1 kDa Nkd1

C6, mens cellelinie RKO, med (C)

8 mutation, har en ~33 kDa bånd, der svarer til 33,4 kDa Nkd1

C8; alle tre cellelinier med afkortet Nkd1 har også mindre rigelige fuld længde Nkd1, hvilket antyder, at vildtype

NKD1

locus ikke undergår tab af heterozygoti (fig. 1D). Ved western blot med Nkd1 antistoffer kan vi ikke skelne mellem vildtype fra mutant Nkd1 i cellelinje HCT15, hvilke havne

NKD1

R288H

(fig. 1D).

NKD proteiner er membran-associeret, pattedyr Nkds i kraft af N-terminal myristoylering [14], [21], [22]. De trunkerede Nkd1 proteiner har en reduceret affinitet for membraner sammenlignet med fuld-længde Nkd1 som udledes af Triton X-100 opløselighed: 95% af NKD

C6 eller NKD

C8 fra mutante cellelinier er TX-100 opløselig, hvorimod 0-26% af fuld længde Nkd1 fra alle cellelinjer er TX-100 opløselig (fig. 1E).

Mutant Nkd1 proteiner er defekte på at hæmme Wnt /Dvl signalering

mus Nkd1 kan hæmme akse dobbeltarbejde induceret af ektopisk Wnt signalering i

Xenopus

embryoner [16]. Som vist i fig. 2A, 90% af

Xenopus

embryoner injiceret med

XWnt8

mRNA udviklet delvis-til-komplet akse dobbeltarbejde; overensstemmelse med Nkd1 aktivitet som en Wnt antagonist, vild type human

NKD1

mRNA co-injektion reducerede akse dobbeltarbejde frekvens til 42%, med kun 3% gennemført gentagelser. I modsætning hertil co-injektion af hver mutant menneske

NKD1

resulterede i akse dobbeltarbejde frekvenser svarende til den observeret med

XWnt8

injektion alene (Fig. 2A). Som i cellelinier, fejl-udtrykt Nkd1

C6 og Nkd1

C8 var mere rigelig end vildtype Nkd1 eller Nkd1

R288H ved Western blot (ikke vist). Efter aftale med

Xenopus

resultater, vildtype Nkd1, men ingen af ​​de tre mutanter, undertrykte Dvl-induceret aktivering af TCF-reporter TOPflash i HEK-293 celler (Fig. 2B). Ekspression af mutant Nkd1 alene let øget basal TOPflash aktivitet og havde ingen effekt på endogene

Xenopus

akse dannelse (ikke vist), hvilket indikerer, at effekten af ​​Nkd1, ligesom

nkd

i fluen afhænger Wnt signalering [23].

(A)%

Xenopus

fostre med angivne akse fænotype efter injektion af

XWnt8

+/- vildtype eller mutant

NKD1

. (N) = # embryoner injiceret. Paneler på højre viser repræsentative lateral (L) og dorsal (D) synspunkter embryoner scoret som enkelt akse (hvid), kort A /P-aksen (lysegrå), delvis akse dobbeltarbejde (mørkegrå), og fuld akse dobbeltarbejde (sort) ifølge de materialer og metoder. I embryoner med enkelt akse i venstre paneler, note trunk (hvid pil) og cement kirtel (sort pil). Pilespidser udpeger hver akse i embryoner med akse gentagelser (højre paneler). Embryoner med delvis akse dobbeltarbejde har duplikeret trunk væv, men en enkelt cement kirtel, mens fostre med fuld akse dobbeltarbejde har duplikeret trunk væv og cement kirtler. (B) Normalized TOPflash luciferaseaktivitet (RLU) i HEK-293 celler transficeret med reporter +/- Dvl2 +/- angivet Nkd1 konstruere.

NKD1

mutationer stabilisere β-catenin og fremme celledeling

i overensstemmelse med

NKD1

mutationer aktiverer Wnt signalering i CRC, cytoplasmatiske og nukleare niveauer af β-catenin er højere i Co115 celler end i CCD841 celler (fig. 3A). Følgelig nuklear β-catenin var fremtrædende i Co115 celler, men ikke i CCD841 celler (fig. 3B, C). HEK-293T-celler transficeret med Nkd1

C6, Nkd1

C8 eller Nkd1

R288H havde højere niveauer af cytosolisk β-catenin end celler transficeret med vildtype-Nkd1 eller en kontrol (fig. 3D), hvilket indikerer at hver mutant Nkd1 protein kan stabilisere β-catenin.

(A) Western blot af cytosoliske og nukleare ekstrakter af celler med vildtype (CCD841) eller mutant (Co115)

NKD1

. GAPDH og HDAC2 blev undersøgt som lastning kontrol. (B-B “, C-C”) β-catenin (rød) og DNA (blå) fordeling i CCD841 celler (B-B “) og Co115 (C-C”) celler. Pilene kerner. Flettede billeder i B “og C”. (D) Western blot af cytosoliske ekstrakter af HEK-293-celler transficeret med

lacZ

kontrol (-), vildtype Nkd1 (WT), eller angivet mutant Nkd1 konstruere og probet for β-catenin, Nkd1, og lastning kontrol GAPDH. Bemærk, at hver mutant Nkd1 men ikke vildtype Nkd1 øger β-catenin-niveauer. (E) Relativ celleantal som en funktion af dage efter retroviral infektion af CCD841 celler med tom vektor kontrol, vildtype Nkd1, eller angivet Nkd1 mutant (p = 0,016, 0,012, og 0,0091 for C6, C8, og R288H mutanter i sammenligning med kontrol) (F) Relativ celleantal som en funktion af dage efter retroviral infektion af Co115 celler med kontrol eller vildtype Nkd1 (p = 0,022). α-Nkd1 western blots af celleekstrakter med GAPDH eller β-actin lastning kontrol, er vist nedenfor hver parcel i E og F.

Da kanoniske Wnt signalering fremmer celledeling [2], vi analyseret akkumulering af celler ensartet udtrykker sammenlignelige niveauer af enten vildtype eller mutant Nkd1. Retroviral ekspression af hver mutant Nkd1 protein i CCD841 celler forøget celletal sammenlignet med vildtype Nkd1 eller tom vektor kontrol (fig. 3E). Omvendt ekspression af vildtype Nkd1 i Co115 celler reducerede celleantal (fig. 3F). Disse data viser, at

NKD1

mutationer kan fremme stabilisering β-catenin og colon celleproliferation.

Altered subcellulære lokalisering og Dvl colokalisering af afkortet Nkd1

Vi kunne ikke påvise endogen Nkd1 i cellelinier ved immuncytokemi, så for yderligere at undersøge forholdet mellem Nkd1 lokalisering og aktivitet undersøgte vi lokalisering af mærkede proteiner i HEK-293-celler. Nkd1 lokaliserer i en punktformet, overvejende cytoplasmatisk fordeling svarende til

Drosophila

NKD

GFP når de udtrykkes i flue spytkirtel (fig. 4A, F). I modsætning hertil Nkd1

C6 og Nkd1

C8 distribuere diffust i cytoplasma (fig. 4B og ikke vist), i overensstemmelse med deres forbedrede rengøringsmiddel opløselighed i forhold til Nkd1 (fig. 1E), mens Nkd1

R288H aggregater som vildtype Nkd1 (ikke vist).

(A, B) HEK-293 celler, der udtrykker HA /Flag-tagget Nkd1 (A) eller Nkd1

C8 (B) farvet med α-HA (grøn ). Nkd1 akkumuleres i puncta (pile), medens Nkd1

C8 er fordelt diffust i cytoplasmaet. Nkd1

C6 fordelt i et mønster, der svarer til Nkd1

C8 (ikke vist). (C, D) Celler co-udtrykkende Dvl3 og vildtype (C) eller C8 (D) Nkd1

GFP konstruktioner. Nkd1-GFP (grøn, C) viser næsten fuldstændig colokalisering (pile) med Dvl3 (rød, C ‘), mens Nkd1

C8-GFP (D) akkumuleres i cytoplasmatiske aggregater omgivet af Dvl3 (pile). Flettede billeder er i C “, D”, DNA er blå i A-D. Lignende resultater blev observeret i celler med coekspression Nkd1

C8-GFP og Dvl1 eller Dvl2, og i celler, der udtrykker Nkd1

C6-GFP og Dvl1, Dvl2 eller Dvl3 (ikke vist). (E) spytkirtel fra vildtype tredje stadie

Drosophila

larve farvet med α-Dsh (rød) viser diffus og punktformig farvning. (F-F “)

A8-Gal4 /UAS-NKD

GFP

spytkirtel farvet med α-Dsh og filmede for GFP (F) og Dsh (F« fusionerede i F “). Fly NKD

GFP relocalizes Dsh at perinukleære aggregater (pile) svarende til dem observeret med Nkd1

GFP /Dvl3 i C.

DVL proteiner lokalisere til dynamisk, cytoplasmatisk og plasmamembran-associeret aggregater, der er blevet foreslået til amplifikation Wnt /β-catenin signalering [24]. I overensstemmelse med

in vitro

NKD /Dsh forening, udtryk for Nkd1

GFP i HEK-293 celler eller flyve NKD

GFP i spytkirtlen gav anledning til intracellulære aggregater med colocalized NKD og Dsh /Dvl ( fig. 4C-C “, F-F”, og ikke vist). I modsætning hertil hver Dvl co-syntetiseret med hver afkortet Nkd1

GFP (C6 eller C8) dannede aggregater, men colokalisering blev i stedet observeret ved samlede grænseflader, med DVL aggregater typisk omgiver trunkerede Nkd1 aggregater (fig. 4D-D “og ikke vist). Selvom betydningen af ​​disse lokaliseringer vis-à-vis Wnt signalering er uklar, de trunkerede Nkd1 proteiner identificeret i CRC udstillet en reduceret evne til at colocalize med DVL proteiner i forhold til fuld-længde Nkd1.

Mutant Nkd1 proteiner er defekte på bindende DVL proteiner

Næste vi undersøgte den biokemiske mekanisme af mangelfuld Wnt signal hæmning af mutant Nkd1 proteiner. Den NKD EFX motiv binder den grundlæggende /PDZ region DSH /DVL proteiner [14]. Overraskende, hver Nkd1 mutant, trods en intakt EFX motiv, bundet hver Dvl protein mindre end vildtype Nkd1 af gær-to-hybrid (Y2H) assay (fig. 5A). Nkd1 trunkering ved (C)

7-tarmkanalen (Nkd1

1-286) også reduceret Dvl binding (fig. 5A), hvilket indikerer, at reduceret Dvl binding skyldtes ikke rammeskift-induceret unikke C-terminale ender i to trunkerede mutanter. Hver trunkeret Nkd1 protein bibeholder nær dets C-terminus en 30aa amfipatisk α-helix motiv, der er meget konserveret (28/30 aa) i Nkd2 [14]. In fly NKD, en tilsvarende placeret 30aa motiv er kritisk for funktionen og kernelokalisering [25], men den rolle, 30aa motiv i vertebrate NKD proteiner forbliver ukendt. Sletning af 30aa motiv i Nkd1

1-286 restaurerede Dvl binding, mens yderligere sletning af EFX motivet elimineret Dvl binding (fig. 5A). Disse data tyder på, at en funktion af hvirveldyr NKD 30aa motiv er at modsætte Nkd1-EFX /DVL interaktioner, som selv er tilsyneladende modstander af yderligere C-terminale sekvens, der slettes i vores MSI-CRC tumorer.

( A) Y2H mellem Nkd1-lokkemad og Dvl-bytte analyseret for vækst på tredobbelt frafald (3D + 3AT) eller dobbelt frafald (2D) medier. Bar grafer på rigtige show ONPG enheder fra kvantitativ Y2H assay. Western blot indikerer, at Nkd1 mutante proteiner er af sammenlignelig overflod (ikke vist). (B) GST-pulldown assay af

in vitro

oversat,

35 [S] -mærket Dvl1-3 med hver GST-Nkd1 protein. Søjlediagram er kvantitativ band intensitet. Coomassie-farvet gel viser hver GST-fusionsproteinet, med pilespidser angiver proteiner i fuld længde. (C) Western blots af Flag-IP’er fra HEK-293-celle ekstrakter med lige store mængder af hver HA /Flag-tagget Nkd1 og derefter probet med α-HA (øvre) og α-Dvl3 (midten). β-actin is loading kontrol (lavere). Bemærk, at mindre Dvl3 er IP’d af Nkd1

C6 eller Nkd1

C8 sammenlignet med fuld-længde Nkd1. Ingen co-IP blev observeret mellem vildtype eller mutant Nkd1s og Dvl1 eller Dvl2, der minder om den manglende stabile co-IP mellem

Drosophila

NKD og Dsh [13].

Vi bekræftede Y2H resultater efter GST-pulldown og co-immunpræcipitationseksperimenter. Som vist i fig. 5B, hver Dvl protein udstillet reduceret binding til GST-Nkd1

C6 og GST-Nkd1

C8 sammenlignet med vildtype-GST-Nkd1, mens GST-Nkd1

R288H viste reduceret foreninger med Dvl1 og Dvl2, men mindre så med Dvl3, svarende til den set af Y2H. Når udtrykt i HEK-293 celler, Nkd1

C6 og Nkd1

C8 akkumuleret til højere niveauer end Nkd1 og Nkd1

R288H (ikke vist); ved at normalisere input lysater således at ens mængder af vildtype Nkd1 og hver mutant Nkd1 protein blev immunpræcipiteret, observerede vi en to-gange reduktion i mængden af ​​Dvl3 co-immunpræcipiteret af Nkd1

C6 eller Nkd1

C8 sammenlignet til Nkd1 eller Nkd1

R288H (fig. 5C). Således

NKD1

mutationer reducerer Nkd1 /DVL foreninger

in vitro

in vivo

.

Mutant Nkd1s er defekte på at ændre DVL niveauer

Dvls kan ubiquitineret og nedbrudt af proteasomet, og bindingen af ​​NKD eller andre Dvl-bindende proteiner fører til Dvl omsætning [17], [26] – [28]. Den

NKD1

mutationer kunne derfor nedsætte evnen af ​​Nkd1 at destabilisere Dvls. Ved at udtrykke

Drosophila

NKD

GFP på forskellige niveauer i tilstødende celler i tredje stadie

Drosophila

spytkirtel, vi konsekvent observeret et omvendt forhold mellem niveauer af NKD

GFP og dsh (fig. 6A-A “). Da

dsh

transskription vides ikke at blive reguleret i

Drosophila

er NKD

GFP sandsynligvis destabilisere Dsh, som observeret, når Nkd1 blev overudtrykt i dyrkede pattedyrceller [17]. Dernæst vi co-transficeret vildtype eller hver mutant Nkd1 med Dvl1, Dvl2 eller Dvl3 i HEK-293-celler og undersøgt niveauerne af hver Dvl protein ved western blot. Som vist i fig. 6B, Dvl1 og Dvl2, og i mindre grad Dvl3, var mindre rigelige ved samtidig ekspression med vildtype-Nkd1 end når det udtrykkes alene. Hverken tom-vektor eller co-udtrykkes GFP påvirket niveauerne af hver Dvl (ikke vist). I modsætning hertil mængden af ​​Dvl1 påviselig med co-ekspression af hver mutant Nkd1 svarede til Dvl1 kun transficeret kontrol (fig. 6B). Dvl2 niveauer blev delvist reduceret med hver mutant Nkd1, mens Dvl3 niveauer blev reduceret mindre ved coekspression af enten afkortet Nkd1 end vildtype Nkd1. Svarende til det omvendte forhold mellem NKD

GFP og DSH niveauer i

Drosophila

spytkirtel (fig. 6A-A “), fine punktformet Dvl1 immunreaktivitet i celler med høje niveauer af Nkd1

GFP optrådte reduceret sammenlignet med tilstødende celler med lavere niveauer af Nkd1

GFP (fig. 6C, C ‘). Tilsammen understøtter vores data den hypotese, at den specifikke ændring af Nkd1 evne til at fremme Dvl omsætning kan aktivere Wnt /β-catenin signalering under CRC tumor progression.

(A-A “)

71B-Gal4 /UAS-NKD

GFP

tredje stadie

Drosophila

spytkirtel farvet med α-Dsh og filmede for GFP (A) og Dsh (A ‘) distributioner (flettede billede i A “). Kvantificering af Dsh pixel intensitet (hvid boks i A ‘) afslører reduceret farvning i celle udtrykker mere (højre, grøn stjerne) NKD

GFP end i tilstødende celle udtrykker mindre NKD

GFP. (B) Western blots af HEK-293-celler transficeret med angivne Flag /HA-mærkede Nkd1 og Dvl1, Dvl2 eller Dvl3 konstruktioner probet med α-HA, α-Dvl1-3, og α-βtubulin som en loading kontrol. Hver af de Dvl1-3 blots blev indlæst med lige store mængder af ekstrakt, som bekræftet af sondering hver blot med α-βtubulin. (C) HEK-293-celler co-udtrykkende Nkd1

GFP og Dvl1, farvet med α-Dvl1, og afbildes for GFP (grønt), Dvl1 (rød), og DNA (blå) viser fine punktformig Dvl1 fordeling i celler, der udtrykker lav til fraværende Nkd1

GFP (hvid pil). I tilstødende celler, der udtrykker Nkd1

GFP er Dvl1 relocalized til Nkd1

GFP /Dvl1 aggregater (gul pil), med tab af fine punktformet Dvl1 farvning (pilespidser). (D, E) modeller af NKD funktion i

Drosophila

(D) og

NKD1

-mutant CRC (E). Dobbelt linjer: øverste = plasmamembran; lavere = kernemembranen. (D) Fly Wg (Wnt) binder Fz /pil (Lrp5 /6) receptorer, der hæmmer Apc /Axin /CK1 /GSK3p kompleks, der fremmer nedbrydning af Arm (β-catenin). Arm komplekser med Pan (TCF) for at aktivere målgener herunder

nkd

. NKD fremmer Dsh omsætning til delvist at inhibere signalering og anvender den nukleare faktor import Imp-α3 at trænge ind i kernen og yderligere inhiberer signalering gennem ukendte mekanismer [31]. (E) I

NKD1

-mutant CRC, mutant Nkd1 protein ikke længere binder og fremmer Dvl omsætning, stabiliserende β-catenin og aktivering TCF-afhængig transskription af målgener.

diskussion

Mutation af tumor suppressor

APC

hæver Wnt /β-catenin signalering i de fleste af de 1 million nye tilfælde af CRC diagnosticeret årligt på verdensplan [3], [29 ]. Vi antager, at mutationer i andre Wnt antagonister kan ophøje signalering i delmængde af CRC, især MSI-CRC, uden mutationer i kendte Wnt regulatorer. Vi rapporterer tre cancer-associeret menneske

NKD1

mutationer, der ændrer Wnt /β-catenin signalering og forstyrre Nkd1 /Dvl binding. Baseret på hyppigheden af ​​

NKD1

mutation (5%) identificeret i vores kohorte af MSI-CRC’er, vurderer vi, at

NKD1

mutationer forekommer i op til ~ 1% af nydiagnosticeret CRC, eller ~10,000 tilfælde om året.

Da MSI tumorer er tilbøjelige til mutation i hele genomet, opstår spørgsmålet om, hvorvidt

NKD1

mutationer drive tumor progression eller blot “tilskuer” mutationer. En National Cancer Institute workshop [30] foreslået fem kriterier for at skelne bona fide målgener fra bystander mutationer, herunder a) høj mutationsfrekvens, b) biallel inaktivering, c) en rolle i en vækst suppressor pathway, d) inaktivering af samme vækstsuppression pathway i tumorer uden MSI gennem mutation i det samme gen eller i et andet gen i den samme pathway, og e) funktionelle suppressor undersøgelser, selv om gyldigheden af ​​disse kriterier til evaluering sjældne eller nye driver mutationer er blevet sat spørgsmålstegn {f.eks [6]}. Vores arbejde tyder på, at

NKD1

mutationer opfylde fire af de fem kriterier – a, c, d, og e. Mens hyppigheden af ​​

NKD1

mutation var relativt lav sammenlignet med den for kendte Wnt pathway-gener, en gensidig eksklusivitet blandt mutationer i

NKD1

og andre Wnt pathway-gener var statistisk signifikant i tumorprøver. Fraværet af

NKD1

mutationer i vores stikprøve af tumorer uden MSI kunne skyldes den sjældne natur specifik Nkd1 trunkering i tumorer med intakt MMR, eller på grund af vores lille stikprøve. Men andre gener i Wnt signalvejen såsom

APC

ofte muteret, deleteret, eller methyleret i tumorer med intakt MMR. Biallel inaktivering af

NKD1

blev ikke observeret, men tilstedeværelsen af ​​vildtype Nkd1 i tumorcellelinjer, såvel som evnen af ​​mutant Nkd1 at stabilisere β-catenin, tyder på, at

NKD1

mutationer kan virke overvejende (se nedenfor). Endelig NKD familie af proteiner inhiberer kanoniske Wnt signalering, og denne aktivitet er defekt i alle tre mutante Nkd1 proteiner, hvilket antyder, at de Nkd1 mutationer ændrer Wnt /β-catenin signalering

in vivo

.

Vi viser endvidere, at NKD kan begrænse Dsh /Dvl overflod i både pattedyr celle kultur og flyve systemer, med flue NKD derudover have ukendte, men vigtige nukleare funktioner [25], [31] (fig. 6D). Vi foreslår, at de mutante humane Nkd1 proteiner, hver med en reduceret evne til at binde og begrænse overflod af Dvls, øge Wnt-afhængig Dvl aktivitet, hvorved svækkende β-catenin-nedbrydning og øge TCF-afhængig transskription af målgener, der fremmer proliferation (Fig . 6E). Men forhindrer direkte Nkd1 /Dvl forening er tilsyneladende utilstrækkelige til at fremme neoplasi, som sletning af Dvl-bindende

Nkd1

EFX motiv hverken gjort mutant mus modtagelige for kræft eller potenseret frekvensen af ​​

Apc

mutation-drevet tarm adenomer [32]. Tilsvarende mus, der bærer N-terminal beskærer

Nkd1

og /eller

Nkd2

mutationer ikke udviklede spontane tumorer [33]. Da NKD er en integreret feedback-sløjfer i fluer og hvirveldyr [12], [34], vi tidligere hypotese, at en manglende NKD aktivitet hos pattedyr kan kompenseres ved redundante feedback mekanismer, hvorimod der ikke en sådan erstatning i fluer er muligt da der ikke foreligger gener, der koder ekstracellulære Wnt signalering antagonister [33].

den ikke-tilfældige parring af uens

APC

mutationer i tumorer {f.eks protein trunkering nær mutationen klynge region (MCR) med allele sletning eller methylering}, kombineret med funktionelle studier af mutante aPC-proteiner [35], [36], har foreslået, at cellen skal bevare en vis evne til at regulere Wnt /β-catenin signalering under tumorudvikling – den såkaldte “lige højre” hypotese [ ,,,0],37]. En overvejelse af de kendte roller for Wnt /β-catenin signalering under kolorektal carcinom progression giver nogle rationale for denne hypotese: i tidlige stadier, øget signalering fremmer stamcelle fornyelse og ændrer migration af krypt epitelceller [38], mens senere det fungerer som en switch til at regulere epitelial at mesenkymale overgange under invasion og metastase [39]. Således kan tumor progression kræver forbigående op- eller nedregulering af target genekspression afhængig af mutations belastning og de lokale miljøforhold. Eftersom vildtype Nkd1 protein fortsætter i

NKD1

-mutant testede cellelinjer, vi hypotesen, at mutant Nkd1 proteiner – som hver især bevarer flere funktionelle motiver (N-terminal myristoylering, EFX, og 30 aa motiver ) – aktivere Wnt signalering

in vivo

, måske analog til den måde, hvorpå APC proteiner trunkeret nær MCR aktivere Wnt signalering [36]

trods den overvældende beviser for, at unormal Wnt /β-. catenin signalering forårsager kræft, rolle Dsh /DVL proteiner i neoplasi stadig uklar. Wnt signalering kan fremme Dsh /Dvl akkumulering [40], og Dvl overekspression kan efterligne aktiveringen af ​​Wnt /β-catenin signalering aksen [41], hvilket antyder, at Dvl hyperaktivitet, ligesom stabilisering β-catenin grund af mutation, kunne være en primær årsag af forhøjet Wnt signalering i kræft. Faktisk har Dvl amplifikation og overekspression blevet identificeret i neoplasi {f.eks lungecancer [42]}, men Dvl akkumulering i cancer kan også være en sekundær konsekvens af opponeret Wnt ligand-drevet autoaktivering af signalering [43]. I betragtning af de afgørende roller for Dsh /Dvls i “ikke-kanoniske” Wnt veje, der styrer plane-celle-polaritet og celle migration i hvirveldyr [44], kan

NKD1

mutationer også ændre Dvl aktivitet i ikke-kanonisk Wnt veje, der styrer cellepolaritet eller migration under cancer progression. Fremtidige forsøg vil fokusere på at forstå, hvordan de mutant Nkd1 proteiner ændrer Wnt signalering under kræft progression

in vivo

.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Dette undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board of Mayo Clinic hospitaler. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyse. Frog dyrehold, in vitro-befrugtning, og embryo kultur og iscenesættelse blev udført i overensstemmelse med standard protokoller, og alle dyr blev håndteret i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af American Association for Laboratory Animal Science, og

Xenopus

I fig.